Name: isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la financiación del Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad de Cincinnati, Facultad de Medicina, al Dr. Onur Kanisicak; una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (R01HL148598) al Dr. Onur Kanisicak. El Dr. Onur Kanisicak cuenta con el apoyo del American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). El Dr. Perwez Alam cuenta con el apoyo de la subvención postdoctoral de la Asociación Americana del Corazón (AHA_20POST35200267). La Dra. Malina J. Ivey cuenta con el apoyo de una subvención NIH T32 (HL 125204-06A1).

Todos los experimentos deben realizarse de acuerdo con las directrices de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por el Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (NIH). Todos los protocolos mostrados en el video fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Cincinnati, Facultad de Medicina.
1. Preparación antes de la extracción cardíaca de ratones adultos (y ratas)
<ol><li>Preparar las solucione...

<ol>
	<li>van Amerongen, M. J., Engel, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+cardiomyocyte+proliferation+and+its+potential+for+cardiac+regeneration.">Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).</li><li>Parente, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+cardiac+injury+and+regeneration+in+zebrafish+adult+heart.">Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart.</a> PLoS One. 8, 53748 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+capacity+of+zebrafish+reverses+cardiac+failure+caused+by+genetic+cardiomyocyte+depletion.">The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion.</a> Development. 138, 3421-3430 (2011).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes.">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).</li><li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+function+in+mammalian+cardiac+myocytes.">T-tubule function in mammalian cardiac myocytes.</a> Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).</li><li>M&#252;ller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor.">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+ischemic+heart+disease:+novel+carriers+for+bioinformation.">Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).</li><li>Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cardiokines+in+Heart+Diseases:+Beneficial+or+Detrimental.">The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental.</a> BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).</li><li>Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+cardiomyocytes+in+culture+A+model+system+to+study+the+plasticity+of+the+differentiated+cardiac+phenotype+at+the+molecular+and+cellular+levels.">Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).</li><li>Alam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Senescence-Associated+Genes+Rb1+and+Meis2+in+Adult+Cardiomyocytes+Results+in+Cell+Cycle+Reentry+and+Cardiac+Repair+Post-Myocardial+Infarction.">Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-210-mediated+proliferation,+survival,+and+angiogenesis+promote+cardiac+repair+post+myocardial+infarction+in+rodents.">MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents.</a> Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).</li><li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+ascending:+perspectives+for+human-disease+models.">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Schl&#252;ter, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cultivation+of+Adult+Rat+Cardiomyocytes.">Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119, 909-920 (2016).</li><li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy.">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).</li><li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes.">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).</li><li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li><li>Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+specifically+inhibits+actin-myosin+interaction+in+mouse+cardiac+muscle.">Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Sellin, L. C., McArdle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+2,3-butanedione+monoxime.">Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.</a> Pharmacology &amp; Toxicology. 74, 305-313 (1994).</li></ol>

Existe una necesidad crítica de establecer un protocolo para el aislamiento de cardiomiocitos adultos y el cultivo a largo plazo para realizar estudios mecánicos específicos de la célula. Sólo hay unos pocos informes que discuten los protocolos de aislamiento CM adultos, y aún menos de ellos se utilizan para el cultivo a largo plazo de ratones adultos CM15,,16,,17. Se ha demostrado que la rata adulta CM tiene una mayor tol...

