Name: a lab-on-a-chip platform for stimulating osteocyte mechanotransduction and analyzing functional outcomes of bone remodeling
Uploaded: 2020-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation in het kader van Grant Nos. (CBET 1060990 en EBMS 1700299). Ook is dit materiaal gebaseerd op werk ondersteund door de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program onder Grant No. (2018250692). Alle adviezen, bevindingen, conclusies, of aanbevelingen uitgedrukt in dit materiaal zijn die van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de National Science Foundation weerspiegelen.

1. Voorbereiding van het chipmasker
LET OP: Stappen 1.1 - 1.3 hoeven slechts eenmaal te worden uitgevoerd bij de eerste ontvangst van het chipmasker. Ze zorgen ervoor dat het masker niet buigt tijdens het gebruik. Het ontwerp van de microfluïdische maskers werd eerder beschreven11,14. Maskers werden ontworpen in-house en commercieel vervaardigd met behulp van hoge resolutie stereolithografie (Figuur 1<stron...

<ol>
	<li>Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+Osteocytes,+and+Mechanotransduction.">Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction.</a> Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amazing+osteocyte.">The amazing osteocyte.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).</li><li>Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+co-culture+platform+for+investigating+osteocyte-osteoclast+signalling+during+fluid+shear+stress+mechanostimulation.">Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation.</a> Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).</li><li>Kou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multishear+microfluidic+device+for+quantitative+analysis+of+calcium+dynamics+in+osteoblasts.">A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).</li><li>Ma, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chip-based+co-culture+of+fibroblast-like+synoviocytes+with+osteoblasts+and+osteoclasts+to+test+bone+erosion+and+drug+evaluation.">A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation.</a> Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).</li><li>Jang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+osteoblast-based+3D+continuous-perfusion+microfluidic+system+for+drug+screening.">Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic-based+multi-shear+device+for+investigating+the+effects+of+low+fluid-induced+stresses+on+osteoblasts.">A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts.</a> PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).</li><li>Hwang, P. W., Horton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+osteogenic+performance+of+MC3T3-E1+subclones+impacts+their+utility+as+models+of+osteoblast+biology.">Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).</li><li>Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+lifetime+lead+exposure+impedes+osteoclast+activity+and+produces+an+increase+in+bone+mass+in+adolescent+mice.">Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice.</a> Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).</li><li>Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+growth+factor+control+of+bone+formation+through+osteoprogenitor+differentiation.">Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation.</a> Bone. 34 (3), 402-411 (2004).</li><li>George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip+platforms+for+quantification+of+multicellular+interactions+in+bone+remodeling.">Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling.</a> Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).</li><li>Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+considerations+for+optimizing+bone+cell+culture+and+remodeling+in+a+lab-on-a-chip+platform.">Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform.</a> Biotechniques. , (2019).</li><li>Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printed+loading+device+for+inducing+cellular+mechanotransduction+via+matrix+deformation.">3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation.</a> Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).</li><li>George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+mechanically+loaded+osteocytes+and+inflammation+on+bone+remodeling+in+a+bisphosphonate-induced+environment.">The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment.</a> Bone. 127, 460-473 (2019).</li><li>George, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , (2019).</li><li>York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+osteocytic+microdamage+and+viability+quantification+using+a+microloading+platform.">In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform.</a> Medical Engineering &amp; Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).</li><li>Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+plasma+treatment+of+polymer+surface+for+irreversible+sealing+of+microfluidic+devices.">Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices.</a> Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).</li><li>Millare, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+the+quality+of+adhesion+between+poly(dimethylsiloxane)+and+glass+surfaces+on+the+conditions+of+treatment+with+oxygen+plasma.">Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma.</a> Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).</li><li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+compatibility+of+poly(dimethylsiloxane)-based+microfluidic+devices.">Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices.</a> Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).</li><li>Regehr, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+implications+of+polydimethylsiloxane-based+microfluidic+cell+culture.">Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture.</a> Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).</li><li>Wang, Y., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncured+PDMS+inhibits+myosin+in+vitro+motility+in+a+microfluidic+flow+cell.">Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell.</a> Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).</li><li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities.">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).</li><li>Kilic, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-on-a-chip+model+enables+analysis+of+human+neuronal+differentiation+and+chemotaxis.">Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis.</a> Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).</li><li>Van Scoy, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+automata+model+of+bone+formation.">A cellular automata model of bone formation.</a> Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).</li><li>Truesdell, S. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+remodeling+platforms:+Understanding+the+need+for+multicellular+lab-on-a-chip+systems+and+predictive+agent-based+models.">Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models.</a> Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).</li></ol>

