Name: isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Эта работа была поддержана финансированием от кафедры патологии и лабораторной медицины Университета Цинциннати, Медицинского колледжа, д-ра Онура Канишичака; грант От Национальных институтов здравоохранения (R01HL148598) доктору Онуру Канисаку. Д-р Онур Kanisicak поддерживается Американской ассоциации сердца Карьера развития премии (18CDA34110117). Д-р Perwez Алам поддерживается Американской ассоциации сердца постдокторской грант (AHA_20POST35200267). Д-р Малина Айви поддерживается грантом NIH T32 (HL 125204-06A1).

Все эксперименты должны проводиться в соответствии с руководящими принципами Руководства по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованными Национальным институтом здравоохранения США (NIH). Все протоколы, отображаемые в видео, были одобрены Институциональным комитетом ...

<ol>
	<li>van Amerongen, M. J., Engel, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+cardiomyocyte+proliferation+and+its+potential+for+cardiac+regeneration.">Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).</li><li>Parente, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+cardiac+injury+and+regeneration+in+zebrafish+adult+heart.">Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart.</a> PLoS One. 8, 53748 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+capacity+of+zebrafish+reverses+cardiac+failure+caused+by+genetic+cardiomyocyte+depletion.">The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion.</a> Development. 138, 3421-3430 (2011).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes.">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).</li><li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+function+in+mammalian+cardiac+myocytes.">T-tubule function in mammalian cardiac myocytes.</a> Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).</li><li>M&#252;ller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor.">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+ischemic+heart+disease:+novel+carriers+for+bioinformation.">Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).</li><li>Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cardiokines+in+Heart+Diseases:+Beneficial+or+Detrimental.">The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental.</a> BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).</li><li>Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+cardiomyocytes+in+culture+A+model+system+to+study+the+plasticity+of+the+differentiated+cardiac+phenotype+at+the+molecular+and+cellular+levels.">Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).</li><li>Alam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Senescence-Associated+Genes+Rb1+and+Meis2+in+Adult+Cardiomyocytes+Results+in+Cell+Cycle+Reentry+and+Cardiac+Repair+Post-Myocardial+Infarction.">Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-210-mediated+proliferation,+survival,+and+angiogenesis+promote+cardiac+repair+post+myocardial+infarction+in+rodents.">MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents.</a> Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).</li><li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+ascending:+perspectives+for+human-disease+models.">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Schl&#252;ter, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cultivation+of+Adult+Rat+Cardiomyocytes.">Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119, 909-920 (2016).</li><li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy.">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).</li><li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes.">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).</li><li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li><li>Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+specifically+inhibits+actin-myosin+interaction+in+mouse+cardiac+muscle.">Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Sellin, L. C., McArdle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+2,3-butanedione+monoxime.">Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.</a> Pharmacology &amp; Toxicology. 74, 305-313 (1994).</li></ol>

Существует критическая необходимость в создании протокола для взрослых кардиомиоцитов изоляции и долгосрочной культуры для выполнения клеточных механистических исследований. Есть только несколько докладов, обсуждающих взрослых ПРОТОКОЛов изоляции CM, и еще меньше из них используют?...

