Name: isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Detta arbete stöddes av finansiering från institutionen för patologi och laboratoriemedicin, University of Cincinnati, College of Medicine, till Dr Onur Kanisicak; ett anslag från National Institutes of Health (R01HL148598) till Dr Onur Kanisicak. Dr Onur Kanisicak stöds av American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr Perwez Alam stöds av American Heart Association postdoktoralt bidrag (AHA_20POST35200267). Dr Malina J. Ivey stöds av ett NIH T32-bidrag (HL 125204-06A1).

Alla experiment bör utföras i enlighet med riktlinjerna i Vägledning för vård och användning av försöksdjur som publiceras av U.S. National Institute of Health (NIH). Alla protokoll som visas i videon godkändes av institutionella Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Cincinnati, College of Medicine.
1. Beredning före hjärtutvinning från vuxna möss (och råttor)
<ol><li>Bered motsvarande perfusions-, enzym- och stopplösningar, enligt recepten som ges i ...

<ol>
	<li>van Amerongen, M. J., Engel, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+cardiomyocyte+proliferation+and+its+potential+for+cardiac+regeneration.">Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).</li><li>Parente, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+cardiac+injury+and+regeneration+in+zebrafish+adult+heart.">Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart.</a> PLoS One. 8, 53748 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+capacity+of+zebrafish+reverses+cardiac+failure+caused+by+genetic+cardiomyocyte+depletion.">The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion.</a> Development. 138, 3421-3430 (2011).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes.">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).</li><li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+function+in+mammalian+cardiac+myocytes.">T-tubule function in mammalian cardiac myocytes.</a> Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).</li><li>M&#252;ller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor.">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+ischemic+heart+disease:+novel+carriers+for+bioinformation.">Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).</li><li>Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cardiokines+in+Heart+Diseases:+Beneficial+or+Detrimental.">The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental.</a> BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).</li><li>Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+cardiomyocytes+in+culture+A+model+system+to+study+the+plasticity+of+the+differentiated+cardiac+phenotype+at+the+molecular+and+cellular+levels.">Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).</li><li>Alam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Senescence-Associated+Genes+Rb1+and+Meis2+in+Adult+Cardiomyocytes+Results+in+Cell+Cycle+Reentry+and+Cardiac+Repair+Post-Myocardial+Infarction.">Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-210-mediated+proliferation,+survival,+and+angiogenesis+promote+cardiac+repair+post+myocardial+infarction+in+rodents.">MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents.</a> Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).</li><li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+ascending:+perspectives+for+human-disease+models.">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Schl&#252;ter, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cultivation+of+Adult+Rat+Cardiomyocytes.">Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119, 909-920 (2016).</li><li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy.">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).</li><li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes.">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).</li><li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li><li>Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+specifically+inhibits+actin-myosin+interaction+in+mouse+cardiac+muscle.">Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Sellin, L. C., McArdle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+2,3-butanedione+monoxime.">Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.</a> Pharmacology &amp; Toxicology. 74, 305-313 (1994).</li></ol>

Det finns ett kritiskt behov av att upprätta ett protokoll för vuxna kardiomyocyte isolering och långsiktig kultur att utföra cell-specifika mekanistiska studier. Det finns bara ett fåtal rapporter diskuterar vuxna CM isolering protokoll, och ännu färre av dem används för långsiktig kultur av vuxna möss CM15,16,17. Det visas att den vuxna råttan CM har en högre tolerans mot in vitro-kulturen än de vuxna mössen CM<...

