Name: isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento del Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio, Università di Cincinnati, College of Medicine, al Dr. Onur Kanisicak; una sovvenzione del National Institutes of Health (R01HL148598) al Dr. Onur Kanisicak. Il Dr. Onur Kanisicak è supportato dall'American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr. Perwez Alam è supportato dalla sovvenzione post-dottorato American Heart Association (AHA_20POST35200267). La dott.ssa Malina J. Ivey è supportata da una sovvenzione NIH T32 (HL 125204-06A1).

Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti in conformità con le linee guida della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio pubblicata dal National Institute of Health (NIH) degli Stati Uniti. Tutti i protocolli visualizzati nel video sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Cincinnati, College of Medicine.
1. Preparazione prima dell'estrazione cardiaca da topi adulti (e ratti)
<ol><li>Preparare le corrispondenti soluzioni...

<ol>
	<li>van Amerongen, M. J., Engel, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+cardiomyocyte+proliferation+and+its+potential+for+cardiac+regeneration.">Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).</li><li>Parente, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+cardiac+injury+and+regeneration+in+zebrafish+adult+heart.">Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart.</a> PLoS One. 8, 53748 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+capacity+of+zebrafish+reverses+cardiac+failure+caused+by+genetic+cardiomyocyte+depletion.">The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion.</a> Development. 138, 3421-3430 (2011).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes.">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).</li><li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+function+in+mammalian+cardiac+myocytes.">T-tubule function in mammalian cardiac myocytes.</a> Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).</li><li>M&#252;ller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor.">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+ischemic+heart+disease:+novel+carriers+for+bioinformation.">Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).</li><li>Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cardiokines+in+Heart+Diseases:+Beneficial+or+Detrimental.">The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental.</a> BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).</li><li>Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+cardiomyocytes+in+culture+A+model+system+to+study+the+plasticity+of+the+differentiated+cardiac+phenotype+at+the+molecular+and+cellular+levels.">Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).</li><li>Alam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Senescence-Associated+Genes+Rb1+and+Meis2+in+Adult+Cardiomyocytes+Results+in+Cell+Cycle+Reentry+and+Cardiac+Repair+Post-Myocardial+Infarction.">Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-210-mediated+proliferation,+survival,+and+angiogenesis+promote+cardiac+repair+post+myocardial+infarction+in+rodents.">MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents.</a> Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).</li><li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+ascending:+perspectives+for+human-disease+models.">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Schl&#252;ter, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cultivation+of+Adult+Rat+Cardiomyocytes.">Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119, 909-920 (2016).</li><li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy.">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).</li><li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes.">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).</li><li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li><li>Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+specifically+inhibits+actin-myosin+interaction+in+mouse+cardiac+muscle.">Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Sellin, L. C., McArdle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+2,3-butanedione+monoxime.">Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.</a> Pharmacology &amp; Toxicology. 74, 305-313 (1994).</li></ol>

C'è una necessità fondamentale di stabilire un protocollo per l'isolamento dei cardiomiocisti adulti e la coltura a lungo termine per eseguire studi meccanicistici specifici delle cellule. Ci sono solo pochi rapporti che parlano di protocolli di isolamento CM adulti, e ancora meno di loro sono utilizzati per la coltura a lungo termine di topi adulti CM15,16,17. È stato dimostrato che il ratto adulto CM ha una maggiore tollera...

