Name: isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Bu çalışma, Cincinnati Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü'nden Dr. Onur Kanisicak'a; Dr. Onur Kanisicak'a Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R01HL148598) hibe. Dr. Onur Kanisicak, Amerikan Kalp Derneği Kariyer Geliştirme Ödülü (18CDA34110117) tarafından desteklenmiştir. Dr. Perwez Alam, Amerikan Kalp Birliği doktora sonrası hibe (AHA_20POST35200267) tarafından desteklenir. Dr Malina J. Ivey bir NIH T32 hibe (HL 125204-06A1) tarafından desteklenir.

Tüm deneyler, ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun yönergelerine uygun olarak yapılmalıdır. Videoda görüntülenen tüm protokoller Cincinnati Üniversitesi, Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Yetişkin farelerden (ve sıçanlardan) kalp çıkarma öncesi hazırlık
<ol><li>Sırasıyla fare ve fare izolasyonu için Tablo 1...

<ol>
	<li>van Amerongen, M. J., Engel, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+cardiomyocyte+proliferation+and+its+potential+for+cardiac+regeneration.">Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).</li><li>Parente, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia/reoxygenation+cardiac+injury+and+regeneration+in+zebrafish+adult+heart.">Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart.</a> PLoS One. 8, 53748 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regenerative+capacity+of+zebrafish+reverses+cardiac+failure+caused+by+genetic+cardiomyocyte+depletion.">The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion.</a> Development. 138, 3421-3430 (2011).</li><li>Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Graham, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes.">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).</li><li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-tubule+function+in+mammalian+cardiac+myocytes.">T-tubule function in mammalian cardiac myocytes.</a> Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).</li><li>M&#252;ller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor.">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+ischemic+heart+disease:+novel+carriers+for+bioinformation.">Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).</li><li>Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cardiokines+in+Heart+Diseases:+Beneficial+or+Detrimental.">The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental.</a> BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).</li><li>Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rat+cardiomyocytes+in+culture+A+model+system+to+study+the+plasticity+of+the+differentiated+cardiac+phenotype+at+the+molecular+and+cellular+levels.">Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).</li><li>Alam, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Senescence-Associated+Genes+Rb1+and+Meis2+in+Adult+Cardiomyocytes+Results+in+Cell+Cycle+Reentry+and+Cardiac+Repair+Post-Myocardial+Infarction.">Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).</li><li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-210-mediated+proliferation,+survival,+and+angiogenesis+promote+cardiac+repair+post+myocardial+infarction+in+rodents.">MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents.</a> Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).</li><li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+ascending:+perspectives+for+human-disease+models.">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).</li><li>Nippert, F., Schreckenberg, R., Schl&#252;ter, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Cultivation+of+Adult+Rat+Cardiomyocytes.">Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).</li><li>Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Transduction+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified,+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart.">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119, 909-920 (2016).</li><li>Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiomyocytes+for+cell+signaling+and+in+vitro+cardiac+hypertrophy.">Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).</li><li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes.">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).</li><li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li><li>Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+specifically+inhibits+actin-myosin+interaction+in+mouse+cardiac+muscle.">Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Sellin, L. C., McArdle, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+effects+of+2,3-butanedione+monoxime.">Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime.</a> Pharmacology &amp; Toxicology. 74, 305-313 (1994).</li></ol>

Hücreye özgü mekanistik çalışmalar yapabilmek için yetişkin kardiyomiyosit izolasyonu ve uzun vadeli kültür için bir protokol kurulması çok önemlidir. Yetişkin CM izolasyon protokolleri tartışırken sadece birkaç rapor vardır, ve hatta bunların daha az yetişkin farelerCM15,,16,,17uzun vadeli kültür için kullanılır. Bu yetişkin sıçan CM yetişkin fareler CM10,<sup cl...

