Name: isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por financiamento do Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial da Universidade de Cincinnati, Faculdade de Medicina, ao Dr. Onur Kanisicak; uma subvenção dos Institutos Nacionais de Saúde (R01HL148598) ao Dr. Onur Kanisicak. Dr. Onur Kanisicak é apoiado pelo American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). O Dr. Perwez Alam é apoiado pela bolsa de pós-doutorado da American Heart Association (AHA_20POST35200267). Dr. Malina J. Ivey é apoiada por uma bolsa NIH T32 (HL 125204-06A1).

Todos os experimentos devem ser realizados de acordo com as diretrizes do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA (NIH). Todos os protocolos exibidos no vídeo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Cincinnati, Faculdade de Medicina.
1. Preparação antes da extração cardíaca de camundongos adultos (e ratos)
<ol><li>Prepare as soluções correspondentes de perfusão...

<ol>
	<li>van Amerongen, M. J., Engel, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+cardiomyocyte+proliferation+and+its+potential+for+cardiac+regeneration.">Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).</li><li>Parente, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+cardiac+injury+and+regeneration+in+zebrafish+adult+heart.">Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart.</a> PLoS One. 8, 53748 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+capacity+of+zebrafish+reverses+cardiac+failure+caused+by+genetic+cardiomyocyte+depletion.">The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion.</a> Development. 138, 3421-3430 (2011).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes.">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).</li><li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+function+in+mammalian+cardiac+myocytes.">T-tubule function in mammalian cardiac myocytes.</a> Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).</li><li>M&#252;ller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor.">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+ischemic+heart+disease:+novel+carriers+for+bioinformation.">Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).</li><li>Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cardiokines+in+Heart+Diseases:+Beneficial+or+Detrimental.">The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental.</a> BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).</li><li>Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+cardiomyocytes+in+culture+A+model+system+to+study+the+plasticity+of+the+differentiated+cardiac+phenotype+at+the+molecular+and+cellular+levels.">Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).</li><li>Alam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Senescence-Associated+Genes+Rb1+and+Meis2+in+Adult+Cardiomyocytes+Results+in+Cell+Cycle+Reentry+and+Cardiac+Repair+Post-Myocardial+Infarction.">Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-210-mediated+proliferation,+survival,+and+angiogenesis+promote+cardiac+repair+post+myocardial+infarction+in+rodents.">MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents.</a> Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).</li><li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+ascending:+perspectives+for+human-disease+models.">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Schl&#252;ter, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cultivation+of+Adult+Rat+Cardiomyocytes.">Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119, 909-920 (2016).</li><li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy.">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).</li><li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes.">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).</li><li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li><li>Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+specifically+inhibits+actin-myosin+interaction+in+mouse+cardiac+muscle.">Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Sellin, L. C., McArdle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+2,3-butanedione+monoxime.">Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.</a> Pharmacology &amp; Toxicology. 74, 305-313 (1994).</li></ol>

Há uma necessidade crítica de estabelecer um protocolo para o isolamento do cardiomiócito adulto e cultura de longo prazo para realizar estudos mecanicistas específicos para células. Existem apenas alguns relatórios discutindo protocolos de isolamento cm adulto, e ainda menos deles são usados para a cultura de longo prazo de camundongos adultos CM15,,16,17. É demonstrado que o cm de rato adulto tem maior tolerância à c...

