Name: isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

この研究は、シンシナティ大学医学部の病理学・検査医学科からオヌール・カニシカ博士への資金提供によって支えられた。国立衛生研究所(R01HL148598)からオヌール・カニシカク博士への助成金。オヌール・カニシカク博士は、米国心臓協会キャリア開発賞(18CDA34110117)の支援を受けています。パーウェス・アラム博士は、米国心臓協会の博士研究員(AHA_20POST35200267)によって支えられている。マリナ・J・アイビー博士は、NIH T32助成金(HL 125204-06A1)によってサポートされています。

すべての実験は、米国国立衛生研究所(NIH)が発行する実験動物のケアと使用ガイドのガイドラインに従って行われるべきです。ビデオに表示されるすべてのプロトコルは、シンシナティ大学医学部の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. 成体マウス(およびラット)からの心臓抽出前の調製
<ol><li>対応する灌流、酵素、および停止液を、 ?...

<ol>
	<li>van Amerongen, M. J., Engel, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+cardiomyocyte+proliferation+and+its+potential+for+cardiac+regeneration.">Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).</li><li>Parente, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+cardiac+injury+and+regeneration+in+zebrafish+adult+heart.">Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart.</a> PLoS One. 8, 53748 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+capacity+of+zebrafish+reverses+cardiac+failure+caused+by+genetic+cardiomyocyte+depletion.">The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion.</a> Development. 138, 3421-3430 (2011).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes.">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).</li><li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+function+in+mammalian+cardiac+myocytes.">T-tubule function in mammalian cardiac myocytes.</a> Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).</li><li>M&#252;ller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor.">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+ischemic+heart+disease:+novel+carriers+for+bioinformation.">Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).</li><li>Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cardiokines+in+Heart+Diseases:+Beneficial+or+Detrimental.">The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental.</a> BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).</li><li>Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+cardiomyocytes+in+culture+A+model+system+to+study+the+plasticity+of+the+differentiated+cardiac+phenotype+at+the+molecular+and+cellular+levels.">Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).</li><li>Alam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Senescence-Associated+Genes+Rb1+and+Meis2+in+Adult+Cardiomyocytes+Results+in+Cell+Cycle+Reentry+and+Cardiac+Repair+Post-Myocardial+Infarction.">Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-210-mediated+proliferation,+survival,+and+angiogenesis+promote+cardiac+repair+post+myocardial+infarction+in+rodents.">MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents.</a> Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).</li><li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+ascending:+perspectives+for+human-disease+models.">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Schl&#252;ter, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cultivation+of+Adult+Rat+Cardiomyocytes.">Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119, 909-920 (2016).</li><li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy.">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).</li><li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes.">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).</li><li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li><li>Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+specifically+inhibits+actin-myosin+interaction+in+mouse+cardiac+muscle.">Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Sellin, L. C., McArdle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+2,3-butanedione+monoxime.">Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.</a> Pharmacology &amp; Toxicology. 74, 305-313 (1994).</li></ol>

細胞特異的な機械学的研究を行うために、成人心筋細胞単離および長期培養のためのプロトコルを確立することが重要である。成人の CM 分離プロトコルについて説明する報告はごくわずかで、さらに少ない数が成体マウス CM15、16、1716,17の長期培養に使用されます。15成体ラットCMは、成体マウスCM10、11、12</s...

