Name: isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Institutt for patologi og laboratoriemedisin, University of Cincinnati, College of Medicine, til Dr. Onur Kanisicak; et stipend fra National Institutes of Health (R01HL148598) til Dr. Onur Kanisicak. Dr. Onur Kanisicak støttes av American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr. Perwez Alam støttes av American Heart Association postdoktorstipend (AHA_20POST35200267). Dr Malina J. Ivey støttes av et NIH T32-stipend (HL 125204-06A1).

Alle eksperimenter bør utføres i samsvar med retningslinjene i Veiledningen for omsorg og bruk av laboratoriedyr publisert av U.S. National Institute of Health (NIH). Alle protokollene som vises i videoen ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Cincinnati, College of Medicine.
1. Forberedelse før hjerteutvinning fra voksne mus (og rotter)
<ol><li>Forbered den tilsvarende perfusjonen, enzymet og stoppløsningene, i henhold til oppskriftene gitt...

<ol>
	<li>van Amerongen, M. J., Engel, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+cardiomyocyte+proliferation+and+its+potential+for+cardiac+regeneration.">Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).</li><li>Parente, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+cardiac+injury+and+regeneration+in+zebrafish+adult+heart.">Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart.</a> PLoS One. 8, 53748 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+capacity+of+zebrafish+reverses+cardiac+failure+caused+by+genetic+cardiomyocyte+depletion.">The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion.</a> Development. 138, 3421-3430 (2011).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes.">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).</li><li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+function+in+mammalian+cardiac+myocytes.">T-tubule function in mammalian cardiac myocytes.</a> Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).</li><li>M&#252;ller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor.">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+ischemic+heart+disease:+novel+carriers+for+bioinformation.">Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).</li><li>Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cardiokines+in+Heart+Diseases:+Beneficial+or+Detrimental.">The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental.</a> BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).</li><li>Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+cardiomyocytes+in+culture+A+model+system+to+study+the+plasticity+of+the+differentiated+cardiac+phenotype+at+the+molecular+and+cellular+levels.">Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).</li><li>Alam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Senescence-Associated+Genes+Rb1+and+Meis2+in+Adult+Cardiomyocytes+Results+in+Cell+Cycle+Reentry+and+Cardiac+Repair+Post-Myocardial+Infarction.">Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-210-mediated+proliferation,+survival,+and+angiogenesis+promote+cardiac+repair+post+myocardial+infarction+in+rodents.">MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents.</a> Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).</li><li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+ascending:+perspectives+for+human-disease+models.">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Schl&#252;ter, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cultivation+of+Adult+Rat+Cardiomyocytes.">Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119, 909-920 (2016).</li><li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy.">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).</li><li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes.">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).</li><li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li><li>Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+specifically+inhibits+actin-myosin+interaction+in+mouse+cardiac+muscle.">Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Sellin, L. C., McArdle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+2,3-butanedione+monoxime.">Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.</a> Pharmacology &amp; Toxicology. 74, 305-313 (1994).</li></ol>

Det er et kritisk behov for å etablere en protokoll for voksen kardiomyocyte isolasjon og langsiktig kultur for å utføre cellespesifikke mekanistiske studier. Det er bare noen få rapporter som diskuterer voksne CM isolasjonsprotokoller, og enda færre av dem brukes til langsiktig kultur av voksne mus CM15,16,17. Det er vist at den voksne rotte CM har en høyere toleranse for in vitro kultur enn de voksne musene CM<sup class=...