As doenças cardíacas são uma das principais causas de morte em todo o mundo. Quase todos os tipos de lesão cardíaca resultam em uma perda significativa de cardiomiócitos adultos (CMs). Corações de mamíferos adultos são incapazes de reparar sua lesão cardíaca devido à natureza senescente do cmadulto 1. Assim, qualquer insulto ao coração mamífero adulto resulta em uma perda permanente de CMs, levando à redução da função cardíaca e insuficiência cardíaca. Ao contrário dos mamíferos adultos, pequenos animais como zebrafish e newt hearts podem regenerar sua lesão cardíaca através da proliferação cm existente2,3,4. Um esforço mundial está em andamento para encontrar uma nova intervenção terapêutica para lesões cardíacas através de abordagens proliferativas e não proliferativas. Nas últimas décadas, vários tipos de modelos genéticos de camundongos foram desenvolvidos para estudar lesões cardíacas e reparos. No entanto, o uso de modelos in vivo animal continua a ser uma abordagem cara com a complexidade adicional para decifrar um mecanismo de célula-autônoma a partir de efeitos secundários. Além disso, os sistemas in vivo são desafiadores para analisar os efeitos específicos do CM de uma intervenção farmacológica que induz a sinalização cardioprotetora do CM.
Além disso, a cultura de longo prazo dos CMs adultos é necessária para realizar análises de proliferação de CM. Os ensaios de proliferação de CM requerem um mínimo de 4-5 dias para que as células sejam induzidas no ciclo celular e obtenham dados precisos depois disso. Além disso, estudos que utilizam CMs isolados para estudos eletrofisiológicos, triagem de medicamentos, estudos de toxicidade e estudos de homeostase Ca++ estão todos precisando de um sistema de cultura melhorado5,,6,7. Além disso, estudos recentes mostram a significância cardioprotetora das citocinas secretadas dos CMs (cardiocinas)8,9. Para investigar o papel terapêutico e o mecanismo molecular desses cardiocinas durante a reparação e regeneração cardíaca, é necessária uma cultura prolongada.
CMs de ratos adultos são robustos o suficiente para isolamento de células únicas e cultura de longo prazo em um sistema in vitro10,,11,,12. No entanto, os CMs de mouse adultos são de grande interesse para ensaios in vitro, devido à disponibilidade de uma variedade de modelos de mouse geneticamente modificados, o que permite o design e a execução de várias análises inovadoras que não são possíveis com o rato CM13. Em contraste com o isolamento cm de ratos adultos, é bastante desafiador obter uma suspensão unicelular de corações de ratos adultos, e a cultura de longo prazo de CMs de camundongos adultos na cultura é ainda mais desafiadora.
O isolamento cm adulto de corações de camundongos e ratos usando um sistema Langendorff foi previamente estabelecido para estudar a função CM5,,14,15. Aqui, descrevemos em detalhes os protocolos para o isolamento de CM adultos de ratos e camundongos, bem como uma cultura modificada a longo prazo, transfecção e proliferação de CM de células isoladas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butane Dione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>B1387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-miR-67</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene weighing dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z154881-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>PSLAB-018285-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Mouse Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>24352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229865+5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siMeis2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s161030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRb1</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s128325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Blunt/SharpDissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Very Fine Precision Tip Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16-100-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8158-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3006S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes

A cultura ex vivo dos cardiomiócitos mamíferos adultos (CMs) apresenta o sistema experimental mais relevante para o estudo in vitro da biologia cardíaca. Os CMs de mamíferos adultos são células terminais diferenciadas com capacidade proliferativa mínima. O estado pós-mitótico dos CMs adultos não só restringe a progressão do ciclo celular cardiomiócito, mas também limita a cultura eficiente dos CMs. Além disso, a cultura de longo prazo dos CMs adultos é necessária para muitos estudos, como a proliferação de CM e a análise da expressão genética.
O rato e o rato são os dois animais de laboratório mais preferidos para serem usados para o isolamento cardiomiócito. Embora a cultura de longo prazo dos CMs de ratos seja possível, os CMs de camundongos adultos são suscetíveis à morte e não podem ser cultivados por mais de cinco dias em condições normais. Portanto, há uma necessidade crítica de otimizar o isolamento celular e o protocolo de cultura de longo prazo para CMs murine adultos. Com este protocolo modificado, é possível isolar e cultivar com sucesso tanto os CMs de ratos adultos quanto os de ratos por mais de 20 dias. Além disso, a eficiência de transfecção do SIRNA de CM isolado é significativamente aumentada em relação aos relatórios anteriores. Para o isolamento cm do rato adulto, o método de perfusão langendorff é utilizado com uma solução enzimática ideal e tempo suficiente para dissociação completa da matriz extracelular. Para obter CMs ventriculares puros, ambos os átrios foram dissecados e descartados antes de prosseguir com a dissociação e o revestimento. As células foram dispersadas em uma placa revestida de laminina, o que permitiu uma fixação eficiente e rápida. Os CMs foram autorizados a se contentar com 4-6 h antes da transfecção do siRNA. A mídia cultural foi atualizada a cada 24 horas por 20 dias e, posteriormente, os CMs foram fixados e manchados para marcadores específicos cardíacos, como troponina e marcadores do ciclo celular, como KI67.