Dit artikel beschrijft de fundamenten voor het fabriceren van een bot remodelleren LOC platform voor het kweken van osteocyten, osteoclasten, en osteoblasten. Door de diepte en grootte van de put in de chip te veranderen, werden meerdere configuraties ontwikkeld voor het stimuleren van osteocyten met mechanische belasting en het kwantificeren van functionele resultaten van botremodelleren(figuur 1B).
Tijdens de spaanmontage was het optimaliseren v...

Bot is een zeer dynamisch weefsel dat ingewikkelde coördinatie tussen de drie belangrijkste celtypes vereist: osteocyten, osteoblasten en osteoclasten. Meercellige interacties tussen deze cellen zijn verantwoordelijk voor het botverlies dat optreedt tijdens verlamming en langdurige immobiliteit en voor de botvorming die optreedt in reactie op groei en lichaamsbeweging. Osteocyten, de meest voorkomende botcel type, zijn zeer gevoelig voor mechanische stimuli toegepast op het bot. Mechanische stimulatie verandert osteocyte metabolische activiteit en leidt tot een toename van de belangrijkste signaalmoleculen1,2. Door dit proces, bekend als mechanotransductie, kunnen osteocyten de activiteiten van osteoblasten (botvormende cellen) en osteoclasten (botresortencellen) direct coördineren. Het handhaven van bothomeostase vereist een strakke regeling tussen botvorming en botresorptiepercentages; echter, verstoringen in dit proces kan leiden tot ziekte toestanden zoals osteoporose of osteopetrorose.
De complexiteit van de interacties tussen deze drie celtypen leent zich goed voor onderzoek met behulp van microfluidic en lab-on-a-chip (LOC) technologieën. Daartoe heeft ons lab onlangs een proof of concept van een LOC-platform opgezet voor het analyseren van botresorptie en vorming (functionele uitkomsten) in het botremodelleringsproces. Het platform kan worden gebruikt voor de studie van cellulaire interacties, veranderde laadomgevingen en onderzoekende drugsscreening. In de afgelopen jaren zijn verschillende microfluïdische apparaten ontwikkeld voor het onderzoeken van de moleculaire signaleringstrajecten die het remodelleren van botten reguleren; Veel van deze systemen kwantificeren echter de herinrichting door middel van indirecte merkers die wijzen op functionele activiteit3,4,5,6,7. Een voordeel van ons systeem is dat het kan worden gebruikt voor directe kwantificering van functionele resultaten. Bot remodelleren is een proces op lange termijn. Als zodanig vereist directe kwantificering van botresorptie en vorming een kweeksysteem dat gedurende ten minste enkele weken tot maanden8,9,10,11kan worden gehandhaafd . Zo hebben we bij de ontwikkeling van het LOC-platform langdurige kweekprotocollen opgesteld die nodig zijn voor vorming en resorptie en hebben we cellen in het systeem tot zeven weken11onderhouden. Daarnaast hebben we geschikte kweeksubstraten voor beide celtypen in het platform verwerkt; osteoclasten werden gekweekt direct op het bot, en osteoblasten, waarvan bekend is dat plastic aanhanger, werden gekweekt op polystyreen schijven. Verder hebben we kwesties met betrekking tot steriliteit, cytotoxiciteit op lange termijn en spaan van de chip voor remodelleren analyse11,12.
Het LOC-platform kan ook worden gebruikt om osteocyte mechanotransductie te induceren door matrixvervorming. Een 3D-geprint mechanisch laadapparaat werd ontwikkeld om te koppelen met de LOC en een statische uit vliegtuigdistentie toe te passen om de cellen13uit te rekken. Om deze mechanische belasting aan te kunnen, werd de diepte van de put binnen de LOC vergroot. Deze kleine schaal, eenvoudige mechanische laadinrichting kan gemakkelijk worden geproduceerd door laboratoria met beperkte technische ervaring, en we hebben eerder gedeeld tekeningen van de 3D-geprinte componenten13. In het huidige werk demonstreren we enkele van de nieuwe technieken die nodig zijn voor het succesvol gebruik van de LOC. Concreet demonstreren we chipfabricage, celzaaien op functionele substraten, mechanische belasting en spaanvan de chip voor het verbouwen van kwantificering. Wij geloven dat de uitleg van deze technieken profiteren van een visueel formaat.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet</td>
