Name: a lab-on-a-chip platform for stimulating osteocyte mechanotransduction and analyzing functional outcomes of bone remodeling
Uploaded: 2020-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation under Grant Nos. (CBET 1060990 og EBMS 1700299). Dette materiale er også baseret på arbejde, der støttes af National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant No. (2018250692). Eventuelle udtalelser, resultater, konklusioner eller anbefalinger udtrykt i dette materiale er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis National Science Foundations synspunkter.

1. Chip maske forberedelse
BEMÆRK: Trin 1.1 - 1.3 skal kun udføres én gang efter første modtagelse af spånmasken. De sikrer, at masken ikke bøjer under brug. Udformningen af mikrofluidiske masker blev tidligere beskrevet11,14. Masker er designet internt og fremstillet kommercielt ved hjælp af stereolitografi med høj opløsning (Figur 1A).
<ol><li>Dæk oversiden af masken med plas...

<ol>
	<li>Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+Osteocytes,+and+Mechanotransduction.">Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction.</a> Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amazing+osteocyte.">The amazing osteocyte.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).</li><li>Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+co-culture+platform+for+investigating+osteocyte-osteoclast+signalling+during+fluid+shear+stress+mechanostimulation.">Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation.</a> Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).</li><li>Kou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multishear+microfluidic+device+for+quantitative+analysis+of+calcium+dynamics+in+osteoblasts.">A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).</li><li>Ma, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chip-based+co-culture+of+fibroblast-like+synoviocytes+with+osteoblasts+and+osteoclasts+to+test+bone+erosion+and+drug+evaluation.">A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation.</a> Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).</li><li>Jang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+osteoblast-based+3D+continuous-perfusion+microfluidic+system+for+drug+screening.">Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic-based+multi-shear+device+for+investigating+the+effects+of+low+fluid-induced+stresses+on+osteoblasts.">A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts.</a> PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).</li><li>Hwang, P. W., Horton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+osteogenic+performance+of+MC3T3-E1+subclones+impacts+their+utility+as+models+of+osteoblast+biology.">Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).</li><li>Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+lifetime+lead+exposure+impedes+osteoclast+activity+and+produces+an+increase+in+bone+mass+in+adolescent+mice.">Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice.</a> Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).</li><li>Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+growth+factor+control+of+bone+formation+through+osteoprogenitor+differentiation.">Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation.</a> Bone. 34 (3), 402-411 (2004).</li><li>George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip+platforms+for+quantification+of+multicellular+interactions+in+bone+remodeling.">Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling.</a> Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).</li><li>Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+considerations+for+optimizing+bone+cell+culture+and+remodeling+in+a+lab-on-a-chip+platform.">Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform.</a> Biotechniques. , (2019).</li><li>Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printed+loading+device+for+inducing+cellular+mechanotransduction+via+matrix+deformation.">3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation.</a> Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).</li><li>George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+mechanically+loaded+osteocytes+and+inflammation+on+bone+remodeling+in+a+bisphosphonate-induced+environment.">The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment.</a> Bone. 127, 460-473 (2019).</li><li>George, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , (2019).</li><li>York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+osteocytic+microdamage+and+viability+quantification+using+a+microloading+platform.">In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform.</a> Medical Engineering &amp; Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).</li><li>Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+plasma+treatment+of+polymer+surface+for+irreversible+sealing+of+microfluidic+devices.">Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices.</a> Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).</li><li>Millare, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+the+quality+of+adhesion+between+poly(dimethylsiloxane)+and+glass+surfaces+on+the+conditions+of+treatment+with+oxygen+plasma.">Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma.</a> Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).</li><li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+compatibility+of+poly(dimethylsiloxane)-based+microfluidic+devices.">Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices.</a> Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).</li><li>Regehr, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+implications+of+polydimethylsiloxane-based+microfluidic+cell+culture.">Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture.</a> Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).</li><li>Wang, Y., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncured+PDMS+inhibits+myosin+in+vitro+motility+in+a+microfluidic+flow+cell.">Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell.</a> Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).</li><li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities.">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).</li><li>Kilic, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-on-a-chip+model+enables+analysis+of+human+neuronal+differentiation+and+chemotaxis.">Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis.</a> Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).</li><li>Van Scoy, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+automata+model+of+bone+formation.">A cellular automata model of bone formation.</a> Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).</li><li>Truesdell, S. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+remodeling+platforms:+Understanding+the+need+for+multicellular+lab-on-a-chip+systems+and+predictive+agent-based+models.">Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models.</a> Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).</li></ol>

Denne artikel beskriver grundlaget for fremstilling af en knogleremodellering LOC platform for dyrkning osteocytter, osteoklaster, og osteoblaster. Ved at ændre dybden og størrelsen af brønden i chippen blev der udviklet flere konfigurationer til stimulering af osteocytter med mekanisk belastning og kvantificering af funktionelle resultater af knogleombygning (figur 1B).
Under spånsamling var optimering af plasmaoxidationsprotokollen afgørend...