Hjärtsjukdomar är en av de vanligaste dödsorsakerna i världen. Nästan alla typer av hjärt skada resultera i en betydande förlust av vuxna kardiomyocyter (CMs). Vuxna däggdjurshjärtan kan inte reparera sin hjärtskada på grund av den vuxna CM1:ssenescentkaraktär . Således, någon förolämpning mot den vuxna däggdjur hjärtat resulterar i en permanent förlust av CMs, vilket leder till minskad hjärtfunktion och hjärtsvikt. Till skillnad från vuxna däggdjur, små djur som zebrafisk och newt hjärtan kan regenerera sin hjärtskada genom befintliga CM spridning2,3,4. En världsomspännande insats pågår för att hitta en ny terapeutisk intervention för hjärtskada via både proliferative och icke-proliferative metoder. Under de senaste decennierna har olika typer av genetiska musmodeller utvecklats för att studera hjärtskada och reparation. Att använda in vivo-djurmodeller fortsätter dock att vara en dyr metod med den ytterligare komplexiteten för att dechiffrera en cell-autonom mekanism från sekundära effekter. Förutom, in vivo system är utmanande att analysera CM specifika effekter av en farmakologisk intervention som inducerar hjärtskyddande signalering från CM.
Dessutom är den långsiktiga kulturen hos vuxna OEM-skivor nödvändig för att utföra CM-spridningsanalyser. CM spridningsanalyser kräver minst 4-5 dagar för att celler ska induceras i cellcykeln och för att få korrekta data efter det. Dessutom, studier som utnyttjar isolerade CMs för elektrofysiologiska studier, drogscreening, toxicitet studier, och Ca+ + homeostas studier är alla i behov av en förbättrad kultur system5,6,7. Vidare visar nyligen genomförda studier den hjärtskyddande betydelsen av cytokiner som utsöndras från CMs (kardiokiner)8,9. För att undersöka den terapeutiska roll och molekylära mekanismen av dessa kardiokiner under hjärtat reparation och regenerering, krävs en långvarig kultur.
Vuxna rat-CMs är robusta nog för encellig isolering och långsiktig kultur i ett in vitro-system10,11,12. Men vuxna mus-CMs är av stort intresse för in vitro-analyser, på grund av tillgången på en mängd olika genetiskt modifierade musmodeller, som möjliggör utformning och utförande av olika innovativa analyser som inte är möjliga med råtta CM13. I kontrast till vuxen råtta CM isolering, den er helt utmanande till få en enkel- cell upphängning från vuxen mus hjärtan, och den lång- tid kultur av vuxen mus CMs i kultur är jämn mer utmanande.
Adult CM isolering från mus och råtta hjärtan med hjälp av en Langendorff system har tidigare inrättats för att studera CM funktion5,14,15. Här har vi beskrivit i detalj protokollen för vuxna CM isolering från både råttor och möss, samt en modifierad långsiktig kultur, transfection, och CM spridning av isolerade celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butane Dione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>B1387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-miR-67</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene weighing dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z154881-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>PSLAB-018285-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Mouse Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>24352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229865+5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siMeis2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s161030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRb1</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s128325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Blunt/SharpDissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Very Fine Precision Tip Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16-100-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8158-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3006S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes

Ex vivo kultur av de vuxna däggdjur kardiomyocyter (CMs) presenterar den mest relevanta experimentella systemet för in vitro-studien av hjärt biologi. Vuxna däggdjurs-CMs är terminalt differentierade celler med minimal proliferativ kapacitet. Den post-mitotiska tillstånd av vuxna CMs inte bara begränsar kardiomyocyte cell cykel progression men också begränsar den effektiva kulturen av CMs. Dessutom är den långsiktiga kulturen hos vuxna CMs nödvändig för många studier, såsom CM spridning och analys av genuttryck.
Musen och råttan är de två mest föredragna försöksdjur som ska användas för kardiomyocyte isolering. Medan den långsiktiga kulturen av råtta-CMs är möjlig, är vuxna mus-ING mottagliga för döden och kan inte odlas mer än fem dagar under normala förhållanden. Därför finns det ett kritiskt behov av att optimera cellen isolering och långsiktiga kultur-protokollet för vuxna murine CMs. Med detta modifierade protokoll är det möjligt att framgångsrikt isolera och kultur både vuxna mus och råtta CMs i mer än 20 dagar. Dessutom är siRNA transfektion effektivitet isolerade CM betydligt ökat jämfört med tidigare rapporter. För vuxna mus CM isolering, langendorff perfusion metoden utnyttjas med en optimal enzymlösning och tillräcklig tid för fullständig extracellulär matris dissociation. För att erhålla ren Ventrikulärt CMs, var både atria dissekeras och kasseras innan du fortsätter med de disassociation och plätering. Celler var spridda på en laminin belagda plattan, vilket möjliggjed för effektiv och snabb fastsättning. CMs var tillåtet att nöja sig med 4-6 h innan siRNA transfection. Kulturmedia var utvilad var 24 h i 20 dagar, och därefter var CMs fasta och färgade för hjärt-specifika markörer som Troponin och markörer för cellcykel som KI67.