			<td>Optix</td>
			<td>--</td>
			<td>3.175 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled dispensing tips</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG18-0.5X-90</td>
			<td>Remove plastic connector prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Robbins Instruments</td>
			<td>RBP-10</td>
			<td>1 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wafers</td>
			<td>Boneslices.com</td>
			<td>0.4 mm thick</td>
			<td>Bovine cortical bone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine calf serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calipers</td>
			<td>Global Industrial</td>
			<td>T9F534164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spatula</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip mask</td>
			<td>ProtoLabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Print material: Accura SL 5530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-865-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicator</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (100 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td>Sterile, Non-tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (150 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td>Sterile, Non-tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch 237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leveling box</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>--</td>
			<td>3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scoth 2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC3T3-E1 preosteoblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2593</td>
			<td>Subclone 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical loading device</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>--</td>
			<td>3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential alpha medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLO-Y4 osteocytes</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>Gift from Dr. Lynda Bonewald</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Packaging tape</td>
			<td>Duck Brand</td>
			<td>--</td>
			<td>Standard packaging tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis Parafilm</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>p4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td>Expanded plasma cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene coverslips</td>
			<td>Nunc Thermanox</td>
			<td>174942</td>
			<td>Sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Quincy Lab</td>
			<td>12-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7 preosteoclasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>372611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>ID: 1/32&#34; (0.79 mm), OD: 3/32&#34; (2.38 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks software</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td>--</td>
			<td>Used to generate 3D printed models and perform FEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>2323879</td>
			<td>Multi-purpose adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (5 ml)</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>309646</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2213</td>
			<td>Pump 11 Pico Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapered laboratory spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-part expoxy</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1395391</td>
			<td>5 minute quick set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Rat tail collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42010-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof sealant</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>8090001</td>
			<td>100% silicone sealant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a lab-on-a-chip platform for stimulating osteocyte mechanotransduction and analyzing functional outcomes of bone remodeling