Hjertesykdommer er en av de viktigste dødsårsakene over hele verden. Nesten alle typer hjerteskader resulterer i et betydelig tap av voksne kardiomyocytter (CMs). Voksne pattedyrhjerter er ikke i stand til å reparere hjerteskaden på grunn av den senescent naturen til den voksne CM1. Dermed resulterer enhver fornærmelse mot det voksne pattedyrhjertet i et permanent tap av CMs, noe som fører til redusert hjertefunksjon og hjertesvikt. I motsetning til voksne pattedyr, kan små dyr som sebrafisk og newt hjerter regenerere hjerteskaden gjennom eksisterende CM-spredning2,,3,,4. En verdensomspennende innsats pågår for å finne en ny terapeutisk intervensjon for hjerteskade via både proliferative og ikke-proliferative tilnærminger. I de siste tiårene har ulike typer genetiske musemodeller blitt utviklet for å studere hjerteskade og reparasjon. Men ved hjelp av in vivo dyremodeller fortsetter å være en dyr tilnærming med den ekstra kompleksiteten for å tyde en celle-autonom mekanisme fra sekundære effekter. Dessuten er in vivo-systemer utfordrende å analysere CM-spesifikke effekter av en farmakologisk intervensjon som induserer kardiobeskyttende signalering fra CM.
Videre er den langsiktige kulturen av voksne CMs nødvendig for å utføre CM spredningsanalyser. CM spredningsanalyser krever minst 4-5 dager for celler som skal induseres i cellesyklusen og for å få nøyaktige data etter det. I tillegg er studier som benytter isolerte CMs for elektrofysiologiske studier, legemiddelscreening, toksisitetsstudier og Ca++ homeostasestudier alle behov for et forbedret kultursystem5,,6,,7. Videre viser nyere studier kardiobeskyttende betydning av cytokiner utskilles fra CMs (cardiokines)8,9. For å undersøke den terapeutiske rollen og molekylære mekanismen til disse kardiokinene under hjertereparasjon og regenerering, er det nødvendig med en langvarig kultur.
Voksen rotte CMs er robust nok for encellede isolasjon og langsiktig kultur i et in vitro system10,11,12. Imidlertid er voksne mus CMs av stor interesse for in vitro-analyser, på grunn av tilgjengeligheten av en rekke genmodifiserte musemodeller, noe som gjør det mulig å designe og utføre ulike innovative analyser som ikke er mulige med rotte CM13. I motsetning til voksen rotte CM isolasjon, er det ganske utfordrende å få en encellede suspensjon fra voksne musehjerter, og den langsiktige kulturen av voksne mus CMs i kultur er enda mer utfordrende.
Voksen CM isolasjon fra mus og rotte hjerter ved hjelp av en Langendorff system har tidligere blitt etablert for å studere CMfunksjon 5,14,15. Her har vi beskrevet i detalj protokollene for voksen CM-isolasjon fra både rotter og mus, samt en modifisert langsiktig kultur, transinfeksjon og CM-spredning av isolerte celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butane Dione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>B1387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-miR-67</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene weighing dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z154881-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>PSLAB-018285-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Mouse Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>24352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229865+5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siMeis2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s161030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRb1</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s128325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Blunt/SharpDissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Very Fine Precision Tip Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16-100-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8158-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3006S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes

Ex vivo kultur av voksne pattedyr kardiomyocytter (CMs) presenterer det mest relevante eksperimentelle systemet for in vitro studiet av hjertebiologi. Voksne pattedyr-CMs er terminalt differensierte celler med minimal proliferativ kapasitet. Den post-mitotiske tilstanden til voksne CMs begrenser ikke bare kardiomyocyte celle syklus progresjon, men begrenser også den effektive kulturen av CMs. Videre er den langsiktige kulturen i voksne CMs nødvendig for mange studier, for eksempel CM spredning og analyse av genuttrykk.
Musen og rotten er de to mest foretrukne laboratoriedyrene som skal brukes til kardiomyocyteisolering. Mens den langsiktige kulturen av rotte CMs er mulig, er voksne mus CMs utsatt for døden og kan ikke dyrkes mer enn fem dager under normale forhold. Derfor er det et kritisk behov for å optimalisere celleisolasjonen og den langsiktige kulturprotokollen for voksne murine CMs. Med denne modifiserte protokollen er det mulig å isolere og kultur både voksne mus- og rotte-CMs i mer enn 20 dager. Videre er siRNA transfection effektiviteten av isolert CM betydelig økt sammenlignet med tidligere rapporter. For voksen mus CM isolasjon benyttes Langendorff perfusjonsmetoden med en optimal enzymløsning og tilstrekkelig tid for fullstendig ekstracellulær matrisedissosiasjon. For å oppnå rene ventrikulære CMs, ble begge atria dissekert og forkastet før de fortsatte med disassociation og plating. Cellene ble spredt på en lamininbelagt plate, noe som tillot effektiv og rask feste. CMs fikk lov til å bosette seg for 4-6 h før siRNA transfection. Kulturmedier ble oppdatert hver 24 timer i 20 dager, og deretter ble CMs fikset og farget for hjertespesifikke markører som Troponin og markører for cellesyklus som KI67.