Det nuvarande modifierade protokollet möjliggör effektiv isolering och kultur av råtta och möss CMs in vitro. För rått CM isolering användes totalt 3 vuxna (12 veckor gamla) manliga Fischer 344 råttor i förfarandet. Bild 1 visar den kirurgiska apparaten och uppställningar isolering som krävs i förfarandet; varje del har markerats och beskrivits i figurlegenden. Kollagenas typ 2 användes för matsmältningen, som ger en hög mängd högkvalitativa CMs från framgångsrik isolerin...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Här presenterar vi ett protokoll för isolering, transfection och långsiktiga kultur av vuxna mus och råtta kardiomyocyter.

Isolering, Transfection, och långsiktig kultur av vuxna Mus och Råtta Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Målet med denna video är att visa ett standardiserat protokoll för vuxna kardiomyocyter isolering, långsiktig kultur och transfection. Isolera och culturing kardiomyocyter från mus eller råtta fortsätter att vara en viktig metod för att undersöka cellen autonoma biologi kardiomyocyter inom friska och sjukdom hjärta. Det finns flera frågor vi kan besvara med hjälp av isolerade kardiomyocyter.Såsom den proliferativa potentialen. Det finns genuttryck förändringar eller specifika cytokin uttryck vid skada svar. Tyvärr överlever muskardiomyocyter inte förbi en vecka i normala odlingsförhållanden.Därför, i den här videon, beskriver vi en optimerad metod för att isolera vuxna mus kardiomyocyter, transfixed dem och odlade dem långt bortom 21 dagar, denna teknik är initialt svårt att bemästra. Men med övning kan man uppnå cirka 80 till 90% överleva i kardiomyocyter efter isolering och om en 100 procent transfektion effektivitet. Och de flesta av dessa kardiomyocyter i korrekta förhållanden kan överleva senaste 20 dagarna.Rengör och sterilisera dina kirurgiska instrument genom att blötlägga dem i 70%-alkohol i 15 minuter och därefter tvätta dem med dubbelt destillerat vatten. Efter vattnet, lämna verktygen i luften för att torka nästa, rengör profusion apparaten genom att köra 70%alkohol två gånger i fem minuter vardera. Öka flödet kommer att bidra till att rengöra slangen efter alkohol skölja ut eventuella återstående alkohol genom att köra dubbel destillerat vatten i 10 minuter.ställa in tre rätter för att rengöra hjärtat efter excision. Fyll var och en av disken med 20 milliliter myocyte buffert. Tillsätt två till tre droppar heparin till varje maträtt med Pasteur pipetten och blanda Väl genom pipettering upp och ner flera gånger.Ta en 10 milliliter spruta och fyll den med myocyte buffert. Ta bort någon av luftbubblorna från sprutan och placera den i den tredje skålen i ett vinklat läge, säkra den med tejp. Förbered en lös Knut med kirurgisk sutur och placera den runt nålen.Injicera musen med heparin genom IP-injektion 20 minuter före anestesi. Cirkulera myocyteprofusionsbufferten genom profusionsapparaten med en flödeshastighet på tre milliliter per minut. Efter fem minuter, ersätta profusion buffert med enzymlösning, mätta enzymlösningen med syre under processen, återigen, ställa in enzymlösningen till en flödeshastighet på tre mLs per minut.Bekräfta anestesi genom att tå nypa och placera musen på den kirurgiska plattformen. Sterilisera huden med 70%alkohol. Öppna försiktigt bröstet, utöva hjärtat och lägg hjärtat i den första skålen.Rensa blodet från hjärtat genom mild klämma, sedan överföra hjärtat till den andra skålen för att ytterligare rengöra blodet från hjärtat och ta bort eventuella icke-hjärtvävnader. Därefter överföra hjärtat till den tredje skålen. Hitta aorta och använda dina tivnningar för att hålla det Peyton mer placera den runt den kanylera nålen.Säkra den genom att dra ner din pre snäva knut åtstramning och sedan göra en andra knut. För ytterligare stabilitet fixa ordning och placera med hjälp av ett klipp. Trimma eventuellt överskott sutur tråd, och slutligen starta hjärtat profusion med hjälp av myocyte buffert i sprutan för att rensa något av blodet kvar i hjärtat.Ta försiktigt bort den beräknande nålen från sprutan och haka fast den på profusionsapparaten. Försök att förhindra att eventuella luftbubblor går in i hjärtat. Eftersom detta kan påverka flödet av enzymlösningen och matsmältningen.Flytta upp vattenmanteln, för att ge en homogen miljö till hjärtat under profusion. Låt enzymlösningen flöda genom hjärtat med en hastighet på två till tre mLs per minut. Låt enzymlösningen flöda genom hjärtat i två minuter.Vid två minuter, blanda i 40 mikroliter av hundra