O protocolo modificado atual permite o isolamento eficiente e a cultura de CMs de ratos e ratos in vitro. Para o isolamento do CM do rato, foram utilizados no procedimento um total de 3 adultos (12 semanas de idade) macho Fischer 344 ratos. A Figura 1 mostra o aparelho cirúrgico e as configurações de isolamento que são necessárias no procedimento; cada parte foi marcada e descrita na lenda da figura. A colagenase tipo 2 foi utilizada para digestão, o que produz uma alta quantidade de C...

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Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento, transfecção e cultura de longo prazo de cardiomiócitos adultos de camundongos e ratos.

Isolamento, Transfecção e Cultura de Longo Prazo de Cardiomiócitos de Ratos Adultos e Ratos

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

O objetivo deste vídeo é demonstrar um protocolo padronizado para isolamento de cardiomiócitos adultos, cultura de longo prazo e transfecção. Isolar e cultivo de cardiomiócitos de camundongos ou ratos continuam a ser um método essencial para investigar a biologia autônoma celular de cardiomiócitos dentro do coração saudável e da doença. Há várias perguntas que podemos responder usando cardiomiócitos isolados.Como o potencial proliferativo. Há alterações de expressão genética ou expressões específicas de citocinas após a resposta à lesão. Infelizmente, os cardiomiócitos do rato não sobrevivem depois de uma semana em condições normais de cultura.Portanto, neste vídeo, descrevemos um método otimizado para isolar cardiomiócitos de camundongos adultos, transfixá-los e cultuá-los bem além de 21 dias, essa técnica é inicialmente difícil de dominar. Mas com a prática pode-se alcançar cerca de 80 a 90% sobreviver em cardiomiócitos após o isolamento e cerca de 100% de eficiência de transfecção. E a maioria desses cardiomiócitos em condições corretas pode sobreviver depois de 20 dias.Limpe e esterilize seus instrumentos cirúrgicos, absorvendo-os em 70% de álcool por 15 minutos e, posteriormente, lavando-os com água dupla destilada. Depois da água, deixe as ferramentas no ar para secar em seguida, limpe o aparelho de profusão executando 70% de álcool duas vezes por cinco minutos cada. O aumento da vazão ajudará a limpar a tubulação depois que o álcool enxaguar qualquer álcool restante, executando água duplamente destilada por 10 minutos.configurar três pratos para limpar o coração após a excisão. Encha cada um dos pratos com 20 mililitros de tampão de miócito. Adicione duas a três gotas de heparina em cada prato com a pipeta Pasteur e misture Bem, pipetando para cima e para baixo várias vezes.Pegue uma seringa de 10 mililitros e encha-a com tampão de miócito. Remova qualquer uma das bolhas de ar da seringa e coloque-a no terceiro prato em uma posição angular, fixando-a com fita. Prepare um Nó solto com sutura cirúrgica e coloque-o ao redor da agulha.Injete heparina no mouse através de injeção IP 20 minutos antes da anestesia. Circule o tampão de profusão miócida através do aparelho de profusão a uma taxa de fluxo de três mililitros por minuto. Após cinco minutos, substitua o tampão de profusão por solução enzimápica, saturar a solução enzimápica com oxigênio durante o processo, novamente, definir a solução enzimápica para uma taxa de fluxo de três mLs por minuto.Confirme a anestesia pelo dedo do pé e coloque o mouse na plataforma cirúrgica. Esterilize a pele com 70% de álcool. Abra cuidadosamente o peito, exercite o coração e coloque o coração no primeiro prato.Limpe o sangue do coração apertando suavemente, em seguida, transfira o coração para o segundo prato para limpar ainda mais o sangue do coração e remover quaisquer tecidos não cardíacos. Posteriormente transfira o coração para o terceiro prato. Encontre a aorta e use seus fórceps para mantê-la Peyton mais colocando-a em torno da agulha canulante.Fixá-lo puxando para baixo o seu nó pré-apertado apertando e, em seguida, fazendo um segundo nó. Para estabilidade adicional fixe o pedido e coloque com a ajuda de um clipe. Corte qualquer fio de sutura em excesso, e finalmente inicie a profusão cardíaca usando o tampão de miócito na seringa para limpar qualquer sangue restante no coração.Remova cuidadosamente a agulha calculista da seringa e corte-a ao aparelho de profusão. Tente evitar que bolhas de ar entrem no coração. Como isso pode afetar o fluxo da solução esnzimada e digestão.Mova a jaqueta de água para cima, para fornecer um ambiente homogêneo ao coração durante a profusão. Permita que a solução enzimápica flua pelo coração com uma velocidade de dois a três mLs por minuto. Deixe a solução enzimápica fluir pelo coração por dois minutos.Em dois minutos, misture em 40 microliters de uma centena de solução de cloreto de cálcio micromolar à solução enzimápica. Deixe a solução