Bot remodelleren is een strak gereguleerd proces dat nodig is voor skeletgroei en reparatie, alsmede aan te passen aan veranderingen in de mechanische omgeving. Tijdens dit proces regelen mechanogevoelige osteocyten de tegengestelde reacties tussen de katabole osteoclasten en anabole osteoblasten. Om beter te begrijpen van de zeer ingewikkelde signaleringstrajecten die dit proces reguleren, heeft ons lab een fundamenteel lab-on-a-chip (LOC) platform ontwikkeld voor het analyseren van functionele uitkomsten (vorming en resorptie) van botremodelleren binnen een kleinschalig systeem. Aangezien botremodellering een langdurig proces is dat plaatsvindt in de orde van weken tot maanden, ontwikkelden we langetermijncelkweekprotocollen binnen het systeem. Osteoblasten en osteoclasten werden gekweekt op functionele activiteitsubstraten binnen de LOC en gedurende maximaal zeven weken onderhouden. Daarna werden chips gedemonteerd om de kwantificering van botvorming en resorptie mogelijk te maken. Daarnaast hebben we een 3D-geprint mechanisch laadapparaat ontworpen dat paren met het LOC-platform en kan worden gebruikt om osteocyte mechanotransductie te induceren door de cellulaire matrix te vervormen. We hebben celkweekprotocollen voor osteocyten, osteoblasten en osteoclasten binnen het LOC-platform geoptimaliseerd en hebben zorgen over steriliteit en cytotoxiciteit aangepakt. Hier presenteren we de protocollen voor het fabriceren en steriliseren van de LOC, het zaaien van cellen op functionele substraten, het opwekken van mechanische belasting en het demonteren van de LOC om eindpuntresultaten te kwantificeren. Wij geloven dat deze technieken de basis leggen voor het ontwikkelen van een echte orgaan-op-een-chip voor botremodellering.

De ondiepe-goed configuratie kan worden gebruikt voor het analyseren van functionele activiteit van osteoblasten en osteoclasten. Botvorming via osteoblasten en resorptie via osteoclasten vereist kweektijden in de orde van enkele weken tot maanden. Botvorming van MC3T3-E1 pre-osteoblasten werd gekwantificeerd met alizarine rood en von Kossa vlekken11,15. Op dag 49 was de gemiddelde oppervlakte gekleurd met alizarin rood 10,7% ± 2...

Watch this Scientific Journal Video about A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling at JoVE.com

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Hier presenteren we protocollen voor het analyseren van botremodellering binnen een lab-on-a-chip platform. Een 3D-geprint mechanisch laadapparaat kan worden gekoppeld aan het platform om osteocyte mechanostransductie te induceren door de cellulaire matrix te vervormen. Het platform kan ook worden gebruikt om botremodellering functionele resultaten van osteoclasten en osteoblasten (resorptie / vorming) te kwantificeren.

Een Lab-On-A-Chip Platform voor het stimuleren van Osteocyte Mechanotransductie en het analyseren van functionele resultaten van bone remodeling