Bone er en meget dynamisk væv, der kræver indviklet koordinering blandt de tre store celletyper: osteocytter, osteoblaster, og osteoklaster. Flercellulære interaktioner mellem disse celler er ansvarlige for knogletab, der opstår under lammelse og langvarig ubevægelighed og for knogledannelse, der opstår som reaktion på vækst og motion. Osteocytter, den mest rigelige knoglecelletype, er meget følsomme over for mekaniske stimuli anvendes på knoglen. Mekanisk stimulation ændrer osteocyt metabolisk aktivitet og fører til en stigning i centrale signalering molekyler1,2. Gennem denne proces, kendt som mechanotransduktion, osteocytter kan direkte koordinere aktiviteterne i osteoblaster (knogledannende celler) og osteoklaster (knogle resorbing celler). Vedligeholdelse knogle homøostase kræver en stram regulering mellem knogledannelse og knogle resorption satser; men, forstyrrelser i denne proces kan resultere i sygdomstilstande såsom osteoporose eller osteopetrose.
Kompleksiteten af interaktioner mellem disse tre celletyper egner sig godt til undersøgelse udnytte mikrofluidiske og lab-on-a-chip (LOC) teknologier. Med henblik herpå har vores laboratorium for nylig etableret proof of concept af en LOC platform til analyse af knogleresorption og dannelse (funktionelle resultater) i knoglen remodeling processen. Platformen kan bruges til undersøgelse af cellulære interaktioner, ændrede lastning miljøer, og investigational drug screening. I de seneste år er forskellige mikrofluidiske enheder blevet udviklet til at undersøge de molekylære signalveje, der regulerer knogleremodellering; Mange af disse systemer kvantificerer imidlertid ommodelleringen ved hjælp af indirekte markører , der er tegn på funktionel aktivitet3,4,5,6,7. En fordel ved vores system er, at det kan bruges til direkte kvantificering af funktionelle resultater. Knogleremodellering er en langsigtet proces. Som sådan kræver direkte kvantificering af knoglersorption og dannelse et dyrkningssystem , der kan opretholdes i mindst flere uger til månederne 8,9,10,11. Således, når udviklingen af LOC platform, vi etableret langsigtede dyrkning protokoller er nødvendige for dannelse og resorption og har opretholdt celler i systemet i op til syv uger11. Derudover har vi indarbejdet passende dyrkningssubstrater for begge celletyper i platformen; osteoklaster blev dyrket direkte på knoglen, og osteoblaster, som er kendt for at være plastik klæbende, blev dyrket på polystyren diske. Endvidere har vi behandlet spørgsmål vedrørende sterilitet, langsigtet cytotoksicitet og spåndeenhed til remodeling analyse11,12.
LOC-platformen kan også bruges til at fremkalde osteocyt mechanotransduktion gennem matrixdeformation. En 3D trykt mekanisk lastning enhed blev udviklet til at parre med LOC og anvende en statisk ud af flyet udaf flyet udistention at strække cellerne13. For at imødekomme denne mekaniske belastning blev dybden af brønden i LOC øget. Denne lille skala, enkel mekanisk lastning enhed kan nemt produceres af laboratorier med begrænset teknisk erfaring, og vi har tidligere delt tegninger af 3D trykte komponenter13. I det nuværende arbejde demonstrerer vi nogle af de nye teknikker, der er nødvendige for en vellykket brug af LOC. Specifikt demonstrerer vi spånfremstilling, cellesåning på funktionelle substrater, mekanisk belastning og spåndemontering til remodellering af kvantificering. Vi mener, at forklaringen på disse teknikker drage fordel af et visuelt format.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet</td>
			<td>Optix</td>
			<td>--</td>
			<td>3.175 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled dispensing tips</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG18-0.5X-90</td>
			<td>Remove plastic connector prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Robbins Instruments</td>
			<td>RBP-10</td>
			<td>1 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wafers</td>
			<td>Boneslices.com</td>
			<td>0.4 mm thick</td>
			<td>Bovine cortical bone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine calf serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calipers</td>
			<td>Global Industrial</td>
			<td>T9F534164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spatula</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip mask</td>
			<td>ProtoLabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Print material: Accura SL 5530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-865-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicator</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (100 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td>Sterile, Non-tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (150 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td>Sterile, Non-tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch 237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leveling box</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>--</td>
			<td>3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scoth 2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC3T3-E1 preosteoblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2593</td>
			<td>Subclone 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical loading device</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>--</td>
			<td>3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential alpha medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLO-Y4 osteocytes</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>Gift from Dr. Lynda Bonewald</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Packaging tape</td>
			<td>Duck Brand</td>
			<td>--</td>
			<td>Standard packaging tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis Parafilm</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>p4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td>Expanded plasma cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene coverslips</td>
			<td>Nunc Thermanox</td>
			<td>174942</td>
			<td>Sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Quincy Lab</td>
			<td>12-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7 preosteoclasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>372611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>ID: 1/32&#34; (0.79 mm), OD: 3/32&#34; (2.38 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks software</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td>--</td>
			<td>Used to generate 3D printed models and perform FEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>2323879</td>
			<td>Multi-purpose adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (5 ml)</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>309646</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2213</td>
			<td>Pump 11 Pico Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapered laboratory spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-part expoxy</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1395391</td>
			<td>5 minute quick set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Rat tail collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42010-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof sealant</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>8090001</td>
			<td>100% silicone sealant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a lab-on-a-chip platform for stimulating osteocyte mechanotransduction and analyzing functional outcomes of bone remodeling

