Name: isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

इस काम को पैथोलॉजी और प्रयोगशाला चिकित्सा विभाग, सिनसिनाटी विश्वविद्यालय, कॉलेज ऑफ मेडिसिन, डॉ ओनुर कानिसिकक से वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था; राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (R01HL148598) से डॉ ओनूर कानिसिकक को अनुदान । डॉ ओनुर कानिसिकक को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन करियर डेवलपमेंट अवार्ड (18CDA34110117) का समर्थन है । डॉ परवेज आलम को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन पोस्टडॉक्टोरल ग्रांट (AHA_20POST35200267) का समर्थन है । डॉ मलीना जे Ivey एक NIH T32 अनुदान (एचएल 125204-06A1) द्वारा समर्थित है ।

सभी प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) द्वारा प्रकाशित । वीडियो में प्रदर्शित सभी प्रो?...

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	<li>van Amerongen, M. J., Engel, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+cardiomyocyte+proliferation+and+its+potential+for+cardiac+regeneration.">Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).</li><li>Parente, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+cardiac+injury+and+regeneration+in+zebrafish+adult+heart.">Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart.</a> PLoS One. 8, 53748 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+capacity+of+zebrafish+reverses+cardiac+failure+caused+by+genetic+cardiomyocyte+depletion.">The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion.</a> Development. 138, 3421-3430 (2011).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes.">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).</li><li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+function+in+mammalian+cardiac+myocytes.">T-tubule function in mammalian cardiac myocytes.</a> Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).</li><li>M&#252;ller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor.">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+ischemic+heart+disease:+novel+carriers+for+bioinformation.">Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).</li><li>Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cardiokines+in+Heart+Diseases:+Beneficial+or+Detrimental.">The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental.</a> BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).</li><li>Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+cardiomyocytes+in+culture+A+model+system+to+study+the+plasticity+of+the+differentiated+cardiac+phenotype+at+the+molecular+and+cellular+levels.">Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).</li><li>Alam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Senescence-Associated+Genes+Rb1+and+Meis2+in+Adult+Cardiomyocytes+Results+in+Cell+Cycle+Reentry+and+Cardiac+Repair+Post-Myocardial+Infarction.">Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-210-mediated+proliferation,+survival,+and+angiogenesis+promote+cardiac+repair+post+myocardial+infarction+in+rodents.">MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents.</a> Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).</li><li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+ascending:+perspectives+for+human-disease+models.">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Schl&#252;ter, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cultivation+of+Adult+Rat+Cardiomyocytes.">Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119, 909-920 (2016).</li><li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy.">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).</li><li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes.">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).</li><li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li><li>Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+specifically+inhibits+actin-myosin+interaction+in+mouse+cardiac+muscle.">Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Sellin, L. C., McArdle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+2,3-butanedione+monoxime.">Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.</a> Pharmacology &amp; Toxicology. 74, 305-313 (1994).</li></ol>

सेल-विशिष्ट मशीनी अध्ययन करने के लिए वयस्क कार्डियोमायोसाइट अलगाव और दीर्घकालिक संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। वयस्क मुख्यमंत्री अलगाव प्रोटोकॉल पर चर्चा ?...