心臓病は、世界中の主要な死因の一つです。ほとんどすべてのタイプの心障害は、成人心筋細胞(CM)の有意な喪失をもたらす。成人哺乳類の心臓は、成人のCM1の老化性のために心臓損傷を修復することができない。したがって、成人哺乳類の心臓に対する侮辱は、CMの永久的な喪失をもたらし、心機能および心不全の減少をもたらす。成人哺乳類とは異なり、ゼブラフィッシュやイニュートハートのような小動物は、既存のCM増殖22、3、43,4を通じて心臓損傷を再生することができる。世界的な取り組みは、増殖と不拡散の両方のアプローチを介して心臓傷害に対する新たな治療介入を見つけ出すために進行中である。過去数十年の間に、様々なタイプの遺伝的マウスモデルが心臓損傷および修復を研究するために開発された。しかし、in vivo動物モデルを使用することは、二次的な効果から細胞自律機構を解読するための追加の複雑さを伴う高価なアプローチであり続けています。また、生体内システムは、CMから心保護シグナル伝達を誘導する薬理学的介入のCM特異的効果を分析することは困難である。
さらに、CM増殖解析を行うためには、成人CMの長期培養が必要である。CM増殖アッセイは、細胞が細胞周期に誘導され、その後正確なデータを得るために最低4〜5日を必要とする。さらに、電気生理学的研究、薬物スクリーニング、毒性試験、およびCa++ホメオスタシス研究のために単離されたCMを利用する研究は、すべて改善された培養系5、6、76を必要と7している。5さらに、最近の研究では、CM(カーディオカイン)8,9,9から分泌されるサイトカインの心保護的意義を示す。心臓の修復と再生の間にこれらのカーディオキンの治療的役割と分子機構を調べるには、長期培養が必要である。
成人ラットのCMは、インビトロシステム10、11、12,11,12における単細胞単細胞分離および長期培養に十分に堅牢である。しかし、成虫マウスCMは、ラットCM13では不可能な様々な革新的な分析の設計と実行を可能にする様々な遺伝子組み換えマウスモデルの入手可能性のために、インビトロアッセイに大きな関心を持っています。成体ラットCMの分離とは対照的に、成体マウスの心臓から単細胞懸濁液を得ることは非常に困難であり、培養中の成体マウスCMの長期的な培養はさらに困難である。
ランゲンドルフシステムを使用したマウスとラットの心臓からの成人のCM分離は、以前にCM機能55、14、1514,15を研究するために確立されています。ここでは、ラットおよびマウスの両方からの成人CM単離のためのプロトコル、ならびに単離細胞の修飾された長期培養、トランスフェクション、およびCM増殖について詳細に説明した。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butane Dione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>B1387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-miR-67</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene weighing dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z154881-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>PSLAB-018285-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Mouse Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>24352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229865+5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siMeis2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s161030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRb1</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s128325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Blunt/SharpDissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Very Fine Precision Tip Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16-100-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8158-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3006S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes

成人哺乳類心筋細胞(CM)のエクスビボ培養は、心臓生物学のインビトロ研究に最も関連する実験システムを提示する。成人哺乳類のCMは、増殖能力が最小の末端分化細胞である。成人CMのポストミトティック状態は、心筋細胞周期の進行を制限するだけでなく、CMの効率的な培養を制限します。また、CMの増殖や遺伝子発現の解析など、多くの研究には成人CMの長期培養が必要です。
マウスとラットは、心筋細胞の分離に使用される2つの最も好ましい実験動物である。ラットCMの長期培養は可能ですが、成虫マウスCMは死亡しやすく、通常の条件下では5日以上培養できません。したがって、成人マウスのCMの細胞分離および長期培養プロトコルを最適化する必要があります。この変更されたプロトコルを使用すると、成体マウスとラットの両方のCMを20日以上正常に分離および培養することが可能です。さらに、単離されたCMのsiRNAトランスフェクション効率は、以前の報告に比べて有意に増加する。成人マウスCMの分離のために、ランゲンドルフ灌流法は、最適な酵素溶液と完全な細胞外マトリックス解離のための十分な時間で利用される。純粋な心室CMを得るために、両方の心房を解剖し、解離およびめっきを進める前に廃棄した。細胞をラミニンコーティングされたプレート上に分散させ、効率的かつ迅速な付着を可能にした。CMは、siRNAトランスフェクションの前に4〜6時間沈着させた。培養培地を24時間ごとに20日間リフレッシュし、その後、トロポニンなどの心臓特異的マーカーやKI67などの細胞周期のマーカーについてCMを固定し染色した。

現在の変更されたプロトコルは、ラットとマウスのCMを効率的に分離し培養することができます。ラットCM単離の場合、処置で合計3匹の成人(12週齢)の雄フィッシャー344匹を使用した。 図 1 は、手順に必要な手術装置と分離セットアップを示しています。各部分は、図の凡例にマークされ、説明されています。コラゲナーゼタイプ2は、正常な分離から高品質のCMの高い量...