Den nåværende modifiserte protokollen muliggjør effektiv isolasjon og kultur av rotte og mus CMs in vitro. For rotte CM isolasjon ble totalt 3 voksne (12 uker gamle) hann Fischer 344 rotter brukt i prosedyren. Figur 1 viser kirurgisk apparat og isolasjonsoppsett som kreves i prosedyren; hver del er merket og beskrevet i figurlegenden. Kollagnase type 2 ble brukt til fordøyelsen, noe som gir en høy mengde høykvalitets CMs fra vellykket isolasjon (Figur 2A)....

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Her presenterer vi en protokoll for isolasjon, transfection og langsiktig kultur av voksen mus og rotte kardiomyocytter.

Isolasjon, transfection, og langsiktig kultur av voksen mus og rotte kardiomyocytter

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Målet med denne videoen er å demonstrere en standardisert protokoll for voksen kardiomyocytes isolasjon, langsiktig kultur og transfection. Isolere og kultivere kardiomyocytter fra mus eller rotte fortsetter å være en viktig metode for å undersøke cellens autonome biologi av kardiomyocytter i det sunne og sykdomshjertet. Det er flere spørsmål vi kan svare på ved hjelp av isolerte kardiomyocytter.Som det proliferative potensialet. Det er endringer i genuttrykk eller spesifikke cytokinuttrykk ved skaderespons. Dessverre overlever mus cardiomyocytes ikke forbi en uke under normale kulturforhold.Derfor, i denne videoen, beskriver vi en optimalisert metode for å isolere voksne mus kardiomyocytter, transfixed dem og kultivert dem langt utover 21 dager, er denne teknikken i utgangspunktet vanskelig å mestre. Men med praksis kan man oppnå ca 80 til 90% overleve i kardiomyocytter etter isolasjon og om en 100 prosent transfection effektivitet. Og de fleste av disse kardiomyocytter i riktige forhold kan overleve de siste 20 dagene.Rengjør og steriliser kirurgiske instrumenter ved å slikke dem i 70% alkohol i 15 minutter og deretter vaske dem med dobbelt destillert vann. Etter vannet, la verktøyene i luften tørke neste, rengjør overflodsapparatet ved å kjøre 70% alkohol to ganger i fem minutter hver. Å øke strømningshastigheten vil bidra til å rense slangen etter at alkohol skyller ut gjenværende alkohol ved å kjøre dobbelt destillert vann i 10 minutter.sette opp tre retter for å rense hjertet etter eksisjon. Fyll hver av rettene med 20 milliliter myocyttbuffer. Legg to til tre dråper heparin til hver tallerken med Pasteur pipette og bland Godt ved å pipetter opp og ned flere ganger.Ta en 10 milliliter sprøyte og fyll den med myocyttbuffer. Fjern noen av luftboblene fra sprøyten og legg den i tredje tallerken i vinklet posisjon, og fest den med tape. Forbered en løs knute med kirurgisk sutur og plasser den rundt nålen.Injiser musen med heparin gjennom IP-injeksjon 20 minutter før anestesi. Sirkuler myocytt-profusionbufferen gjennom profusionapparatet med en strømningshastighet på tre milliliter per minutt. Etter fem minutter, erstatt profusionbufferen med enzymløsning, metter enzymløsningen med oksygen under prosessen, igjen, sett enzymløsningen til en strømningshastighet på tre ml per minutt.Bekreft anestesi ved tåklemming og plasser musen på den kirurgiske plattformen. Steriliser huden med 70% alkohol. Åpne forsiktig brystet, tren hjertet og legg hjertet i den første parabolen.Fjern blodet fra hjertet ved mild klemming, og overfør deretter hjertet til den andre parabolen for å ytterligere rense blodet fra hjertet og fjerne eventuelle ikke-hjertevev. Deretter overfører du hjertet til den tredje parabolen. Finn aorta og bruk tangen din til å holde den Peyton mer plassere den rundt kanylering nålen.Fest den ved å trekke ned din pre stramme knute stramming og deretter lage en ny knute. For ytterligere stabilitet fikse rekkefølgen og plasser ved hjelp av et klipp. Trim overflødig suturtråd, og til slutt starte hjertespøsjonen ved hjelp av myocyttbufferen i sprøyten for å fjerne noe av blodet som er igjen i hjertet.Fjern forsiktig beregningsnålen fra sprøyten og koble den til profusionapparatet. Forsøk på å hindre at luftbobler går inn i hjertet. Da dette kan påvirke flyten av enzymoppløsningen og fordøyelsen.Flytt vannjakken opp, for å gi et homogent miljø til hjertet under overflod. La enzymoppløsningen strømme gjennom hjertet med en hastighet på to til tre ml per minutt. La enzymoppløsningen strømme