Bone remodeling er en stramt reguleret proces, der er nødvendig for skeletvækst og reparation samt tilpasning til ændringer i det mekaniske miljø. Under denne proces, mechanosensitive osteocytter regulere de modsatrettede reaktioner mellem katabolske osteoklaster og anabolske osteoblaster. For bedre at forstå de meget indviklede signalveje, der regulerer denne proces, har vores laboratorium udviklet en grundlæggende lab-on-a-chip (LOC) platform til analyse af funktionelle resultater (dannelse og resorption) af knogleremodellering inden for et lille system. Som knogle remodeling er en langvarig proces, der opstår i størrelsesordenen uger til måneder, vi udviklede langsigtede celle dyrkning protokoller i systemet. Osteoblaster og osteoklaster blev dyrket på funktionelle aktivitetssubstrater i LOC og opretholdt i op til syv uger. Derefter blev chips skilt ad for at muliggøre kvantificering af knogledannelse og resorption. Derudover har vi designet en 3D-printet mekanisk lasteenhed, der parrer med LOC-platformen og kan bruges til at fremkalde osteocyte mechanotransduktion ved at deformere cellulære matrix. Vi har optimeret celledyrkningsprotokoller for osteocytter, osteoblaster og osteoklaster i LOC-platformen og har behandlet problemer med sterilitet og cytotoksicitet. Her præsenterer vi protokollerne til fremstilling og sterilisering af LOC, såning celler på funktionelle substrater, inducerende mekanisk belastning, og demontering loc at kvantificere slutpunkt resultater. Vi mener, at disse teknikker lægger grunden til at udvikle en sand orgel-on-a-chip til knogleremodellering.

Den lavvandede-godt konfiguration kan bruges til at analysere funktionelle aktivitet af osteoblaster og osteoklaster. Knogledannelse via osteoblaster og resorption via osteoklaster kræver dyrkningstider i størrelsesordenen flere uger til måneder. Knogledannelse fra MC3T3-E1 pre-osteoblaster blev kvantificeret ved hjælp af alizarinrøde og von Kossa pletter11,15. På dag 49 var det gennemsnitlige overfladeareal, der var plettet...

Watch this Scientific Journal Video about A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling at JoVE.com

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Her præsenterer vi protokoller til analyse af knoglerremodellering i en lab-on-a-chip platform. En 3D-printet mekanisk belastningsenhed kan parres med platformen for at fremkalde osteocyte mechanostransduktion ved at deformere den cellulære matrix. Platformen kan også bruges til at kvantificere knogleremodelleringsfunktionelle resultater fra osteoklaster og osteoblaster (resorption/dannelse).