Kalp hastalıkları dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. Kardiyak yaralanmanın hemen hemen her türü erişkin kardiyomiyosit (CM) kaybıile sonuçlanır. Erişkin memeli kalpler yetişkin CM1senescent doğası nedeniyle kardiyak yaralanma onarmak mümkün değildir. Böylece, yetişkin memeli kalp herhangi bir hakaret CMs kalıcı bir kaybına yol, azaltılmış kalp fonksiyonu ve kalp yetmezliğine yol açan. Yetişkin memelilerin aksine, zebra balığı ve yeni kalpler gibi küçük hayvanlar mevcut CM çoğalması2,3,4ile kardiyak yaralanmalarını yenileyebilirler. Hem proliferatif hem de proliferatif olmayan yaklaşımlar la kardiyak yaralanmalar için yeni bir terapötik müdahale bulmak için dünya çapında bir çaba devam etmektedir. Son yıllarda, genetik fare modelleri çeşitli kardiyak yaralanma ve onarım çalışma geliştirilmiştir. Ancak, in vivo hayvan modelleri kullanarak ikincil etkileri bir hücre özerk mekanizma deşifre etmek için ek karmaşıklığı ile pahalı bir yaklaşım olmaya devam etmektedir. Ayrıca in vivo sistemleri, CM'den kardiyoprotektif sinyalizasyona neden olan farmakolojik bir müdahalenin CM'ye özgü etkilerini analiz etmek zordur.
Ayrıca, cm proliferasyon analizleri yapmak için yetişkin CM'lerin uzun vadeli kültürü gereklidir. CM proliferasyon tahlilleri hücrelerin hücre döngüsüne indüklenen ve bundan sonra doğru veri elde etmek için en az 4-5 gün gerektirir. Ayrıca, elektrofizyolojik çalışmalar, ilaç taraması, toksisite çalışmaları ve Ca++ homeostaz çalışmaları için izole CM'ler kullanan çalışmalar tüm gelişmiş bir kültür sistemi 5 ihtiyacı vardır5,6,7. Ayrıca, son çalışmalar CMs salgılanan sitokinlerin kardiyoprotektif önemini göstermektedir (kardiyokines)8,9. Kalp onarımı ve rejenerasyonu sırasında bu kardiyokinelerin terapötik rolünü ve moleküler mekanizmasını araştırmak için uzun süreli bir kültür gereklidir.
Yetişkin sıçan CMs bir in vitro sistem10,,11,,12tek hücreli izolasyon ve uzun vadeli kültür için yeterince sağlam . Ancak, yetişkin fare CMs in vitro tahliller için büyük ilgi vardır, genetik olarak değiştirilmiş fare modelleri çeşitli durumu nedeniyle, hangi tasarım ve sıçan CM ile mümkün değildir çeşitli yenilikçi analizlerin yürütülmesi için izin verir13. Yetişkin fare CM izolasyon aksine, yetişkin fare kalplerden tek hücreli süspansiyon elde etmek oldukça zordur, ve kültür yetişkin fare CMs uzun vadeli kültür daha da zordur.
Bir Langendorff sistemi kullanarak fare ve sıçan kalplerinden Yetişkin CM izolasyon u daha önce CM fonksiyonu5,14,,15çalışma kurulmuştur. Burada, hem sıçanlardan hem de farelerden yetişkin CM izolasyonprotokollerinin yanı sıra izole edilmiş hücrelerin değiştirilmiş uzun vadeli kültürü, transfeksiyonu ve CM çoğalmasını ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3-Butane Dione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B-0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>B1387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>449709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-miR-67</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene weighing dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z154881-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Point High Precision Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>PSLAB-018285-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-000-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>13778-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Mouse Laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>24352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease XIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229865+5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siMeis2</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s161030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRb1</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>s128325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Blunt/SharpDissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>28252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Very Fine Precision Tip Forceps</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>16-100-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8158-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-079-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3006S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes

Erişkin memeli kardiyomiyositlerin (CMs) ex vivo kültürü, kardiyak biyolojinin in vitro çalışması için en uygun deneysel sistemi sunmaktadır. Erişkin memeli CM'ler en az proliferatif kapasiteye sahip ölümcül farklılaşmış hücrelerdir. Erişkin CM'lerin mitotik sonrası durumu sadece kardiyomiyosit hücre döngüsünün ilerlemesini kısıtlamakla kalmamış, aynı zamanda CM'lerin verimli kültürünü de sınırlandırır. Ayrıca, yetişkin CM'lerin uzun vadeli kültürü CM proliferasyonu ve gen ekspresyonunun analizi gibi birçok çalışma için gereklidir.
Fare ve sıçan kardiyomiyosit izolasyonu için kullanılan iki en çok tercih edilen laboratuvar hayvanlarıdır. Sıçan CM'lerinin uzun süreli kültürü mümkün olsa da, yetişkin fare CM'leri ölüme duyarlıdır ve normal koşullarda beş günden fazla kültürlenemez. Bu nedenle, yetişkin murine CMs için hücre izolasyonu ve uzun vadeli kültür protokolü optimize etmek için kritik bir ihtiyaç vardır. Bu değiştirilmiş protokol ile, 20 günden fazla hem yetişkin fare yi hem de fare CM'lerini başarılı bir şekilde izole etmek ve kültüretmek mümkündür. Ayrıca, izole CM siRNA transfeksiyon verimliliği önemli ölçüde önceki raporlara göre artmıştır. Yetişkin fare CM izolasyonu için Langendorff perfüzyon yöntemi optimal enzim çözeltisi ve tam ekstrasellüler matriks ayrışması için yeterli zaman ile kullanılmaktadır. Saf ventriküler CM'ler elde etmek için, her iki atria diseksiyon ve kaplama ile devam etmeden önce diseksiyon ve atılır. Hücreler verimli ve hızlı bağlanmaya olanak sağlayan laminin kaplı bir plaka üzerinde dağıtıldı. CMs siRNA transfeksiyon önce 4-6 saat yerleşmek için izin verildi. Kültür medyası 20 gün boyunca her 24 saatte bir yenilendi ve daha sonra, CM'ler Troponin ve KI67 gibi hücre döngüsünün belirteçleri gibi kardiyak spesifik belirteçler için sabit lendi ve lekelendi.

Mevcut değiştirilmiş protokol verimli izolasyon ve tüp bebek fare ve fare CMs kültürü sağlar. Sıçan CM izolasyonu için, toplam 3 yetişkin (12 haftalık) erkek Fischer 344 sıçan kullanıldı. Şekil 1, işlemde gerekli olan cerrahi cihazları ve izolasyon kurulumlarını gösterir; her parça işaretlenmiştir ve şekil efsanesinde açıklanmıştır. Kollajenaz tip 2 sindirim için kullanılmıştır, bu da başarılı izolasyondan yüksek miktarda yüksek kaliteli CM'ler verir...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes at JoVE.com

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Burada, yetişkin fare ve sıçan kardiyomiyositlerinin izolasyon, transfeksiyon ve uzun vadeli kültürü için bir protokol sıyoruz.

İzolasyon, Transfeksiyon ve Yetişkin Fare ve Sıçan Kardiyomiyositlerinin Uzun Süreli Kültürü