Le malattie cardiache sono una delle principali cause di morte in tutto il mondo. Quasi tutti i tipi di lesioni cardiache si tras danno una significativa perdita di cardiomiociti adulti (CM). I cuori dei mammiferi adulti non sono in grado di riparare le loro lesioni cardiache a causa della natura senescente del CM1 adulto. Così, qualsiasi insulto al cuore dei mammiferi adulti si traduce in una perdita permanente di CMs, che porta a una ridotta funzione cardiaca e insufficienza cardiaca. A differenza dei mammiferi adulti, piccoli animali come il pesce zebra e i cuori di nuovatta possono rigenerare le loro lesioni cardiache attraverso la proliferazione CMesistente 2,3,4. È in corso uno sforzo mondiale per trovare un nuovo intervento terapeutico per le lesioni cardiache tramite approcci prolifertivi e non proliferative. Negli ultimi decenni, sono stati sviluppati vari tipi di modelli genetici di topo per studiare le lesioni cardiache e la riparazione. Tuttavia, l'utilizzo di modelli animali in vivo continua ad essere un approccio costoso con l'ulteriore complessità per decifrare un meccanismo autonomo dalle cellule dagli effetti secondari. Inoltre, i sistemi in vivo sono difficili da analizzare CM effetti specifici di un intervento farmacologico che induce la segnalazione cardioprotettiva dal CM.
Inoltre, la cultura a lungo termine delle CCI adulte è necessaria per eseguire analisi di proliferazione cm. I saggi di proliferazione CM richiedono un minimo di 4-5 giorni affinché le cellule siano indotte nel ciclo cellulare e per ottenere dati accurati dopo di che. Inoltre, gli studi che utilizzano cM isolati per studi elettrofisiologici, screening farmacologici, studidi tossicità e studi sull'omeostasi di Ca sono tutti bisognosi di un sistema dicoltura migliorato 5,6,7. Inoltre, studi recenti mostrano il significato cardioprotettivo delle citochine secrete dai CMs (cardiocine)8,9. Al fine di studiare il ruolo terapeutico e il meccanismo molecolare di queste cardiochine durante la riparazione e la rigenerazione del cuore, è necessaria una coltura prolungata.
Le CCI ratto adulte sono sufficientemente robuste per l'isolamento a una cellula e la coltura a lungo termine in un sistema in vitro10,11,12. Tuttavia, i CIM per topi adulti sono di grande interesse per gli analisi in vitro, a causa della disponibilità di una varietà di modelli murini geneticamente modificati, che consente la progettazione e l'esecuzione di varie analisi innovative che non sono possibili con il ratto CM13. A differenza dell'isolamento CM del ratto adulto, è piuttosto difficile ottenere una sospensione a un solo cellula dai cuori dei topi adulti, e la cultura a lungo termine delle VM per topi adulti nella cultura è ancora più impegnativa.
L'isolamento CM adulto dai cuori di topo e ratto utilizzando un sistema Langendorff è stato precedentemente stabilito per studiare la funzione CM5,14,15. Qui, abbiamo descritto in dettaglio i protocolli per l'isolamento CM adulto da ratti e topi, così come una coltura a lungo termine modificata, la trasfezione e la proliferazione CM di cellule isolate.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butane Dione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>B1387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-miR-67</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene weighing dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z154881-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>PSLAB-018285-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Mouse Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>24352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229865+5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siMeis2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s161030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRb1</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s128325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Blunt/SharpDissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Very Fine Precision Tip Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16-100-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8158-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3006S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes

La coltura ex vivo dei cardiomiociti di mammiferi adulti (CM) presenta il sistema sperimentale più rilevante per lo studio in vitro della biologia cardiaca. I VM di mammiferi adulti sono cellule terminalmente differenziate con capacità proliferative minima. Lo stato post-mitotico dei VM adulti non solo limita la progressione del ciclo cellulare cardiomiocato, ma limita anche la coltura efficiente delle CM. Inoltre, la cultura a lungo termine delle CCI adulte è necessaria per molti studi, come la proliferazione CM e l'analisi dell'espressione genica.
Il topo e il ratto sono i due animali da laboratorio preferiti da utilizzare per l'isolamento cardiomiocato. Mentre la cultura a lungo termine dei CCI ratti è possibile, i VM per topi adulti sono suscettibili alla morte e non possono essere sevati più di cinque giorni in condizioni normali. Pertanto, vi è una necessità critica di ottimizzare l'isolamento delle cellule e il protocollo di coltura a lungo termine per le CCI murine adulte. Con questo protocollo modificato, è possibile isolare con successo e coltura sia per topi adulti e ratto CMs per più di 20 giorni. Inoltre, l'efficienza della trasfezione del siRNA di CM isolato è significativamente aumentata rispetto ai rapporti precedenti. Per l'isolamento CM del topo adulto, il metodo di perfusione Diatrofio viene utilizzato con una soluzione enzimatica ottimale e con tempo sufficiente per la completa dissociazione della matrice extracellulare. Al fine di ottenere CM ventricolari puri, entrambi gli attri sono stati sezionati e scartati prima di procedere con la dissociazione e la placcatura. Le cellule sono state disperse su una piastra rivestita di laminina, che ha permesso un attaccamento efficiente e rapido. I VM sono stati autorizzati ad accontentarsi di 4-6 h prima della trasfezione del siRNA. I supporti di coltura sono stati aggiornati ogni 24 h per 20 giorni, e successivamente, i CM sono stati fissati e macchiati per marcatori cardiaci specifici come La troponina e marcatori del ciclo cellulare come KI67.