हृदय रोग दुनिया भर में मौत के प्रमुख कारणों में से एक हैं। लगभग सभी प्रकार के हृदय की चोट के परिणामस्वरूप वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) का एक महत्वपूर्ण नुकसान होता है। वयस्क स्तनधारी हृदय वयस्क मुख्यमंत्री1की कामुक प्रकृति के कारण अपनी हृदय की चोट की मरम्मत करने में असमर्थ हैं । इस प्रकार, वयस्क स्तनधारी दिल के किसी भी अपमान के परिणामस्वरूप सीएम की स्थायी हानि होती है, जिससे हृदय कार्य और हृदय की विफलता कम हो जाता है। वयस्क स्तनधारियों के विपरीत, जेब्राफिश और न्यूट हार्ट्स जैसे छोटे जानवर मौजूदा सीएम प्रसार2,,3,4 के माध्यम से अपनी हृदय की चोट को पुनर्जीवित करसकते4हैं। एक विश्वव्यापी प्रयास दोनों प्रसारीय और गैर-प्रसारीय दृष्टिकोणों के माध्यम से हृदय की चोट के लिए एक उपन्यास चिकित्सीय हस्तक्षेप खोजने के लिए चल रहा है। पिछले दशकों में, हृदय की चोट और मरम्मत का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक माउस मॉडल विकसित किए गए हैं। हालांकि, वीवो पशु मॉडल में उपयोग करने के लिए अतिरिक्त जटिलता के साथ एक महंगा दृष्टिकोण के लिए माध्यमिक प्रभाव से एक सेल स्वायत्त तंत्र समझने के लिए जारी है । इसके अलावा, वीवो सिस्टम में सीएम से कार्डियोप्रोटेक्टिव सिग्नलिंग को प्रेरित करने वाले औषधीय हस्तक्षेप के सीएम विशिष्ट प्रभावों का विश्लेषण करना चुनौतीपूर्ण है।
इसके अलावा, सीएम प्रसार विश्लेषण करने के लिए वयस्क सीएम की दीर्घकालिक संस्कृति आवश्यक है। सीएम प्रसार परख कोशिकाओं को कोशिका चक्र में प्रेरित करने और उसके बाद सटीक डेटा प्राप्त करने के लिए न्यूनतम 4-5 दिनों की आवश्यकता होती है । इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन, दवा स्क्रीनिंग, विषाक्तता अध्ययन और सीए++ होमोस्टेसिस अध्ययन के लिए अलग-थलग पड़े सीएम का उपयोग करने वाले अध्ययनों को,बेहतर संस्कृति प्रणाली5,,6,7की आवश्यकता है। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि सीएमएस (कार्डियोकिन्स)8,,9से स्रावित साइटोकिन्स का कार्डियोप्रोटेक्टिव महत्व है। दिल की मरम्मत और उत्थान के दौरान इन कार्डियोकिन्स की चिकित्सीय भूमिका और आणविक तंत्र की जांच करने के लिए, एक लंबे समय तक संस्कृति की आवश्यकता होती है।
वयस्क चूहा सीएम एक इन विट्रो सिस्टम10, 11, 12में एकल कोशिका अलगाव औरदीर्घकालिक,12संस्कृति के लिए काफी मजबूत हैं।, हालांकि, वयस्क माउस सीएम इन विट्रो परख के लिए बहुत रुचि रखते हैं, विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल की उपलब्धता के कारण, जो चूहे सीएम13के साथ विभिन्न अभिनव विश्लेषणों के डिजाइन और निष्पादन की अनुमति देता है। वयस्क चूहा मुख्यमंत्री अलगाव के विपरीत, वयस्क माउस दिलों से एकल-कोशिका निलंबन प्राप्त करना काफी चुनौतीपूर्ण है, और संस्कृति में वयस्क माउस सीएम की दीर्घकालिक संस्कृति और भी चुनौतीपूर्ण है।
लंगेंडोर्फ प्रणाली का उपयोग करके माउस और चूहे के दिलों से वयस्क मुख्यमंत्री अलगाव पहले 5,14 ,15सीएम समारोह का अध्ययन करने के लिए,स्थापितकिया गया है ।14 यहां, हमने चूहों और चूहों दोनों से वयस्क सीएम अलगाव के लिए प्रोटोकॉल के साथ-साथ एक संशोधित दीर्घकालिक संस्कृति, ट्रांसफैक्शन और अलग-थलग कोशिकाओं के सीएम प्रसार के लिए प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन किया है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butane Dione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>B1387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-miR-67</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene weighing dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z154881-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>PSLAB-018285-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Mouse Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>24352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229865+5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siMeis2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s161030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRb1</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s128325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Blunt/SharpDissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Very Fine Precision Tip Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16-100-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8158-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3006S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes

वयस्क स्तनधारी कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) की पूर्व वीवो संस्कृति कार्डियक जीव विज्ञान के इन विट्रो अध्ययन के लिए सबसे प्रासंगिक प्रायोगिक प्रणाली प्रस्तुत करता है। वयस्क स्तनधारी सीएम न्यूनतम प्रसार क्षमता के साथ मरणासन्न विभेदित कोशिकाएं हैं। वयस्क सीएम के बाद मिटोटिक राज्य न केवल कार्डियोमायोसाइट सेल चक्र प्रगति को प्रतिबंधित करता है बल्कि सीएम की कुशल संस्कृति को भी सीमित करता है। इसके अलावा, वयस्क सीएम की दीर्घकालिक संस्कृति कई अध्ययनों के लिए आवश्यक है, जैसे सीएम प्रसार और जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण।
माउस और चूहा कार्डियोमायोसाइट अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले दो सबसे पसंदीदा प्रयोगशाला जानवर हैं। जबकि चूहे के केंद्रीयमों की दीर्घकालिक संस्कृति संभव है, वयस्क माउस सीएम मौत के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और सामान्य परिस्थितियों में पांच दिनों से अधिक सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है। इसलिए, वयस्क मुरीन सीएम के लिए सेल अलगाव और दीर्घकालिक संस्कृति प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। इस संशोधित प्रोटोकॉल के साथ, 20 से अधिक दिनों के लिए वयस्क माउस और चूहा सीएम दोनों को सफलतापूर्वक अलग और संस्कृति करना संभव है। इसके अलावा, पिछली रिपोर्टों की तुलना में अलग-थलग पड़े सीएम की सिरना ट्रांसफैक्शन दक्षता में काफी वृद्धि हुई है। वयस्क माउस सीएम अलगाव के लिए, लैंगेंडोर्फ परफ्यूजन विधि का उपयोग इष्टतम एंजाइम समाधान और पूर्ण बाह्य मैट्रिक्स वियोजन के लिए पर्याप्त समय के साथ किया जाता है। शुद्ध वेंट्रिकुलर सीएम प्राप्त करने के लिए, दोनों अटरिया को असंबद्धता और चढ़ाना के साथ आगे बढ़ने से पहले विच्छेदित और त्याग दिया गया था। कोशिकाओं को एक लेमिनिन लेपित प्लेट पर फैलाया गया था, जो कुशल और तेजी से लगाव के लिए अनुमति दी गई थी। सीरना ट्रांसफैक्शन से पहले सीएम को 4-6 घंटे के लिए बसने की अनुमति दी गई थी । संस्कृति मीडिया को 20 दिनों के लिए हर 24 घंटे में ताज़ा किया गया था, और बाद में, सीएम को कार्डियक-विशिष्ट मार्कर जैसे ट्रोपोनिन और सेल चक्र के मार्कर जैसे KI67 के लिए तय और दाग दिया गया था।

वर्तमान संशोधित प्रोटोकॉल कुशल अलगाव और चूहे और चूहों के केंद्रीय राज्यों में विट्रो की संस्कृति की अनुमति देता है। चूहे सीएम आइसोलेशन के लिए इस प्रक्रिया में कुल 3 वयस्क (12 सप्ताह पुराने) पुरुष फिशर 344 ?...

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Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

यहां, हम वयस्क माउस और चूहा कार्डियोमायोसाइट्स के अलगाव, ट्रांसफैक्शन और दीर्घकालिक संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

अलगाव, ट्रांसफैक्शन, और वयस्क माउस और चूहा कार्डियोमायोसाइट्स की दीर्घकालिक संस्कृति