Сердечные заболевания являются одной из ведущих причин смерти во всем мире. Почти все виды сердечных травм приводят к значительной потере взрослых кардиомиоцитов (СМ). Взрослые сердца млекопитающих не в состоянии восстановить свои сердечные травмы из-за старческого характера взрослого CM1. Таким образом, любое оскорбление сердца взрослого млекопитающего приводит к постоянной потере СМ, что приводит к снижению сердечной функции и сердечной недостаточности. В отличие от взрослых млекопитающих, мелкие животные, как зебрафиш и тритон сердца могут регенерировать свои сердечные травмы через существующиеСМ распространения 2,3,4. Во всем мире продолжаются усилия по поиску нового терапевтического вмешательства в связи с сердечной травмой с помощью как пролиферативных, так и нераспространенных подходов. В последние десятилетия, различные типы генетических моделей мыши были разработаны для изучения сердечной травмы и ремонта. Однако использование моделей животных in vivo по-прежнему является дорогостоящим подходом с дополнительной сложностью для расшифровки клеточно-автономного механизма от вторичных эффектов. Кроме того, in vivo системы являются сложными для анализа CM специфические эффекты фармакологического вмешательства, которое вызывает кардиопротекторной сигнализации от СМ.
Кроме того, для проведения анализа распространения СМ необходима долгосрочная культура взрослых СМ. Анализы распространения СМ требуют как минимум 4-5 дней для индуцированных клеток в клеточный цикл и получения точных данных после этого. Кроме того, исследования, которые используют изолированные CMs для электрофизиологических исследований, скрининга наркотиков, исследования токсичности,и Ca й гомеостаза исследования все нуждаются в улучшенной системекультуры 5,6,7. Кроме того, последние исследования показывают кардиопротекторное значение цитокинов, выделяется из СМ (кардиокинов)8,,9. Для того, чтобы исследовать терапевтическую роль и молекулярный механизм этих кардиокинов во время ремонта и регенерации сердца, необходима длительная культура.
Взрослые крысы CMs являются достаточно надежными для одноклеточной изоляции и долгосрочной культуры в системе in vitro10,11,12. Тем не менее, взрослые мыши CMs имеют большой интерес для in vitro анализы, из-за наличия различных генетически модифицированных моделей мыши, что позволяет для разработки и выполнения различных инновационных анализов, которые невозможны с крысой CM13. В отличие от взрослых крыс CM изоляции, это довольно сложно получить одноклеточную подвеску от взрослых сердца мыши, и долгосрочная культура взрослых мыши CMs в культуре является еще более сложной задачей.
Взрослый CM изоляции от мыши и крысы сердца с помощью системы Langendorff ранее была созданадля изучения функцииCM 5,14,15. Здесь мы подробно описали протоколы изоляции взрослых СМ как от крыс, так и от мышей, а также модифицированную долгосрочную культуру, трансфекцию и распространение СМ изолированных клеток.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butane Dione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>B1387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-miR-67</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene weighing dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z154881-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>PSLAB-018285-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Mouse Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>24352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229865+5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siMeis2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s161030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRb1</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s128325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Blunt/SharpDissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Very Fine Precision Tip Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16-100-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8158-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3006S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes

Ex vivo культуры взрослых млекопитающих кардиомиоцитов (CMs) представляет собой наиболее релевантную экспериментальную систему для in vitro исследования сердечной биологии. Взрослые млекопитающие СМ являются неизлечимо дифференцированными клетками с минимальной пролиферативной емкостью. Постмитотическое состояние взрослых CMs не только ограничивает прогрессирование цикла сердечно-миоцитов клеток, но и ограничивает эффективную культуру CMs. Кроме того, долгосрочная культура взрослых CMs необходима для многих исследований, таких как распространение СМ и анализ экспрессии генов.
Мышь и крыса являются двумя наиболее предпочтительными лабораторных животных, которые будут использоваться для кардиомиоцитов изоляции. В то время как долгосрочная культура крысЫ CMs возможно, взрослые мыши CMs восприимчивы к смерти и не могут быть культурно более пяти дней в нормальных условиях. Таким образом, существует критическая необходимость оптимизации изоляции клеток и долгосрочного протокола культуры для взрослых murine CMs. С помощью этого измененного протокола, можно успешно изолировать и культуры как взрослых мыши и крысы CMs в течение более 20 дней. Кроме того, эффективность трансфекции siRNA изолированных СМ значительно возросла по сравнению с предыдущими докладами. Для изоляции мышей-мышей метод перфузии Langendorff используется с оптимальным ферментным раствором и достаточным временем для полной внеклеточной диссоциации матрицы. Для того, чтобы получить чистые желудочковые CMs, как atria были вскрыты и отброшены, прежде чем приступить к разъединению и покрытие. Клетки рассеивались на пластине с ламинином покрытием, что позволяло эффективно и быстро вложения. CMs было разрешено согласиться на 4-6 ч до siRNA трансфекции. Культурные средства массовой информации обновлялись каждые 24 ч в течение 20 дней, а затем, CMs были зафиксированы и окрашены для сердечно-специфических маркеров, таких как Troponin и маркеры клеточного цикла, такие как KI67.

Текущий измененный протокол позволяет эффективно изоляции и культуры крыс и мышей CMs в пробирке. Для крысы CM изоляции, в общей сложности 3 взрослых (12-недельный) мужчина Фишер 344 крысы были использованы в процедуре. Рисунок 1 показывает хирургический аппарат и изоляционны...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Здесь мы представляем протокол изоляции, трансфекции и долгосрочной культуры взрослых мышей и крыс кардиомиоцитов.