Las enfermedades cardíacas son una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Casi todos los tipos de lesiones cardíacas resultan en una pérdida significativa de cardiomiocitos adultos (CM). Los corazones de mamíferos adultos son incapaces de reparar su lesión cardíaca debido a la naturaleza senescente del CM1adulto. Por lo tanto, cualquier insulto al corazón adulto de los mamíferos resulta en una pérdida permanente de CM, lo que conduce a una reducción de la función cardíaca y la insuficiencia cardíaca. A diferencia de los mamíferos adultos, los animales pequeños como el pez cebra y los corazones newt pueden regenerar su lesión cardíaca a través de la proliferación CM existente2,,3,,4. Se está llevando a cabo un esfuerzo mundial para encontrar una nueva intervención terapéutica para lesiones cardíacas a través de enfoques proliferativos y no proliferativos. En las últimas décadas, se han desarrollado varios tipos de modelos genéticos de ratón para estudiar lesiones cardíacas y reparación. Sin embargo, el uso de modelos animales in vivo sigue siendo un enfoque costoso con la complejidad adicional para descifrar un mecanismo autónomo celular de los efectos secundarios. Además, los sistemas in vivo son difíciles de analizar los efectos específicos de CM de una intervención farmacológica que induce la señalización cardioprotectora de la CM.
Además, la cultura a largo plazo de los CM adultos es necesaria para realizar análisis de proliferación de CM. Los ensayos de proliferación de CM requieren un mínimo de 4-5 días para que las células se induzcan en el ciclo celular y obtengan datos precisos después de eso. Además, los estudios que utilizan CM aislados para estudios electrofisiológicos, cribado de fármacos, estudios de toxicidad y estudios de homeostasis Ca++ necesitan un sistema de cultivo mejorado5,,6,,7. Además, estudios recientes muestran la importancia cardioprotectora de las citoquinas secretadas de los CM (cardioquinas)8,9. Con el fin de investigar el papel terapéutico y el mecanismo molecular de estas cardioquinas durante la reparación y regeneración del corazón, se requiere un cultivo prolongado.
Los CM de ratas adultos son lo suficientemente robustos para el aislamiento de una sola célula y el cultivo a largo plazo en un sistema in vitro10,11,12. Sin embargo, los CM de ratón para adultos son de gran interés para los ensayos in vitro, debido a la disponibilidad de una variedad de modelos de ratón modificados genéticamente, lo que permite el diseño y ejecución de diversos análisis innovadores que no son posibles con la rata CM13. En contraste con el aislamiento CM de rata adulta, es bastante difícil obtener una suspensión de una sola célula de corazones de ratón adultos, y el cultivo a largo plazo de los CM de ratón adultos en el cultivo es aún más difícil.
El aislamiento CM adulto de los corazones de ratón y rata utilizando un sistema Langendorff se ha establecido previamente para estudiar la función CM5,14,15. Aquí, hemos descrito en detalle los protocolos para el aislamiento CM adulto de ratas y ratones, así como un cultivo modificado a largo plazo, transfección y proliferación CM de células aisladas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butane Dione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>B1387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-miR-67</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene weighing dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z154881-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>PSLAB-018285-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Mouse Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>24352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229865+5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siMeis2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s161030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRb1</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s128325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Blunt/SharpDissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Very Fine Precision Tip Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16-100-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8158-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3006S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes

El cultivo ex vivo de los cardiomiocitos de mamíferos adultos (CM) presenta el sistema experimental más relevante para el estudio in vitro de biología cardíaca. Los CM de mamíferos adultos son células diferenciadas terminalmente con una capacidad proliferativa mínima. El estado postmitético de los CM adultos no sólo restringe la progresión del ciclo celular de cardiomiocitos, sino que también limita el cultivo eficiente de los CM. Además, la cultura a largo plazo de los CM adultos es necesaria para muchos estudios, como la proliferación de CM y el análisis de la expresión génica.
El ratón y la rata son los dos animales de laboratorio preferidos para el aislamiento de cardiomiocitos. Si bien la cultura a largo plazo de los CM de rata es posible, los CM de ratón adultos son susceptibles a la muerte y no pueden ser cultivados más de cinco días en condiciones normales. Por lo tanto, hay una necesidad crítica de optimizar el aislamiento celular y el protocolo de cultivo a largo plazo para los CM murine adultos. Con este protocolo modificado, es posible aislar y cultivar con éxito tanto los CM adultos de ratón como de rata durante más de 20 días. Además, la eficiencia de la transfección de siRNA de CM aislada aumenta significativamente en comparación con los informes anteriores. Para el aislamiento CM de ratón adulto, el método de perfusión Langendorff se utiliza con una solución enzimática óptima y tiempo suficiente para la disociación completa de la matriz extracelular. Con el fin de obtener CM ventriculares puras, ambas aurículas fueron diseccionadas y descartadas antes de proceder con la disociación y ensuciamiento. Las células se dispersaron en una placa recubierta de laminina, lo que permitió una fijación eficiente y rápida. Se permitió que los CM se conforman con 4-6 h antes de la transfección del SIRNA. Los medios de cultivo se actualizaron cada 24 horas durante 20 días, y posteriormente, los CM se fijaron y se tiñeron para marcadores específicos de los cardiacos como troponina y marcadores del ciclo celular como KI67.