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

इस वीडियो का उद्देश्य वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स अलगाव, दीर्घकालिक संस्कृति और ट्रांसफैक्शन के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रदर्शित करना है। माउस या चूहे से कार्डियोमायोसाइट्स को अलग और व्यवस्थित करना स्वस्थ और रोग हृदय के भीतर कार्डियोमायोसाइट्स के सेल स्वायत्त जीव विज्ञान की जांच करने के लिए एक आवश्यक तरीका बना हुआ है। ऐसे कई प्रश्न हैं जो हम अलग कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके उत्तर कर सकते हैं।जैसे कि प्रसारीय क्षमता। चोट प्रतिक्रिया पर जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन या विशिष्ट साइटोकिन अभिव्यक्ति हैं। दुर्भाग्य से, माउस कार्डियोमायोसाइट्स सामान्य संस्कृति की स्थिति में पिछले एक सप्ताह जीवित नहीं रहते हैं।इसलिए, इस वीडियो में, हम वयस्क माउस कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन करते हैं, उन्हें ट्रांसफिक्स्ड करते हैं और उन्हें 21 दिनों से परे अच्छी तरह से सुसंस्कृत करते हैं, इस तकनीक को शुरू में मास्टर करना मुश्किल है। लेकिन अभ्यास के साथ एक के बारे में प्राप्त कर सकते है ८० से ९०% अलगाव के बाद कार्डियोमायोसाइट्स में जीवित रहते है और एक के बारे में १०० प्रतिशत ट्रांसफैक्शन दक्षता । और सही परिस्थितियों में इन कार्डियोमायोसाइट्स के अधिकांश पिछले 20 दिनों तक जीवित रह सकते हैं ।15 मिनट के लिए 70% शराब में भिगोकर और बाद में उन्हें डबल आसुत पानी से धोकर अपने सर्जिकल उपकरणों को साफ और स्टरलाइज करें। पानी के बाद, अगले सूखने के लिए हवा में उपकरण छोड़ दें, प्रत्येक पांच मिनट के लिए दो बार 70% शराब चलाकर प्रचुरता तंत्र को साफ करें। प्रवाह दर बढ़ाने से 10 मिनट के लिए डबल आसुत पानी चलाकर किसी भी शेष शराब को कुल्ला करने के बाद ट्यूबिंग को साफ करने में मदद मिलेगी।एक्सिशन के बाद दिल को साफ करने के लिए तीन व्यंजन स्थापित करें। मायोसाइट बफर के 20 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक व्यंजन भरें। पाश्चर पिपेट के साथ प्रत्येक डिश में हेपरिन की दो से तीन बूंदें जोड़ें और कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं।10 मिलीलीटर सिरिंज लें और इसे मायोसाइट बफर से भरें। सिरिंज से हवा के किसी भी बुलबुले को निकालें और इसे कोणीय स्थिति में तीसरे पकवान में रखें, इसे टेप के साथ सुरक्षित करें। सर्जिकल सीवन के साथ एक ढीला गाँठ तैयार करें और इसे सुई के चारों ओर रखें।संज्ञाहरण से 20 मिनट पहले आईपी इंजेक्शन के माध्यम से हेपरिन के साथ माउस इंजेक्ट करें। प्रति मिनट तीन मिलीलीटर की प्रवाह दर पर प्रचुरता तंत्र के माध्यम से मायोसाइट प्रोफ्यूजेशन बफर को प्रसारित करें। पांच मिनट के बाद, प्रोफेशन बफर को एंजाइम समाधान के साथ बदलें, इस प्रक्रिया के दौरान एंजाइम समाधान को ऑक्सीजन के साथ संतृप्त करें, फिर से एंजाइम समाधान को प्रति मिनट तीन एमएल की प्रवाह दर में सेट करें।अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की पुष्टि करें और शल्य चिकित्सा मंच पर माउस रखें। 70% अल्कोहल के साथ त्वचा को स्टरलाइज करें। ध्यान से छाती खोलें, दिल का व्यायाम करें और दिल को पहली डिश में रखें।कोमल निचोड़ कर दिल से खून साफ करें, फिर दिल से खून को और साफ करने और किसी भी गैर-हृदय ऊतकों को हटाने के लिए दूसरी डिश में दिल को स्थानांतरित करें। बाद में दिल को तीसरी डिश में ट्रांसफर करें। महाधमनी का पता लगाएं और इसे Peyton अधिक कैन्यूलेटिंग सुई के आसपास रखने के लिए अपने संदंश का उपयोग करें।