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

Hier presenteren we protocollen voor het kweken van botcellen binnen een aanpasbaar lab-on-a-chip platform. Deze technieken kunnen worden gebruikt om ons begrip van de mechanismen die mechanisch geïnduceerde bot remodelleren regelen. Ons systeem maakt het mogelijk om op lange termijn botcellen te kweken, wat directe kwantificering van botvorming en resorptie mogelijk maakt in reactie op veranderde mechanische belastingomgevingen.Het gebruik van deze fundamentele technieken kan leiden tot ontdekkingen die zich uitstrekken tot een aantal botgerelateerde problemen zoals osteoporose, fractuurgenezing en periprosthetische osteolyse. Om de put- en microkanaallaag te maken, combineert u het PDMS prepolymeer en het uithardingsmiddel bij een verhouding van 10 tegen één in een plastic beker en meng het het polymeer vervolgens gedurende 30 minuten. Giet het mengsel langzaam over het juiste voorgekileerde masker.Laat het zitten voor 30 minuten en bak het op 45 graden Celsius voor 18 uur. Maak de randen van de PDMS los met een taps toelopende laboratoriumspatel en pel het voorzichtig van het masker, knip vervolgens individuele chips uit met een scalpel en een 3D-geprinte sjabloon en maak ze schoon met verpakkingstape. Als u de PDMS-membraanlaag wilt maken, herhaalt u de vorige stappen voor het mengen, gieten en bakken van de PDMS.Verwijder het PDMS-vel uit de egalingsdoos en snijd afzonderlijke membranen die overeenkomen met de afmetingen van de put- en microkanaallaag. Gebruik remklauwen om de membraandikte in het midden te meten en verwijder alle membranen die buiten de gewenste dikte vallen, maak de membranen voorzichtig schoon met verpakkingstape en leg ze op een stuk paraffinefilm. Als u de PDMS-deksellaag wilt maken, herhaalt u de vorige stappen voor het mengen, gieten en bakken van de PDMS.Na het snijden van individuele deksels op maat, punch toegang gaten door de PDMS met een een millimeter biopsie punch en vervolgens oppervlak schoon te maken met verpakkingstape. Activeer de oppervlakken van de lagen een en twee met een plasmareiniger gedurende 30 seconden op een medium radiofrequentiekrachtinstelling, lijn vervolgens de toegangsgaten in laag één uit met de microkanalen in laag twee en druk de twee lagen stevig tegen elkaar. Voor het diepe ontwerp, herhaal dit proces met lagen twee en drie met behulp van dubbelzijdige tape om de paraffine film van laag drie hechten aan een vlakke ondergrond tijdens plasmabehandeling.Snijd overtollig materiaal van het PDMS-membraan af en pel voorzichtig het blad paraffinefilm van de onderkant van de chip. Bak de chip op 65 graden Celsius gedurende 10 minuten om de bindingssterkte tussen de PDMS-lagen te verhogen, plaats vervolgens hoekafgiftepunten in de toegangsgaten in het deksel en bevestig ze met een tweedelige epoxy met behulp van een micropipet-tip om de epoxy rond elke tip aan te brengen. Nadat de epoxy volledig is uitgehard, reinig het oppervlak de chip met 70% ethanol en breng deze over naar een bioveiligheidskast.Sluit een spuit van vijf milliliter aan op de afsnijtips met steriele siliconen buizen en vul de hele chip met 70% ethanol gedurende ten minste 30 seconden. Haal de ethanol uit de chip en steriliseer deze 's nachts met UV-licht. Op de volgende dag, was de chip drie keer met gedestilleerd water, vul het met water, en verwijder de slang uit de dispensing tips.Incubeer de chip voor ten minste 48 uur op 37 graden Celsius. Plaats een compressieveer rond de as van de platen en plaats deze in het centrale gat aan de onderkant van de basis en bevestig het draaiblok vervolgens aan de onderkant van de basis met vier zelftappende schroeven. Plaats een tweede compressieveer rond de centrale schroef.Steek de schroef in het zeshoekige gat in de onderkant van de wijzerplaat en schroef de montage in het schroefdraadgat in het midden van het wijzerplaatblok. Schroef vier man-vrouw impasses in de bodem van de basis. Verwijder speling van het apparaat door de wijzerplaat tegen de klok in te draaien totdat de bovenkant van de platen zich onder de bovenkant van de basis bevindt en draai de wijzerplaat langzaam met de klok mee totdat de bovenkant van de platen vlak is met de bovenkant van de basis.Gebruik een vijf milliliter spuit om het water te verwijderen uit de deep-well chip en de vacht van de bodem van de put met 200 microliter van type I collageen in azijnzuur voor een uur. Spoel de chip drie keer af met DPBS met calcium en magnesium en plaats deze in de chiphouder. Zaad de chip met MLO-Y4 osteocyten in MEM alfa medium aangevuld met kalf serum, FBS, en penicilline / streptomycine.Verwijder de slang uit de afgiftetips, plaats de chip in een