Изоляция, трансфекция и долгосрочная культура взрослых мышей и крысиных кардиомиоцитов

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Цель этого видео состоит в том, чтобы продемонстрировать стандартизированный протокол для взрослых кардиомиоцитов изоляции, долгосрочной культуры и трансфекции. Изоляция и культивирование кардиомиоцитов от мыши или крысы по-прежнему является важным методом для исследования клеточной автономной биологии кардиомиоцитов в здоровом и больном сердце. Есть несколько вопросов, на которые мы можем ответить с помощью изолированных кардиомиоцитов.Такие, как потенциал распространения. Есть изменения экспрессии генов или конкретные выражения цитокинов при ответе травмы. К сожалению, мыши кардиомиоциты не выживают последние одну неделю в нормальных условиях культуры.Поэтому в этом видео мы описываем оптимизированный метод изоляции взрослых мышей кардиомиоцитов, замирает их и культурные их далеко за 21 дней, этот метод изначально трудно освоить. Но с практикой можно достичь около 80 до 90% выжить в кардиомиоцитов после изоляции и около 100 процентов эффективности трансинфекции. И большинство из этих кардиомиоцитов в правильных условиях может выжить последние 20 дней.Очистите и стерилизовать хирургические инструменты, замачивая их в 70% алкоголя в течение 15 минут, а затем мыть их двойной дистиллированной водой. После воды, оставьте инструменты в воздухе, чтобы высохнуть дальше, очистить аппарат изобилия, запуская 70% алкоголя в два раза в течение пяти минут каждый. Увеличение скорости потока поможет очистить трубки после алкоголя промыть любой оставшийся алкоголь, запуская двойную дистиллированную воду в течение 10 минут.настроить три блюда, чтобы очистить сердце после иссечения. Заполните каждое из блюд 20 миллилитров буфера миоцитов. Добавить две-три капли гепарина к каждому блюду с пастер пипеткой и смесь Ну, трубопроводов вверх и вниз несколько раз.Возьмите 10 миллилитров шприц и заполнить его с миоцитов буфера. Удалите любой из пузырьков воздуха из шприца и поместите его в третье блюдо в угловое положение, закрепив его лентой. Подготовь свободный узел хирургическим швом и поместите его вокруг иглы.Ввимите мышь гепарином через IP-инъекцию за 20 минут до анестезии. Циркулировать буфер изобилия миоцитов через аппарат изобилия со скоростью потока три миллилитров в минуту. Через пять минут замените обильный буфер ферментным раствором, насытите ферментный раствор кислородом во время процесса, опять же установите ферментный раствор до скорости потока в три мл в минуту.Подтвердите анестезию щипать ногой и поместите мышь на хирургической платформе. Стерилизовать кожу 70% алкоголем. Аккуратно откройте грудь, потрудуйте сердцем и положите сердце в первое блюдо.Очистите кровь от сердца, нежно сжимая, затем перенесите сердце во второе блюдо, чтобы еще больше очистить кровь от сердца и удалить любые несердечные ткани. Впоследствии перенесите сердце на третье блюдо. Найти аорты и использовать типсы, чтобы держать его Пейтон больше размещения его вокруг cannulating иглы.Закрейте его, потянув вниз предварительно жесткий узел ужесточения, а затем сделать второй узел. Для дополнительной стабильности исправьте порядок и место с помощью клипа. Обрезать любой избыток шовной нити, и, наконец, начать изобилие сердца с помощью буфера миоцитов в шприце, чтобы очистить любой из крови, оставшейся в сердце.Аккуратно снимите расчетливную иглу со шприца и подключи ее к аппарату изобилия. Попытка предотвратить любые пузырьки воздуха от вдаваясь в сердце. Как это может повлиять на поток ферментного раствора и пищеварения.Переместив водяной пиджак вверх, чтобы обеспечить однородную среду для сердца во время изобилия. Разрешить ферментный раствор течь через сердце со скоростью от двух до трех мл в минуту. Пусть ферментный раствор течет через сердце в течение двух минут.За две минуты смешайте в растворе фермента 40 микролитров сто раствора хлорида кальция микромолара. Пусть ферментный раствор проходит через сердце еще 10-15 минут. Как только поток становится гладким и сердце начинает выглядеть коричневым и мягким, вы знаете, что у вас есть равномерное распределение фермента коллагеназы для достижения надлежащего пищеварения сердца.Когда вы думаете, что ваше пищеварение завершено, возьмите сердце из системы перфузии Langendorff и поместите его в 16-миллиметровую чашку Петри, наполненную пятью миллилитров ферментного раствора и отвезу его в биобезопасность ноги. Тщательно удалите атрию и жировую ткань. Фарш сердце в определенных частей с помощью типсов.