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Bu videonun amacı yetişkin kardiyomiyosit izolasyon, uzun vadeli kültür ve transfeksiyon için standart bir protokol göstermektir. Fare veya sıçandan kardiyomiyositlerin izole edilmesi ve kültüre alınması, sağlıklı ve hastalıklı kalpteki kardiyomiyositlerin hücre otonom biyolojisini araştırmak için gerekli bir yöntem olmaya devam etmektedir. İzole kardiyomiyositkullanarak cevaplanabileceğimiz birkaç soru var.Proliferatif potansiyel gibi. Yaralanma yanıtı üzerine gen ekspresyonu değişiklikleri veya spesifik sitokin ekspresyonları vardır. Ne yazık ki, fare kardiyomiyositnormal kültür koşullarında son bir hafta hayatta değildir.Bu nedenle, bu videoda, yetişkin fare kardiyomiyositleri izole etmek için optimize edilmiş bir yöntemi tanımlıyoruz, onları 21 gün boyunca aşındırıp kültürediyoruz, bu teknikte ustalaşmak başlangıçta zor. Ama uygulama ile bir izolasyon ve yaklaşık% 100 transfeksiyon verimliliği sonra kardiyomiyosithayatta yaklaşık% 80-90 elde edebilirsiniz. Ve bu kardiyomiyositlerin çoğu son 20 gün hayatta kalabilir.Cerrahi aletlerinizi 15 dakika %70 alkolle ıslatarak ve daha sonra çift distile su ile yıkayarak temizleyin ve sterilize edin. Sudan sonra, havadaki araçları bir sonraki kurumaya bırakın, her biri beş dakika boyunca iki kez %70 alkol çalıştırarak profüzyon cihazını temizleyin. Akış hızının artırılması, alkolden sonra 10 dakika boyunca çift distile su çalıştırarak kalan alkolü duruladıktan sonra tüpün temizlenmesine yardımcı olacaktır.eksizyondan sonra kalbi temizlemek için üç tabak ayarlayın. Her tabakları 20 mililitre miyosit tamponuile doldurun. Pasteur pipeti ile her çan araya iki ila üç damla heparin ekleyin ve birden çok kez yukarı ve aşağı boru ile iyice karıştırın.10 mililitrelik bir şırınga al ve miyosit tamponuyla doldur. Şırıngadan hava kabarcıklarından herhangi birini çıkarın ve üçüncü tabağa yerleştirin ve bantla emniyete alayın. Cerrahi dikiş ile gevşek bir Düğüm hazırlayın ve iğne etrafında yerleştirin.Anesteziden 20 dakika önce IP enjeksiyonu ile fareye heparin enjekte edin. Dakikada üç mililitre lik bir akış hızında profüzyon cihazı ile miyosit profüzyon tampon dolaşımı. Beş dakika sonra, enzim çözeltisi ile profüzyon tampon değiştirin, süreç sırasında oksijen ile enzim çözeltisi doygun, tekrar, dakikada üç mLs bir akış hızına enzim çözeltisi ayarlayın.Anesteziyi parmak ucutuile onaylayın ve fareyi cerrahi platforma yerleştirin. % 70 alkol ile cildi sterilize. Dikkatle göğüs açın, kalp egzersiz ve ilk çanak kalp koymak.Nazik sıkma ile kalpten kan temizleyin, daha sonra daha fazla kalpten kan temizlemek ve herhangi bir kardiyak olmayan dokuları kaldırmak için ikinci çanak için kalp transfer. Daha sonra üçüncü çanak için kalp aktarın. Aort bulun ve Peyton daha cannulating iğne etrafında yerleştirerek tutmak için forceps kullanın.Önceden sıkı düğüm sıkma aşağı çekerek ve daha sonra ikinci bir düğüm yaparak güvenli. Ek kararlılık için bir klip yardımı ile sipariş ve yer düzeltmek. Herhangi bir aşırı dikiş iplik trim, ve nihayet kalp te kalan kan temizlemek için şırınga içinde miyosit tampon kullanarak kalp profüzyonu başlar.Hesaplama iğnesini şırıngadan dikkatlice çıkarın ve profüzyon cihazına bağla. Kalbine giden herhangi bir hava kabarcıkları önlemek için girişimi. Bu enzim çözeltisi ve sindirim akışını etkileyebilir gibi.Profüzyon sırasında kalbe homojen bir ortam sağlamak için su ceketini yukarı taşıyın. Enzim çözeltisinin kalpten dakikada 2-3 mL hızla akmasına izin verin. Enzim çözeltisinin iki dakika boyunca kalpten akmasına izin verin.