mikromolar kalciumkloridlösning till enzymlösningen. Låt enzymlösningen passera genom hjärtat i ytterligare 10 till 15 minuter. När flödet blir slät och hjärtat börjar se brun och mjuk, du vet att du har en jämn fördelning av kollagenas enzym för att uppnå korrekt matsmältning av hjärtat.När du tror att din matsmältning är klar, ta ner hjärtat från Langendorff perfusion systemet och lägga den i en 16 millimeter Petriskål fylld med fem milliliter enzymlösning och ta den till en biosäkerhet fot. Ta försiktigt bort atria och extra fettvävnad. Finhacka hjärtat i definierade bitar med hjälp av tcim.Ta en steril Pasteurpipett och skär dess spets i 45 grader. Använd Pasteurpipetten för att bryta upp hjärtvävnaden genom att varsamt pipettera upp och ner. Optimal matsmältning ger en suspension av encelliga kardiomyocyter efter att lägga till fem milliliter stopplösning för att stoppa enzymaktiviteten för att undvika över matsmältningen, Ta en första 50 milliliter koniska röret och placera en steril hundra mikron cell sil på den.Passera kardiomyocyte suspension genom cellen silen för att ta bort några stora bitar av vävnad. Slutligen tvätta silen med stopplösning för att samla eventuella bifogade kardiomyocyterester. Centrifugera cellupphängningen vid 20 GS i tre minuter och kassera supernatanten.Re avbryta kardiomyocyter och 10 milliliter stopplösning, med tre minuters mellanrum med 10 mikroliter av 100 millimolar kalciumkloridlösning fyra gånger och blanda. Efter den fjärde upplagan centrifugera cardiomyocytes suspensionen vid 20 GS i tre minuter och kassera supernatanten. Re avbryta kardiomyocyter i kulturmedia Pre platta cellerna i en 60 millimeters maträtt och sätta i CO2 inkubator i två till tre timmar.Om två till tre timmar. De viktigaste förorening celltyper som fiber blaster kommer att följas till tjänsten av skålen, vilket möjliggör ren isolering av kardiomyocyter. Efter det, ta skålen ur inkubatorn och samla de flytande kardiomyocyter i ett koniskt rör och återspelade kardiomyocyter i en laminin belagda 24 väl kultur tallrik.Fyra till sex timmar är tillräckligt för kardiomyocyterna att hålla sig till ytan. Så transfection kunde utföras på sex timmar efter plätering. RNA IMAX transfection reagens användes för att transplantera kardiomyocyter med siRNAs.Kulturen media innehåller 25 mikromolar blod Staten kompletteras med 10%FBS, som vi har funnit är bättre lämpad att utföra långsiktiga kardiomyocyte kultur och inducera spridning analys. Efter transfektion, kan du visa kardiomyocyter genom mikroskopi utnyttja en mikro inkubator till hur är cellerna för time-lapse imaging. Dessa är brightfield bilder av transfected stav formade kardiomyocyter vid låg och hög förstoring.Här kan du se dag för dag bildbehandling, som visar förändringar i vuxna mus kardiomyocyte morfologi. Vi bekräftar att kardiomyocyterna är friska och kontraktil vid tidiga tidpunkter, liksom efter D differentiering och långsiktig kultur. Här är ett exempel på Ki67 immunofluorescerande färgning visar inducerad spridning av vuxna kardiomyocyter i kultur efter siRNAs, en transfektion.Som ni kan se från resultaten med hjälp av denna teknik, kan man erhålla friska vuxna kardiomyocyter från mus och råtta och kultur dem för långsiktig studie. Sammanfattningsvis, en gång behärskar denna teknik kommer att tillåta oss att studera kardiomyocyter långt utöver de nuvarande odlingsprotokoll.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Primär kultur Vuxen myocyter Rat hjärta

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Långsiktig kultur för mänskliga Prover bröstcancer och deras analys Använda optisk Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell transkriptionell Profilering av Vuxen mus Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Seriell Anrikning av spermatogoniala stam-och stamfaderceller (SSC) i Kultur för Härledning av långfristiga SSC vuxen mus Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Isolering och odling av neonatala Mus Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolering, kultur, och funktionell karakterisering av vuxen mus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolering och fysiologisk Analys av Mus Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolering och kultur av Dental epitelceller stamceller från vuxen mus Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolering och kultur i vuxen mus Cardiomyocytes för cellsignalering och<em&gt; In vitro</em&gt; Hjärthypertrofi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...