Возьмите стерильный пастер пипетки и сократить его кончик на 45 градусов. Используйте пастер пипетки, чтобы разбить ткани сердца, нежный трубы вверх и вниз. Оптимальное пищеварение обеспечивает суспензию одноклеточных кардиомиоцитов после этого добавить пять миллилитров стоп-раствора, чтобы остановить активность фермента, чтобы избежать переваривания, Возьмите первые 50 миллилитров конической трубки и поместите стерильные сто микрон-клеток ситечко на нем.Пройдите подвеску кардиомиоцитов через ситечко клетки, чтобы удалить любые большие куски ткани. Наконец мыть ситечко с стоп-раствором, чтобы собрать любые прилагается кардиомиоцитов остается. Центрифуга клеточной подвески при 20 GS в течение трех минут и отказаться от супернатанта.Повторно приостановить кардиомиоциты и 10 миллилитров стоп-раствора, с интервалом в три минуты на 10 микролитров 100 миллимолярный раствор хлорида кальция в четыре раза и перемешать. После четвертого издания центрифуга кардиомиоцитов суспензии при 20 GS в течение трех минут и отказаться от супернатанта. Re приостановить кардиомиоцитов в культуре средств массовой информации Предварительная пластина клеток в 60 миллиметров блюдо и положить в инкубатор CO2 в течение двух-трех часов.Через два-три часа. Основные типы загрязняющих клеток, такие как волокна взрывов будут придерживаться службы блюдо, что позволяет для чистой изоляции кардиомиоцитов. После этого вынюхив блюдо из инкубатора и соберите плавающие кардиомиоциты в конической трубке и воспроизвете кардиомиоциты в ламинине, покрытом 24 хорошо культурной пластиной.Четыре-шесть часов достаточно для того, чтобы кардиомиоциты прилиплись к поверхности. Таким образом, трансфекция может быть выполнена через шесть часов после покрытия. Рнк IMAX трансфекции реагент был использован для трансплантации кардиомиоцитов с siRNAs.Культурные средства массовой информации содержит 25 микромоляных крови Staten дополнены 10%FBS, который мы обнаружили, лучше подходит для выполнения долгосрочной культуры кардиомиоцитов и вызвать анализ распространения. После трансфекции, вы можете просматривать кардиомиоциты с помощью микроскопии с использованием микро-инкубатора, как клетки для замедленной визуализации. Это яркие изображения трансфектированных стержней в форме кардиомиоцитов при низком и высоком увеличении.Здесь вы можете увидеть изо дня в день изображения, который демонстрирует изменения во взрослой морфологии сердечно-миоцитов мыши. Мы подтверждаем, что кардиомиоциты являются здоровыми и контрактильными в ранние моменты времени, а также после дифференциации D и долгосрочной культуры. Вот пример Ki67 иммунофлуоресцентного окрашивания демонстрации индуцированного распространения взрослых кардиомиоцитов в культуре после siRNAs, трансфекции.Как вы можете видеть из результатов с помощью этой техники, можно получить здоровые взрослые кардиомиоциты от мыши и крысы и культуры их для долгосрочного изучения. В заключение, после освоения этой техники позволит нам изучать кардиомиоциты далеко за пределами нынешних протоколов культивирования.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Первичные культуры взрослых Миоциты сердца крысы

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Долгосрочные культуры рака молочной железы человека образцов и их анализ с помощью оптической томографии Проекция

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell транскрипции Профилирование взрослых кардиомиоцитов мышь

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Серийный обогащению сперматогониальные стволовых и клеток-предшественников (SSC) в культуре Вывод Долгосрочные взрослых мышей линии Юг-Юг

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Выделение и Культура неонатологическую мыши кардиомиоцитов

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Изоляция, культура и функциональная характеристика взрослой мыши Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Выделение и физиологический анализ мыши кардиомиоцитов

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Выделение и Культура Стоматологическая эпителиальных стволовых клеток из взрослых мышей резца

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Выделение и Культура взрослой мыши кардиомиоцитов для клеточной сигнализации и<em&gt; В пробирке</em&gt; Гипертрофия сердца

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...