L'attuale protocollo modificato consente un isolamento efficiente e la coltura di RAT e topi in vitro. Per l'isolamento del ratto CM, nella procedura sono stati utilizzati 3 ratti Fischer di sesso maschile adulto (12 settimane). Figura 1 mostra l'apparato chirurgico e le configurazioni di isolamento che sono necessari nella procedura; ogni parte è stata contrassegnata e descritta nella legenda della figura. Collagenase tipo 2 è stato utilizzato per la digestione, che produce un'elevata qua...

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Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento, la trasfezione e la cultura a lungo termine dei cardiomiociti adulti di topi e ratti.

Isolamento, trasfezione e cultura a lungo termine di cardiomiociti per topi e ratti adulti

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

L'obiettivo di questo video è dimostrare un protocollo standardizzato per l'isolamento dei cardiomiociti adulti, la cultura a lungo termine e la trasfezione. Isolare e coltivare i cardiomiociti dal topo o dal ratto continua ad essere un metodo essenziale per studiare la biologia autonoma cellulare dei cardiomiociti all'interno del cuore sano e delle malattie. Ci sono diverse domande a cui possiamo rispondere usando cardiomiociti isolati.Come il potenziale proliferativo. Ci sono cambiamenti nell'espressione genica o espressioni citochine specifiche alla risposta alle lesioni. Sfortunatamente, i cardiomiociti del topo non sopravvivono oltre una settimana in normali condizioni culturali.Pertanto, in questo video, descriviamo un metodo ottimizzato per isolare i cardiomiociti adulti del topo, trafitti e coltivati ben oltre i 21 giorni, questa tecnica è inizialmente difficile da padroneggiare. Ma con la pratica si può ottenere circa l'80-90% sopravvivere nei cardiomiociti dopo l'isolamento e circa il 100% di efficienza di trasfezione. E la maggior parte di questi cardiomiociti in condizioni corrette può sopravvivere negli ultimi 20 giorni.Pulire e sterilizzare gli strumenti chirurgici immergendoli in 70% di alcol per 15 minuti e successivamente lavandoli con acqua doppia distillata. Dopo l'acqua, lasciare asciugare gli utensili nell'aria, pulire l'apparato di profusione eseguendo il 70% di alcol due volte per cinque minuti ciascuno. L'aumento della portata aiuterà a pulire i tubi dopo che l'alcol ha risciacquato l'alcol rimanente facendo scorrere acqua distillata doppia per 10 minuti.impostare tre piatti per pulire il cuore dopo l'escissione. Riempire ciascuno dei piatti con 20 millilitri di tampone di miocita. Aggiungere da due a tre gocce di eparina ad ogni piatto con la pipetta Pasteur e mescolare bene pipettando su e giù più volte.Prendi una siringa da 10 millilitri e riempila con un buffer di miociti. Rimuovere una qualsiasi delle bolle d'aria dalla siringa e posizionarla nel terzo piatto in posizione angolata, fissarla con del nastro adesivo. Preparare un nodo sciolto con sutura chirurgica e posizionarlo intorno all'ago.Iniettare il mouse con eparina tramite iniezione IP 20 minuti prima dell'anestesia. Far circolare il tampone di profusione di miociti attraverso l'apparato di profusione ad una portata di tre millilitri al minuto. Dopo cinque minuti, sostituire il tampone di profusione con soluzione enzimatica, saturare la soluzione enzimatica con ossigeno durante il processo, ancora una volta, impostare la soluzione enzimatica su una portata di tre mL al minuto.Confermare l'anestesia pizzicando e posizionare il mouse sulla piattaforma chirurgica. Sterilizzare la pelle con il 70% di alcol. Aprire con cura il petto, esercitare il cuore e mettere il cuore nel primo piatto.Togliere il sangue dal cuore stringendo delicatamente, quindi trasferire il cuore al secondo piatto per pulire ulteriormente il sangue dal cuore e rimuovere eventuali tessuti non cardiaci. Successivamente trasferire il cuore al terzo piatto. Trova l'aorta e usa le pinie per mantenerla Peyton più posizionarla intorno all'ago cannulante.Fissarlo tirando verso il basso il serraggio del nodo pre stretto e quindi facendo un secondo nodo. Per una maggiore stabilità fissare l'ordine e l'posizionare con l'aiuto di una clip. Tagliare qualsiasi filo di sutura in eccesso e infine iniziare la profusione cardiaca usando il buffer di miocita nella siringa per cancellare tutto il sangue rimanente nel cuore.Rimuovere con cura l'ago calcolatore dalla siringa e agganciarlo