enzimápica passar pelo coração por mais 10 a 15 minutos. Uma vez que o fluxo se torna suave e o coração começa a parecer marrom e macio, você sabe que você tem uma distribuição uniforme da enzima colagenase para obter a digestão adequada do coração.Quando você acha que sua digestão está completa, retire o coração do sistema de perfusão langendorff e coloque-o em uma placa de Petri de 16 milímetros cheia de cinco mililitros de solução enzimada e leve-o a um pé de biossegurança. Remova cuidadosamente a atria e o tecido adiposo extra. Pique o coração em pedaços definidos com a ajuda de fórceps.Pegue uma pipeta Pasteur estéril e corte a ponta a 45 graus. Use a pipeta Pasteur para quebrar o tecido cardíaco por canos suaves para cima e para baixo. A digestão ideal fornece uma suspensão de cardiomiócitos celulares únicos depois que adicionar cinco mililitros de solução de parada para parar a atividade enzimática para evitar a digestão excessiva, Pegue um primeiro tubo cônico de 50 mililitros e coloque um coador de células de cem mícrons estéreis sobre ele.Passe a suspensão do cardiomiócito através do coador celular para remover quaisquer grandes pedaços de tecido. Por fim, lave o coador com solução stop para coletar restos de cardiomiócitos anexados. Centrifugar a suspensão da célula a 20 GS por três minutos e descartar o supernatante.Suspender os cardiomiócitos e 10 mililitros de solução de parada, em intervalos de três minutos a 10 microlitadores de 100 milimilas de solução de cloreto de cálcio quatro vezes e misturar. Após a quarta edição, centrifufique a suspensão dos cardiomiócitos a 20 GS por três minutos e descarte o supernatante. Suspenda os cardiomiócitos na mídia cultural Pré emplaque as células em um prato de 60 milímetros e coloque na incubadora de CO2 por duas a três horas.Em duas ou três horas. Os principais tipos de células contaminantes, como explosões de fibras, serão aderidos ao serviço do prato, permitindo o puro isolamento dos cardiomiócitos. Depois disso, tire o prato da incubadora e colete os cardiomiócitos flutuantes em um tubo cônico e reproduza os cardiomiócitos em uma placa de cultura revestida de laminina 24 bem.Quatro a seis horas é suficiente para os cardiomiócitos aderirem à superfície. Assim, a transfecção poderia ser realizada seis horas após o revestimento. O reagente de transfecção RNA IMAX foi utilizado para transplantar cardiomiócitos com siRNAs.A mídia cultural contém 25 sangues micromolar Staten complementado com 10% FBS, o que descobrimos ser mais adequado para realizar cultura de cardiomiócito de longo prazo e induzir análises de proliferação. Após a transfecção, você pode ver os cardiomiócitos utilizando uma micro incubadora para como estão as células para imagens de lapso de tempo. Estas são imagens de campo brilhante de cardiomiócitos em forma de vara transfeinada em baixa e alta ampliação.Aqui, você pode ver imagens do dia a dia, que mostram alterações na morfologia cardiomiocócica do rato adulto. Confirmamos que os cardiomiócitos são saudáveis e contratuais em momentos iniciais, bem como após a diferenciação D e cultura de longo prazo. Aqui está um exemplo de coloração imunofluorescente Ki67 demonstrando proliferação induzida de cardiomiócitos adultos na cultura após siRNAs, uma transfecção.Como você pode ver pelos resultados usando esta técnica, pode-se obter cardiomiócitos adultos saudáveis de camundongos e ratos e cultuá-los para estudo de longo prazo. Em conclusão, uma vez dominada essa técnica nos permitirá estudar cardiomiócitos muito além dos protocolos de cultivo atuais.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

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Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Biologia

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Longo prazo Cultura de Amostras de mama Humano do Câncer e sua análise por meio de tomografia óptica de Projeção

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Profiling única célula transcricional dos cardiomiócitos de rato adulto

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolamento e cultura primária de células hepáticas de ratos

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

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Enriquecimento de série-tronco de esperma e células progenitoras (SSC) em Cultura para Derivação de longo prazo Adultos Linhas rato SSC

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

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Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

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The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

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Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

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