diep-goed cultuur schotel, en broeden de cellen op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide voor 72 uur. Na de incubatie, bevestig steriele buizen aan het verstrekken van tips en gebruik een vijf milliliter spuit om de gebruikte cultuur medium te verwijderen uit de chip, dan langzaam vullen de chip met vers medium. Plaats de spaanhouder in het rechthoekige inzet aan de bovenkant van de basis van het laadapparaat, voer de slang door de sleuven op het deksel en sluit het deksel aan de basis.Breng de belasting op de cellen aan door de wijzerplaat met de klok mee te draaien totdat de gewenste platenverplaatsing is bereikt, plaats het laadapparaat vervolgens in een lege P1000 micropipette tipbox en ontcubeer de cellen 15 minuten met de belasting. Na de incubatie, verwijder de belasting van de cellen door het draaien van de wijzerplaat tegen de klok in naar de oorspronkelijke startpositie, verwijder dan het deksel van het apparaat, plaats de chip houder in de deep-well cultuurplaat, en broeden de cellen voor een 90 minuten na belasting herstelperiode. Gebruik een spuit van vijf milliliter om het geconditioneerde medium uit de chip te verwijderen en de chip uit de chiphouder te verwijderen en gebruik vervolgens een taps toelopende spatel om de band tussen het PDMS-deksel en de putlaag te breken.De cellen zijn nu klaar om geanalyseerd te worden. De shallow-well configuratie kan worden gebruikt voor het analyseren van functionele activiteit van osteoblasten en osteoclasten. Botvorming van preosteoblasten werd gekwantificeerd met behulp van alizarin rood en von Kossa vlekken.Bot resorptie van osteoclasten werd gekwantificeerd met behulp van toluidine blauwe vlekken en scanning elektronenmicroscopie werd gebruikt om de aanwezigheid van resorptie putten te controleren. De deep-well chip configuratie werd gebruikt om osteocyten mechanotransductie te induceren door het uitrekken van de cellen via een statische uit het vlak distension. Afbeeldingen van osteocyten gezaaid in chips tonen aan dat de 48-uurs incubatie van de chip met gedestilleerd water van cruciaal belang is voor het behoud van de levensvatbaarheid van cellen in typische morfologie.Tijdens de aanvallen van het laden, osteocyten werden blootgesteld aan een stam gradiënt geïnduceerd op de PDMS membraan. De relatie tussen gemiddelde equivalente stam en platenverplaatsing voor waarden tussen één en twee millimeter werd bepaald en er werd een representatieve warmtekaart van de geïnduceerde stam gegenereerd. Na het laden werd de levensvatbaarheid van de cel geanalyseerd met lactaatdehydrogenase kleuring en de bijlage in V en dode celtest.Lactaat dehydrogenase vlek van uitgerekte osteocyten toonde een lichtere kleuring in de buurt van de buitenste rand van de put, die overeenkomt met de locatie van hogere stamwaarden. Ons platform biedt een hoge mate van veelzijdigheid en kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan factoren te onderzoeken die botremodellering reguleren, zoals door belasting geïnduceerde mechanotransductie, ontsteking en medicijneffecten. De hier gepresenteerde technieken vormen een basis voor het ontwikkelen van een echt botorgel op een chip die ons begrip van de meercellige fijne kneepjes die de gezondheid van het bot reguleren sterk kunnen verbeteren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Axon Stretch groei: de Mechanotransductie van neuronale groei

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Milieuvriendelijke gecontroleerde Microtensile Testen van mechanisch-adaptieve nanocomposieten voor<em&gt; Ex vivo</em&gt; Karakterisering

Implantable microdevices are gaining significant attention for several biomedical applications1-4. Such devices have been made from a range of materials, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Een veelzijdige Geautomatiseerde platform voor micro-schaal cel stimulatie Experimenten

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Voorbereiding van Hydroxy-PAAM Hydrogelen voor Ontkoppeling van de Effecten van Mechanotransductie Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Kleurovergang stam Chip voor de stimulerende cellulaire gedrag in cel-beladen Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluïdische Platform met multiplexverzending elektronische detectie voor ruimtelijke Tracking van Deeltjes

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Montage en Tracking van Microbiële Community Development binnen een Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Fabricage en validatie van een orgel-on-chip systeem met geïntegreerde elektroden te kwantificeren direct signaalcomplexen elektrische weerstand

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...