इसे अपने पूर्व तंग गाँठ को नीचे खींचकर सुरक्षित करें और फिर दूसरी गाँठ बना लें। अतिरिक्त स्थिरता के लिए एक क्लिप की मदद से आदेश और जगह तय करें। किसी भी अतिरिक्त सीवन धागे ट्रिम, और अंत में सिरिंज में मायोसाइट बफर का उपयोग कर दिल में शेष रक्त के किसी भी स्पष्ट करने के लिए दिल प्रचुरता शुरू करते हैं ।सावधानी से सिरिंज से गणना सुई को हटा दें और इसे प्रचुरता तंत्र में हुक करें। दिल में जाने से किसी भी हवा बुलबुले को रोकने का प्रयास करें। चूंकि इससे एंजाइम के घोल और पाचन के प्रवाह पर असर पड़ सकता है।प्रचुरता के दौरान दिल को एक सजातीय वातावरण प्रदान करने के लिए, पानी की जैकेट को ऊपर ले जाएं। एंजाइम समाधान को प्रति मिनट दो से तीन एमएल की गति के साथ हृदय के माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति दें। एंजाइम समाधान को दो मिनट के लिए दिल के माध्यम से प्रवाहित होने दें।दो मिनट में, एंजाइम समाधान के लिए सौ माइक्रोमोलर कैल्शियम क्लोराइड समाधान के 40 माइक्रोलीटर में मिलाएं। एंजाइम समाधान को 10 से 15 मिनट के लिए दिल से गुजरने दें। एक बार जब प्रवाह चिकनी हो जाता है और दिल भूरा और नरम दिखने लगता है, तो आप जानते हैं कि दिल के उचित पाचन को प्राप्त करने के लिए आपके पास कोलेजनेज़ एंजाइम का भी वितरण होता है।जब आपको लगता है कि आपका पाचन पूरा हो गया है, तो दिल को लैंगेंडोर्फ परफ्यूजन सिस्टम से नीचे ले जाएं और इसे एंजाइम समाधान के पांच मिलीलीटर से भरे 16 मिलीमीटर पेट्री डिश में डाल दें और इसे बायोसेफ्टी फुट पर ले जाएं। अटरिया और एक्स्ट्रा फैट टिश्यू को सावधानी से हटा दें। संदंश की मदद से परिभाषित टुकड़ों में दिल कीमा।एक बाँझ पाश्चर पिपेट लें और 45 डिग्री पर इसकी नोक काट लें। ऊपर और नीचे कोमल पाइपिंग द्वारा दिल के ऊतकों को तोड़ने के लिए पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। इष्टतम पाचन एकल कोशिका कार्डियोमायोसाइट्स का निलंबन प्रदान करता है इसके बाद पाचन से बचने के लिए एंजाइम गतिविधि को रोकने के लिए पांच मिलीलीटर स्टॉप सॉल्यूशन जोड़ें, पहले 50 मिलीलीटर शंकु नली लें और उस पर एक बाँझ एक सौ माइक्रोन सेल छलनी रखें।ऊतक के किसी भी बड़े हिस्से को हटाने के लिए सेल छलनी के माध्यम से कार्डियोमायोसाइट निलंबन पास करें। अंत में किसी भी संलग्न कार्डियोमायोसाइट को इकट्ठा करने के लिए स्टॉप सॉल्यूशन के साथ छलनी धोएं। तीन मिनट के लिए 20 जीएस पर सेल सस्पेंशन को सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को त्यागें।कार्डियोमायोसाइट्स और स्टॉप सॉल्यूशन के 10 मिलीलीटर को फिर से निलंबित करें, तीन मिनट के अंतराल पर 100 मिलीमोलर कैल्शियम क्लोराइड समाधान के 10 माइक्रोलीटर चार बार और मिश्रण करें। चौथे संस्करण के बाद तीन मिनट के लिए 20 जीएस पर कार्डियोमायोसाइट्स निलंबन और सुपरनैक्टेंट त्यागें। संस्कृति मीडिया पूर्व प्लेट कोशिकाओं में एक ६० मिलीमीटर पकवान में कार्डियोमायोसाइट्स फिर से निलंबित और दो से तीन घंटे के लिए CO2 इनक्यूबेटर में डाल दिया ।दो से तीन घंटे में। फाइबर विस्फोटों की तरह मुख्य संदूषक सेल प्रकार पकवान की सेवा का पालन किया जाएगा, कार्डियोमायोसाइट्स के शुद्ध अलगाव के लिए अनुमति देता है । उसके बाद, डिश को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें और फ्लोटिंग कार्डियोमायोसाइट्स को एक शंकु नली में इकट्ठा करें और कार्डियोमायोसाइट्स को लेमिनिन कोटेड 24 वेल कल्चर प्लेट में फिर से खेला।