İki dakika sonra, enzim çözeltisine 100 mikromolar kalsiyum klorür çözeltisinin 40 mikrolitresini karıştırın. Enzim çözeltisi 10-15 dakika daha kalpten geçsin. Bir kez akış pürüzsüz olur ve kalp kahverengi ve yumuşak görünmeye başlar, eğer kalbin düzgün sindirim elde etmek için kollajenaz enzimi eşit bir dağılım olduğunu biliyorum.Sindiriminizin tamamolduğunu düşündüğünüzde, kalbi Langendorff perfüzyon sisteminden aşağı alın ve beş mililitre enzim solüsyonuyla dolu 16 milimetrelik Petri kabına koyun ve biyogüvenlik ayağına götürün. Dikkatle atria ve ekstra yağ dokusu kaldırın. Forceps yardımı ile tanımlanan parçalar halinde kalp kıyma.Steril bir Pasteur pipet alın ve 45 derece onun ucu kesti. Pasteur pipetini kullanarak kalp dokusunu parçalayarak hafifçe pipetleme yaparak kullanın. Optimal sindirim sindirim üzerinde önlemek için enzim aktivitesini durdurmak için durdurmak çözeltisi beş mililitre eklemek sonra tek hücreli kardiyomiyositbir süspansiyon sağlar, Ilk 50 mililitre konik tüp alın ve üzerine steril yüz mikron hücreli süzgeç yerleştirin.Doku herhangi bir büyük parçalar kaldırmak için hücre süzgeci aracılığıyla kardiyomiyosit süspansiyon geçirin. Son olarak herhangi bir bağlı kardiyomiyosit kalıntıları toplamak için stop çözeltisi ile süzgeç yıkayın. Hücre süspansiyonuna 20 GS'de üç dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın.Kardiyomiyositleri ve 10 mililitre stop çözeltisini 100 milimolar kalsiyum klorür çözeltisinin 10 mikrolitresinde üç dakikalık aralıklarla dört kez askıya alın ve karıştırın. Dördüncü baskıdan sonra kardiyomiyosit süspansiyonu 20 GS'de üç dakika lığına askıya alıp supernatant'ı atın. Yeniden kültür medya içine kardiyomiyositaskıya Ön plaka hücreleri 60 milimetrelik çanak içine ve 2-3 saat co2 kuluçka içine koymak.2-3 saat içinde. Lif patlamaları gibi ana kirletici hücre tipleri, kardiyomiyositlerin saf izolasyonuna olanak tanıyan çanak servise yapışacaktır. Bundan sonra, kuvöz dışında çanak almak ve konik bir tüp içinde yüzen kardiyomiyosit toplamak ve bir laminin kaplı kardiyomiyositler replayed 24 iyi kültür plakası.Kardiyomiyositlerin yüzeye yapışması için 4-6 saat yeterlidir. Yani transfeksiyon kaplamadan altı saat sonra yapılabilir. RNA IMAX transfeksiyon reaktifi siRNA ile kardiyomiyosit nakli için kullanıldı.Kültür medya 25 mikromolar kan Staten içerir 10% FBS ile desteklenmektedir, biz bulduk ki daha iyi uzun vadeli kardiyomiyosit kültürü gerçekleştirmek ve proliferasyon analizi neden uygundur. Transfeksiyondan sonra, mikro kuvöz kullanarak kardiyomiyositleri mikroskobik olarak görüntüleyebilirsiniz. Bunlar düşük ve yüksek büyütme transfected çubuk şeklinde kardiyomiyositler parlak alan görüntüleri.Burada, yetişkin fare kardiyomiyosit morfolojisindeki değişiklikleri sergileyen günlük görüntülemeyi görebilirsiniz. Kardiyomiyositlerin erken zaman noktalarında, D farklılaşması ve uzun süreli kültürden sonra sağlıklı ve kontraktil olduğunu doğrulıyoruz. İşte ki67 immünofloresan boyama siRNA sonra kültürde yetişkin kardiyomiyositlerin indüklenen çoğalma gösteren bir örnek, bir transfeksiyon.Bu tekniği kullanarak sonuçlardan da görebileceğiniz gibi, bir uzun vadeli çalışma için fare ve sıçan ve kültür onları sağlıklı yetişkin kardiyomiyosit elde edebilirsiniz. Sonuç olarak, bu teknik hakim bize mevcut culturing protokolleri çok ötesinde kardiyomiyosit çalışma sağlayacaktır.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Yetişkin Sıçan Kalp miyositler İlköğretim Kültür

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Optik Projeksiyon Tomografi İnsan Meme Kanseri Örnekler ve Analiz Uzun vadeli Kültür

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Yetişkin Fare kardiyomiyositlerde Tek Hücre transkripsiyonel Profilleme

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Uzun vadeli Yetişkin Fare SSC Hatları türetilmesi için Kültür Spermatogonial Kök ve progenitör hücrelerin Seri Zenginleştirme (DGM)

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em&gt; In vitro</em&gt; Kalp hipertrofisi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...