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Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

ここでは、成体マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、および長期培養のためのプロトコルを提示する。

成人マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、長期培養

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

このビデオの目的は、成人型心筋細胞の分離、長期培養およびトランスフェクションのための標準化されたプロトコルを実証することです。マウスまたはラットから心筋細胞を単離し、培養することは、健康で疾患の心臓内の心筋細胞の細胞自律生物学を調べるのに不可欠な方法であり続ける。孤立した心筋細胞を使用して答えることができるいくつかの質問があります。増殖ポテンシャルなど。傷害反応時に遺伝子発現変化または特異的サイトカイン発現がある。残念なことに、マウス心筋細胞は、通常の培養条件では過去1週間は生存しない。したがって、このビデオでは、成体マウス心筋細胞を分離する最適化された方法を説明し、それらをトランスフォームして21日を超えて培養し、この技術は当初習得が困難である。しかし、練習では、分離後の心筋細胞で約80〜90%の生存を達成し、約100%のトランスフェクション効率を達成することができます。そして、正しい条件でこれらの心筋細胞のほとんどは、過去20日間生き残ることができます。手術器具を70%アルコールに15分間浸し、その後二重蒸留水で洗浄して、手術器具を洗浄して殺菌します。水の後、次に乾燥する空気中のツールを残し、それぞれ5分間2回アルコール70%を実行して拡散装置を清掃する。流量を増やすと、アルコールが残りのアルコールを10分間二重蒸留水で洗い流した後、チューブをきれいにするのに役立ちます。切除後に心臓をきれいにするために3つの料理を設定します。ミオサイトバッファーの 20 ミリリットルで各料理を充填します。.パスツールピペットで各料理に2〜3滴のヘパリンを加え、何度も上下にピペットを入れ、よく混ぜます。10ミリリットルの注射器を取り、筋細胞バッファーでそれを埋めます.シリンジから気泡を取り出し、3番目の皿に斜めの位置に置き、テープで固定します。外科的縫合糸でゆるい結び目を準備し、針の周りに置きます。麻酔の20分前にIP注入を通してヘパリンでマウスを注入する。1分間に3ミリリットルの流量で、拡散装置を通して筋細胞拡散バッファーを循環させる。5分後、拡散バッファーを酵素溶液に置き換え、プロセス中に酵素溶液を酸素で飽和させ、再度、酵素溶液を毎分3mLの流量に設定する。つまみつまみで麻酔を確認し、外科用プラットフォームにマウスを置きます。70%アルコールで皮膚を殺菌する。胸を慎重に開き、心臓を運動し、最初の皿に心臓を入れます。穏やかな絞りによって心臓から血液をクリアし、心臓から血液をさらに浄化し、非心臓組織を除去するために心臓を2番目の皿に移します。その後、心臓を3番目の皿に移します。大通りを見つけて、あなたの鉗子を使ってペイトンをもっとカニューラッティング針の周りに置きます。あなたの前のタイトな結び目の締め付けを引き下げ、2番目の結び目を作ることによってそれを固定します。さらなる安定性のために順序を修正し、クリップの助けを借りて配置します。余分な縫合糸をトリミングし、最後に注射器の筋細胞バッファーを使用して心臓拡散を開始し、心臓に残っている血液のいずれかをクリアする。慎重に注射器から計算針を取り出し、拡散装置に引っ掛けます。気泡が心臓に入るのを防ぐようにしてください。これは酵素溶液の流れと消化に影響を与える可能性があります。水上ジャケットを上に移動し、拡散中に心臓に均質な環境を提供します。酵素溶液が毎分2〜3 mLの速度で心臓を流れるようにします。酵素溶液が心臓を2分間流れ込む。2分間で、酵素溶液に100マイクロモル塩化カルシウム溶液の40マイクロリットルを混ぜます。酵素溶液はさらに10〜15分間心臓を通過させます。流れが滑らかになり、心臓が茶色で柔らかく見え始めると、コラゲナーゼ酵素の分布が均一になり、心臓の適切な消化を達成することができます。消化が完了すると思ったら、ランゲンドルフ灌流システムから心臓を下ろし、5ミリリットルの酵素溶液で満たされた16ミリメートルのペトリ皿に入れ、バイオセーフティフットに持って行きます。慎重にアトリアと余分な脂肪組織を除去します。鉗子の助けを借りて定義された部分で心臓をミンチ。滅菌パスツールピペットを取り、45度でその先端をカットします。パスツールピペットを使用して、上下に穏やかなピペットを使用して心臓組織を分割します。