El protocolo modificado actual permite el aislamiento eficiente y el cultivo de LOS CM de ratas y ratones in vitro. Para el aislamiento de la RATA CM, se utilizaron un total de 3 ratas macho Fischer 344 adultas adultas (de 12 semanas de edad) en el procedimiento. La Figura 1 muestra el aparato quirúrgico y las configuraciones de aislamiento que se requieren en el procedimiento; cada parte ha sido marcada y descrita en la leyenda de la figura. La collagenasa tipo 2 se utilizó para la digest...

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Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento, la transfección y el cultivo a largo plazo de los cardiomiocitos adultos de ratón y rata.

Aislamiento, Transfección y Cultura a Largo Plazo de Cardiomiocitos adultos de ratón y rata

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

El objetivo de este vídeo es demostrar un protocolo estandarizado para el aislamiento de cardiomiocitos adultos, el cultivo a largo plazo y la transfección. Aislar y cultivar cardiomiocitos de ratón o rata siguen siendo un método esencial para investigar la biología autónoma celular de los cardiomiocitos dentro del corazón sano y enfermo. Hay varias preguntas que podemos responder usando cardiomiocitos aislados.Como el potencial proliferativo. Hay cambios en la expresión génica o expresiones específicas de citoquinas tras la respuesta a la lesión. Desafortunadamente, los cardiomiocitos de ratón no sobreviven en la última semana en condiciones normales de cultivo.Por lo tanto, en este video, describimos un método optimizado para aislar cardiomiocitos de ratón adultos, los transfiguramos y los cultivamos mucho más allá de 21 días, esta técnica es inicialmente difícil de dominar. Pero con la práctica se puede lograr alrededor de 80 a 90% sobrevivir en cardiomiocitos después del aislamiento y alrededor de una eficiencia de transfección al 100 por ciento. Y la mayoría de estos cardiomiocitos en condiciones correctas pueden sobrevivir más allá de los 20 días.Limpie y esterilice sus instrumentos quirúrgicos empapándolos en 70% de alcohol durante 15 minutos y posteriormente lavándolos con agua destilada doble. Después del agua, deje que las herramientas en el aire se sequen a continuación, limpie el aparato de profusión ejecutando 70%alcohol dos veces durante cinco minutos cada uno. Aumentar el caudal ayudará a limpiar el tubo después de que el alcohol enjuague cualquier alcohol restante corriendo agua destilada doble durante 10 minutos.configurar tres platos para limpiar el corazón después de la escisión. Llene cada uno de los platos con 20 mililitros de tampones de miocitos. Agregue dos a tres gotas de heparina a cada plato con la pipeta Pasteur y mezcle Bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.Tome una jeringa de 10 mililitros y llénelo con tampón de miocitos. Retire cualquiera de las burbujas de aire de la jeringa y colóquela en el tercer plato en una posición en ángulo, asegurándola con cinta adhesiva. Prepare un nudo suelto con sutura quirúrgica y colóquelo alrededor de la aguja.Inyecte el ratón con heparina a través de la inyección IP 20 minutos antes de la anestesia. Circule el tampón de profusión de miocitos a través del aparato de profusión a un caudal de tres mililitros por minuto. Después de cinco minutos, reemplace el tampón de profusión con solución enzimática, sature la solución enzimática con oxígeno durante el proceso, de nuevo, establezca la solución enzimática en un caudal de tres ml por minuto.Confirme la anestesia pellizcando los dedos del dedo del de la cara y coloque el ratón en la plataforma quirúrgica. Esterilice la piel con 70%alcohol. Abra cuidadosamente el pecho, ejercite el corazón y ponga el corazón en el primer plato.Limpie la sangre del corazón apretando suavemente, luego transfiera el corazón al segundo plato para limpiar aún más la sangre del corazón y eliminar cualquier tejido no cardíaco. Posteriormente transfiera el corazón al tercer plato. Encuentra la aorta y usa tus fórceps para mantenerla Peyton más colocándola alrededor de la aguja cánula.Asegúrelo tirando hacia abajo de su nudo pre apretado apretando y luego haciendo un segundo nudo. Para una estabilidad adicional, fije el orden y colóquelo con la ayuda de un clip. Recorte cualquier hilo de sutura en exceso y, finalmente, inicie la profusión cardíaca utilizando el tampón de miocitos en la jeringa para eliminar la sangre que queda en el corazón.Retire cuidadosamente la aguja de cálculo de la jeringa