कार्डियोमायोसाइट्स के लिए सतह का पालन करने के लिए चार से छह घंटे पर्याप्त हैं। तो ट्रांसफेक्शन चढ़ाना के बाद छह घंटे में किया जा सकता है । आरएनए आईमैक्स ट्रांसफैक्शन रीएजेंट का इस्तेमाल एसआईआरएएएस के साथ कार्डियोमायोसाइट्स ट्रांसप्लांट करने के लिए किया गया था ।संस्कृति मीडिया में 10% एफबीएस के साथ पूरक 25 माइक्रोमोलर ब्लड स्टेटन होता है, जो हमने पाया है कि दीर्घकालिक कार्डियोमायोसाइट संस्कृति करने और प्रसार विश्लेषण को प्रेरित करने के लिए बेहतर अनुकूल है। ट्रांसफेक्शन के बाद, आप माइक्रो इनक्यूबेटर का उपयोग करते हुए माइक्रोस्कोपी द्वारा कार्डियोमायोसाइट्स देख सकते हैं कि समय-चूक इमेजिंग के लिए कोशिकाएं कैसे हैं। ये कम और उच्च आवर्धन पर संक्रमित रॉड के आकार के कार्डियोमायोसाइट्स की ब्राइटफील्ड छवियां हैं।यहां, आप दिन-प्रतिदिन इमेजिंग देख सकते हैं, जो वयस्क माउस कार्डियोमायोसाइट आकृति विज्ञान में परिवर्तन को प्रदर्शित करता है। हम पुष्टि करते हैं कि कार्डियोमायोसाइट्स शुरुआती समय बिंदुओं पर स्वस्थ और संकुचन हैं, साथ ही डी भेदभाव और दीर्घकालिक संस्कृति के बाद भी। यहां SiRNAs, एक ट्रांसफैक्शन के बाद संस्कृति में वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स के प्रेरित प्रसार का प्रदर्शन करने वाले Ki67 इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेन का एक उदाहरण दिया गया है।जैसा कि आप इस तकनीक का उपयोग कर परिणामों से देख सकते हैं, एक माउस और चूहे से स्वस्थ वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स प्राप्त कर सकते हैं और उन्हें दीर्घकालिक अध्ययन के लिए संस्कृति। अंत में, एक बार इस तकनीक में महारत हासिल करने के बाद हमें वर्तमान संस्कृति प्रोटोकॉल से परे कार्डियोमायोसाइट्स का अध्ययन करने की अनुमति देगा।

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

वयस्क चूहा हार्ट Myocytes के प्राथमिक संस्कृति

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

मानव स्तन कैंसर के नमूने और उनके विश्लेषण का उपयोग ऑप्टिकल प्रोजेक्शन टोमोग्राफी की लंबी अवधि संस्कृति

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

वयस्क माउस cardiomyocytes की सिंगल सेल transcriptional रूपरेखा

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

अलगाव और चूहा यकृत कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के सीरियल संवर्धन (SSCs) लंबी अवधि वयस्क माउस एसएससी लाइन्स की व्युत्पत्ति के लिए संस्कृति में

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

अलगाव और संस्कृति नवजात माउस cardiomyocytes की

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

अलगाव, संस्कृति, और वयस्क माउस Cardiomyoctyes के कार्यात्मक विशेषता

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

माउस cardiomyocytes के अलगाव और शारीरिक विश्लेषण

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

वयस्क माउस छेनी से चिकित्सकीय उपकला स्टेम कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

अलगाव और संस्कृति वयस्क माउस सेल संकेतन के लिए cardiomyocytes और की<em&gt; इन विट्रो</em&gt; कार्डियक hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...