最適な消化は、消化を避けるために酵素活性を停止するために5ミリリットルの停止溶液を追加した後、単一細胞心筋細胞の懸濁液を提供し、最初の50ミリリットルの円錐管を取り、その上に無菌100ミクロンの細胞ストレーナーを置く。細胞ストレーナーを通して心筋細胞の懸濁液を通過し、組織の大きな塊を取り除きます。最後に、ストレーナーを停止溶液で洗浄して、付属の心筋細胞を回収します。細胞懸濁液を20GSで3分間遠心し、上清を捨てる。心筋細胞および10ミリリットルの停止溶液を、100ミリモルの塩化カルシウム溶液の10マイクロリットルで3分間隔で4回懸濁し、混合する。第4版遠心分離機後、心筋細胞懸濁液を20GSで3分間停止し、上清を捨てる。再培養培地に心筋細胞を再中断プレプレート細胞を60ミリメートル皿にプレートし、2〜3時間CO2インキュベーターに入れます。2~3時間で。繊維ブラストのような主な汚染細胞タイプは、心筋細胞の純粋な分離を可能にする、皿のサービスに付着されます。その後、培養器から皿を取り出し、浮遊心筋細胞を円錐管に集め、ラミニンコーティングされた24ウェルカルチャープレートで心筋細胞を再生した。心筋細胞が表面に付着するのに4〜6時間で十分である。したがって、トランスフェクションはめっき後6時間で行うことができました。RNA IMAXトランスフェクション試薬を使用して、siRNAを用いて心筋細胞を移植した。培養培地には10%FBSを補った25マイクロモル血液スタテンが含まれており、長期心筋細胞培養を行い、増殖解析を誘導するのに適していることが分かりました。トランスフェクション後、マイクロインキュベーターを利用して細胞をタイムラプスイメージング用に顕微鏡で観察して心筋細胞を見ることができます。これらは、低および高倍率でトランスフェクトされた棒状心筋細胞の明視野画像である。ここでは、成人マウス心筋細胞形態の変化を示す日ごとにイメージングを見ることができます。心筋細胞は、D分化と長期培養後だけでなく、早期の時点で健康で収縮性があることを確認します。以下は、トランスフェクションであるsiRNA後の培養における成体心筋細胞の誘発増殖を実証するKi67免疫蛍光染色の例です。この技術を用いた結果からわかるように、マウスとラットから健康な成人心筋細胞を得て、長期的な研究のために培養することができます。結論として、この技術を習得すれば、現在の培養プロトコルをはるかに超えて心筋細胞を研究することができます。

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

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Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

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Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

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Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

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Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

新生仔マウス心筋細胞の単離および培養

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Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

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Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

マウス心筋細胞の単離と生理解析

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Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

成体マウス切歯から歯科上皮幹細胞の単離および培養

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

細胞シグナリングのための成体マウスの心筋細胞の単離と文化<em&gt; in vitroで</em&gt;心肥大

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...