En Lab-On-A-Chip platform til stimulering af Osteocyte Mechanotransduction og analyse af funktionelle resultater af Bone Remodeling

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

Her præsenterer vi protokoller for dyrkning af knogleceller inden for en fleksibel lab-on-a-chip platform. Disse teknikker kan bruges til at fremme vores forståelse af de mekanismer, der regulerer mekanisk induceret knogle remodeling. Vores system giver mulighed for langsigtet dyrkning af knogleceller, som muliggør direkte kvantificering af knogledannelse og resorption som reaktion på ændrede mekaniske belastningsmiljøer.Brug af disse grundlæggende teknikker kan føre til opdagelser, der strækker sig til en række knogle-relaterede spørgsmål såsom osteoporose, fraktur healing, og periprosthetic osteolyse. For at skabe brønden og mikrokanallaget, kombinere PDMS prepolymer og hærdningsmiddel i et forhold på 10 til en i en plastik kop og bland kraftigt, derefter degas polymeren i 30 minutter. Hæld langsomt blandingen over den relevante forplantede maske.Lad det sidde i 30 minutter og bage det ved 45 grader Celsius i 18 timer. Løsn kanterne af PDMS med en tilspidset laboratoriespatel og skræl den forsigtigt væk fra masken, og skær derefter individuelle spåner ud med en skalpel og en 3D-printet skabelon og overflade rense dem med emballagetape. For at gøre PDMS membran lag, gentag de foregående trin til blanding, hælde, og bagning PDMS.Fjern PDMS ark fra nivellering boksen og skære individuelle membraner, der matcher dimensionerne af brønden og mikrokanal lag. Brug calipre til at måle membrantykkelsen i midten og kassér eventuelle membraner, der er uden for den ønskede tykkelse, og rengør derefter omhyggeligt membranerne med emballagetape og læg dem på et stykke paraffinfilm. For at gøre PDMS låg lag, gentag de foregående trin til blanding, hælde, og bagning pdms.Efter at have skåret individuelle låg til størrelse, punch adgang huller gennem PDMS med en en millimeter biopsi punch og derefter overflade rense dem med emballage tape. Aktiver overfladerne af lag et og to med en plasmarenser i 30 sekunder på en medium radiofrekvenseffektindstilling, og juster derefter adgangshullerne i lag et med mikrokanalerne i lag to og tryk godt de to lag sammen. For deep-well design, gentag denne proces med lag to og tre ved hjælp af dobbeltsidet tape til at fastgøre paraffin film af lag tre til en flad overflade under plasmabehandling.Trim overskydende materiale fra PDMS membranen og forsigtigt skrælle væk ark paraffin film fra bunden af chippen. Bag chippen ved 65 grader Celsius i 10 minutter for at øge bindingsstyrken mellem PDMS-lagene, og indsæt derefter vinkeludseende i adgangshullerne i låget og fastgør dem med en todelt epoxy ved hjælp af en mikropipettespids til at påføre epoxyen omkring hver spids. Når epoxyen er helt hærdet, rengøres chippen med 70% ethanol, og den overføres til et biosikkerhedsskab.Tilslut en fem millilitersprøjte til dispenserspidserne med sterile silikoneslanger, og fyld hele chippen med 70% ethanol i mindst 30 sekunder. Fjern ethanolen fra chippen og steriliser den med UV-lys natten over. Den næste dag vaskes spånen tre gange med destilleret vand, fyldes med vand og tages ud af dispenserspidserne.Inkuber chippen i mindst 48 timer ved 37 grader Celsius. Placer en kompression fjeder omkring pladens aksel og sæt den ind i det centrale hul i bunden af basen, og fastgør derefter drejeblokken til bunden af basen med fire selvskærende skruer. Placer en anden kompressionsfjeder omkring den centrale skrue.Sæt skruen ind i det sekskantede hul i bunden af skiven og skru samlingen ind i det gevindhul i midten af urskiveblokken. Skru fire mandlige-kvindelige modsætninger i bunden af basen. Fjern slæk fra enheden ved at dreje skiven mod uret, indtil toppen af pladen er under toppen af basen, drej derefter langsomt skiven med uret, indtil toppen af pladen er i niveau med toppen af basen.Brug en fem milliliter sprøjte til at fjerne vandet fra den dybe-godt chip og pels bunden af brønden med 200 mikroliter af type I kollagen i eddikesyre i en time. Skyl chippen tre gange med DPBS med calcium og magnesium, og læg den i spånholderen. Frø chippen med MLO-Y4 osteocytter i MEM alfa medium suppleret med kalv serum, FBS, og penicillin / streptomycin.Fjern slangen fra dispenserspidserne, placer chippen i en dyb brøndkulturskål, og inkuber cellerne ved 37 grader Celsius