all'apparato di profusione. Cerca di evitare che eventuali bolle d'aria andano nel cuore. Poiché ciò può influenzare il flusso della soluzione enzimatica e della digestione.Spostare la giacca dell'acqua verso l'alto, per fornire un ambiente omogeneo al cuore durante la profusione. Consentire alla soluzione enzimatica di fluire attraverso il cuore con una velocità da due a tre mL al minuto. Lasciare che la soluzione enzimatica fluisa attraverso il cuore per due minuti.A due minuti, mescolare in 40 microlitri di una soluzione di cloruro di calcio micromolare alla soluzione enzimatica. Lasciare passare la soluzione enzimatica attraverso il cuore per altri 10-15 minuti. Una volta che il flusso diventa liscio e il cuore inizia a sembrare marrone e morbido, sai che hai una distribuzione uniforme dell'enzima collagenasi per ottenere una corretta digestione del cuore.Quando pensi che la tua digestione sia completa, tolti il cuore dal sistema di perfusione Langendorff e mettilo in una piastra di Petri di 16 millimetri piena di cinque millilitri di soluzione enzimatica e portalo in un piede di biosicurezza. Rimuovere con cura gli atri e il tessuto adiposo extra. Tritare il cuore in pezzi definiti con l'aiuto di forcep.Prendi una pipetta Pasteur sterile e taglia la punta a 45 gradi. Utilizzare la pipetta Pasteur per rompere il tessuto cardiaco con una delicata pipettazione su e giù. La digestione ottimale fornisce una sospensione dei cardiomiociti a singola cellula dopo che aggiungere cinque millilitri di soluzione di arresto per fermare l'attività enzimatica per evitare la digestione troppo, Prendere un primo tubo conico da 50 millilitri e posizionare un filtro cellulare sterile di cento micron su di esso.Passare la sospensione del cardiomiocita attraverso il filtro cellulare per rimuovere eventuali grandi pezzi di tessuto. Infine lavare il colino con soluzione di arresto per raccogliere eventuali resti di cardiomiociti attaccati. Centrifugare la sospensione cellulare a 20 GS per tre minuti e scartare il supernatante.Sospendere di nuovo i cardiomiociti e 10 millilitri di soluzione di arresto, a intervalli di tre minuti a 10 microlitri di soluzione di cloruro di calcio millimolare quattro volte e mescolare. Dopo la quarta edizione centrifuga la sospensione dei cardiomiociti a 20 GS per tre minuti e scarta il supernatante. Sospendere di nuovo i cardiomiociti nei mezzi di coltura Pre-placcare le cellule in un piatto da 60 millimetri e mettere in incubatrice di CO2 per due o tre ore.Tra due o tre ore. I principali tipi di cellule contaminanti come le esplosioni di fibre saranno rispettati al servizio del piatto, consentendo il puro isolamento dei cardiomiociti. Dopodiché, prendi il piatto dall'incubatrice e raccogli i cardiomiociti galleggianti in un tubo conico e riproduce i cardiomiociti in una piastra di coltura di 24 pozzi rivestita di laminina.Da quattro a sei ore sono sufficienti affinché i cardiomiociti aderiscano alla superficie. Quindi la trasfezione potrebbe essere eseguita a sei ore dalla placcatura. Il reagente di trasfezione RNA IMAX è stato utilizzato per trapiantare cardiomiociti con siRNA.Il supporto di coltura contiene 25 staten di sangue micromolare integrati con il 10% di FBS, che abbiamo trovato più adatto per eseguire la coltura cardiomiocita a lungo termine e indurre l'analisi della proliferazione. Dopo la trasfezione, è possibile visualizzare i cardiomiociti per microscopia utilizzando un micro incubatore su come sono le cellule per l'imaging time-lapse. Queste sono immagini a campo luminoso di cardiomiociti a forma di asta trasfettata a basso e alto ingrandimento.Qui, puoi vedere l'imaging giorno per giorno, che mostra i cambiamenti nella morfologia del cardiomiocita del topo adulto. Confermiamo che i cardiomiociti sono sani e contrattili nei primi tempi, così come dopo la differenziazione D e la cultura a lungo termine. Ecco un esempio di colorazione immunofluorescente Ki67 che dimostra la proliferazione indotta di cardiomiociti adulti in coltura dopo i siRNA, una trasfezione.Come potete vedere dai risultati utilizzando questa tecnica, si possono ottenere cardiomiociti adulti sani dal topo e dal ratto e coltarli per uno studio a lungo termine. In conclusione, una volta padroneggiata questa tecnica ci permetterà di studiare i cardiomiociti ben oltre gli attuali protocolli di coltivazione.

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