gjennom hjertet i to minutter.På to minutter, bland i 40 mikroliter av hundre mikromoskalsiumkloridoppløsning til enzymoppløsningen. La enzymløsningen passere gjennom hjertet i ytterligere 10 til 15 minutter. Når strømmen blir glatt og hjertet begynner å se brunt og mykt ut, vet du at du har en jevn fordeling av kollagenaseenzymet for å oppnå riktig fordøyelse av hjertet.Når du tror fordøyelsen er fullført, ta hjertet ned fra Langendorff perfusjonssystemet og legg det inn i en 16 millimeter petriskål fylt med fem milliliter enzymløsning og ta det til en biosikkerhetsfot. Fjern forsiktig atria og ekstra fettvev. Hakke hjertet i definerte stykker ved hjelp av tang.Ta en steril Pasteur pipette og kutt spissen ved 45 grader. Bruk Pasteur pipetten til å bryte opp hjertevevet ved mild pipettering opp og ned. Optimal fordøyelse gir en suspensjon av encellede kardiomyocytter etter at legge fem milliliter stoppløsning for å stoppe enzymet aktivitet for å unngå over fordøyelsen, Ta en første 50 milliliter konisk rør og plassere en steril hundre mikron celle sil på den.Pass kardiomyocytt suspensjon gjennom cellesilen for å fjerne store biter av vev. Til slutt vask silen med stoppløsning for å samle eventuelle vedlagte kardiomyocytterrester. Sentrifuger cellefjæringen ved 20 GS i tre minutter og kast supernatanten.Re suspendere kardiomyocytter og 10 milliliter stoppløsning, med tre minutters intervaller ved 10 mikroliter på 100 ml kalsiumkloridløsning fire ganger og bland. Etter den fjerde utgaven sentrifuge cardiomyocytes suspensjon på 20 GS i tre minutter og kaste supernatant. Re suspendere kardiomyocytter i kultur media Pre plate cellene i en 60 millimeter parabolen og satt i CO2 inkubator i to til tre timer.Om to til tre timer. De viktigste forurensningscelletypene som fibereksplosjoner vil bli overholdt tjenesten av parabolen, noe som åpner for ren isolering av kardiomyocytter. Deretter tar du parabolen ut av inkubatoren og samler de flytende kardiomyocytene i et konisk rør og spilte kardiomyocytter i en lamininbelagt 24 brønnkulturplate.Fire til seks timer er tilstrekkelig for kardiomyocytter å holde seg til overflaten. Så transfection kunne utføres på seks timer etter plating. RNA IMAX transfection reagens ble brukt til å transplantere kardiomyocytter med siRNAs.Kulturmediene inneholder 25 mikromolarblod Staten supplert med 10% FBS, som vi har funnet er bedre egnet til å utføre langsiktig kardiomyocyte kultur og indusere spredningsanalyse. Etter transfection, kan du se kardiomyocytter ved mikroskopi ved hjelp av en mikro inkubator til hvordan er cellene for time-lapse imaging. Dette er brightfield bilder av transfected stang formet kardiomyocytter ved lav og høy forstørrelse.Her kan du se dag for dag bildebehandling, som viser endringer i voksen mus kardiomyocyte morfologi. Vi bekrefter at kardiomyocytter er sunne og kontraktile på tidlige tidspunkter, samt etter D differensiering og langsiktig kultur. Her er et eksempel på Ki67 immunofluorescent farging demonstrere indusert spredning av voksne kardiomyocytter i kultur etter siRNAs, en transfection.Som du kan se fra resultatene ved hjelp av denne teknikken, kan man få sunne voksne kardiomyocytter fra mus og rotte og kultur dem for langsiktig studie. Til slutt, når mestret denne teknikken vil tillate oss å studere kardiomyocytter langt utover dagens culturing protokoller.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Enkelt Cell transcriptional Profilering av Adult Mouse cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rat Nedsatt Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Anrikning av Spermatogonial Stem og stamceller (SSCS) i Kultur for Utledning av langsiktige Voksen Mus SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolasjon og kultur av Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolasjon, Kultur, og Funksjonell karakterisering av voksne musen Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolasjon og fysiologiske Analyse av Muse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolasjon og kultur av Dental Epiteliale stamceller fra voksne musen Fortann

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolasjon og kultur av voksne musen Cardiomyocytes for Cell Signaling og<em&gt; In vitro</em&gt; Cardiac Hypertrofi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...