og fem procent kuldioxid i 72 timer. Efter inkubationen fastgøres sterile slanger til dispenserspidserne, og der skal anvendes en fem millilitersprøjte til at fjerne det brugte kulturmedium fra chippen, og opfyld derefter langsomt chippen med frisk medium. Sæt spånholderen i det rektangulære indstænkning på toppen af læsseanordningens bund, før slangen gennem rillerne på låget, og fastgør låget til basen.Påfør belastning på cellerne ved at dreje skiven med uret, indtil den ønskede forskydning af ler er nået, og placer derefter lasteanordningen i en tom P1000-mikropipettespidsboks, og cellerne inkuberes med belastningen i 15 minutter. Efter inkubationen fjernes belastningen fra cellerne ved at dreje skiven mod uret til den oprindelige udgangsposition, derefter fjernes låget fra enheden, placere spånholderen i dybblæste kulturpladen og inkubere cellerne i en 90-minutters restitutionsperiode efter belastningen. Brug en fem milliliter sprøjte til at fjerne det konditionerede medium fra chippen og fjern chippen fra chippen indehaveren, og brug derefter en tilspidset spatel til at bryde bindingen mellem PDMS låget og godt lag.Cellerne er nu klar til at blive analyseret. Den lavvandede-brønd konfiguration kan bruges til at analysere funktionelle aktivitet af osteoblaster og osteoklaster. Knogledannelse fra preosteoblaster blev kvantificeret ved hjælp af alizarin rød og von Kossa pletter.Knogle resorption fra osteoklaster blev kvantificeret ved hjælp af toluidin blå farvning og scanning elektronmikroskopi blev brugt til at kontrollere tilstedeværelsen af resorption gruber. Den dybblyne chip konfiguration blev brugt til at fremkalde osteocyte mechanotransduction ved at strække cellerne via en statisk ud af flyet udspiling. Billeder af osteocyt, der er seedet i spåner, viser, at 48-timers inkubation af chippen med destilleret vand er afgørende for at opretholde cellernes levedygtighed i typisk morfologi.Under anfald af belastning blev osteocytter udsat for en stammegradient, der blev induceret på PDMS-membranen. Forholdet mellem gennemsnitlig tilsvarende stamme og forskydning af plader for værdier mellem en og to millimeter blev bestemt, og der blev genereret et repræsentativt varmekort over den inducerede stamme. Efter belastningen blev cellernes levedygtighed analyseret med laktatdehydrogenasefarvning og annekset V og dødcelleanalyse.Laktatdehydrogenaseplet af strakte osteocytter viste en lysere farvning nær brøndens yderkant, hvilket svarer til placeringen af højere stammeværdier. Vores platform giver en høj grad af alsidighed og kan bruges til at undersøge en række faktorer, der regulerer knogle remodeling såsom belastning-induceret mechanotransduction, inflammation, og narkotika effekter. De teknikker, der præsenteres her giver et fundament for at udvikle en sand knogle organ på en chip, der i høj grad kunne øge vores forståelse af de multicellulære snørklede, der regulerer knogle sundhed.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Miljømæssigt-kontrolleret Microtensile Afprøvning af Mekanisk adaptive Polymer Nanokompositter for<em&gt; Ex vivo</em&gt; Karakterisering

Implantable microdevices are gaining significant attention for several biomedical applications1-4. Such devices have been made from a range of materials, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

En alsidig Automatiseret platform for Micro-skala cellestimulering Eksperimenter

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Fremstilling af Hydroxy-PAAM hvdroqeler for afkobling virkningerne af Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

A Novel Stretching Platform for Applications i cellebiologi og Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Gradient stamme Chip nemlig stimulere cellulære opførsel i celle-belæsset Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En Mikrofluid platform for High-throughput Single-celle Isolering og Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Mikrofluid Platform med Multiplexed Elektronisk Detection for fysisk sporing af partikler

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Samling og sporing af mikrobiell fællesskabsudvikling inden for en Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Fabrikation og validering af et orgel-on-chip-System med integreret elektroder til direkte kvantificere Transendothelial elektrisk modstand

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...