y enganche al aparato de profusión. Intenta evitar que las burbujas de aire entren en el corazón. Como esto puede afectar el flujo de la solución enzimática y la digestión.Mueva la chaqueta de agua hacia arriba, para proporcionar un ambiente homogéneo al corazón durante la profusión. Permita que la solución enzimática fluya a través del corazón con una velocidad de dos a tres ml por minuto. Deje que la solución enzimática fluya a través del corazón durante dos minutos.A dos minutos, mezclar en 40 microlitros de cien micromolares solución de cloruro de calcio a la solución enzimática. Deje que la solución enzimática pase a través del corazón durante otros 10 a 15 minutos. Una vez que el flujo se vuelve suave y el corazón comienza a verse marrón y suave, usted sabe que usted tiene una distribución uniforme de la enzima colagenasa para lograr la digestión adecuada del corazón.Cuando creas que tu digestión está completa, baja el corazón del sistema de perfusión Langendorff y ponlo en un plato Petri de 16 milímetros lleno de cinco mililitros de solución enzimática y llévalo a un pie de bioseguridad. Retire cuidadosamente las aurículas y el tejido extra graso. Picar el corazón en piezas definidas con la ayuda de fórceps.Tome una pipeta Pasteur estéril y corte su punta a 45 grados. Utilice la pipeta Pasteur para descomponer el tejido cardíaco pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. La digestión óptima proporciona una suspensión de cardiomiocitos de una sola célula después de que añadir cinco mililitros de solución de parada para detener la actividad enzimática para evitar la digestión excesiva, Tomar un primer tubo cónico de 50 mililitros y colocar un estéril colador de células de cien micras en él.Pasar la suspensión del cardiomiocitos a través del colador celular para eliminar cualquier trozo grande de tejido. Finalmente lave el colador con solución de parada para recoger cualquier resto de cardiomiocitos conectado. Centrifugar la suspensión celular a 20 GS durante tres minutos y deseche el sobrenadante.Re suspenda los cardiomiocitos y 10 mililitros de solución de parada, a intervalos de tres minutos a 10 microlitros de 100 solución de cloruro de calcio milimiolar cuatro veces y mezcle. Después de la cuarta edición centrifugar la suspensión de cardiomiocitos a 20 GS durante tres minutos y desechar el sobrenadante. Re suspenda los cardiomiocitos en medios de cultivo Pre platear las células en un plato de 60 milímetros y poner en la incubadora de CO2 durante dos a tres horas.En dos o tres horas. Los principales tipos de células contaminantes como las explosiones de fibra se adherirán al servicio del plato, permitiendo el aislamiento puro de los cardiomiocitos. Después de eso, sacar el plato de la incubadora y recoger los cardiomiocitos flotantes en un tubo cónico y rejugó los cardiomiocitos en una placa de cultivo de 24 pozos recubierto de laminina.De cuatro a seis horas es suficiente para que los cardiomiocitos se adhieran a la superficie. Así que la transfección podría realizarse a las seis horas después del enchapado. Se utilizó un reactivo de transfección de ARN IMAX para trasplantar cardiomiocitos con siRNAs.El medio de cultivo contiene 25 sangre micromolar Staten complementado con 10%FBS, que hemos encontrado es más adecuado para realizar el cultivo de cardiomiocitos a largo plazo e inducir el análisis de proliferación. Después de la transfección, puede ver los cardiomiocitos mediante microscopía utilizando una micro incubadora de cómo están las células para la toma de imágenes de lapso de tiempo. Estas son imágenes de campo brillante de cardiomiocitos en forma de varilla trans infectado a un aumento bajo y alto.Aquí, se pueden ver imágenes día a día, que muestra cambios en la morfología de los cardiomiocitos de ratón adultos. Confirmamos que los cardiomiocitos son sanos y contráctiles en los primeros momentos, así como después de la diferenciación D y el cultivo a largo plazo. Este es un ejemplo de tinción inmunofluorescente Ki67 que demuestra la proliferación inducida de cardiomiocitos adultos en el cultivo después de los siRNAs, una transfección.Como se puede ver en los resultados utilizando esta técnica, uno puede obtener cardiomiocitos adultos sanos de ratón y rata y cultivarlos para el estudio a largo plazo. En conclusión, una vez dominada esta técnica nos permitirá estudiar cardiomiocitos mucho más allá de los protocolos de cultivo actuales.

Research

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