Name: a lab-on-a-chip platform for stimulating osteocyte mechanotransduction and analyzing functional outcomes of bone remodeling
Uploaded: 2020-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation sous Grant Nos. (CBET 1060990 et EBMS 1700299). De plus, ce matériel est basé sur des travaux soutenus par le National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program dans le cadre de la subvention no 2018250692). Les opinions, les conclusions, les conclusions ou les recommandations exprimées dans ce document sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue de la National Science Foundation.

1. Préparation de masque de puce
REMARQUE : Les étapes 1.1 - 1.3 n’ont qu’à être exécutées une fois à la réception initiale du masque à puce. Ils s’assurent que le masque ne s’incline pas pendant l’utilisation. La conception des masques microfluidiques a été précédemment décrite11,14. Les masques ont été conçus à l’interne et fabriqués commercialement à l’aide d’une stéréolithographie haute résoluti...

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	<li>Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+Osteocytes,+and+Mechanotransduction.">Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction.</a> Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amazing+osteocyte.">The amazing osteocyte.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).</li><li>Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+co-culture+platform+for+investigating+osteocyte-osteoclast+signalling+during+fluid+shear+stress+mechanostimulation.">Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation.</a> Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).</li><li>Kou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multishear+microfluidic+device+for+quantitative+analysis+of+calcium+dynamics+in+osteoblasts.">A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).</li><li>Ma, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chip-based+co-culture+of+fibroblast-like+synoviocytes+with+osteoblasts+and+osteoclasts+to+test+bone+erosion+and+drug+evaluation.">A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation.</a> Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).</li><li>Jang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+osteoblast-based+3D+continuous-perfusion+microfluidic+system+for+drug+screening.">Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic-based+multi-shear+device+for+investigating+the+effects+of+low+fluid-induced+stresses+on+osteoblasts.">A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts.</a> PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).</li><li>Hwang, P. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+considerations+for+optimizing+bone+cell+culture+and+remodeling+in+a+lab-on-a-chip+platform.">Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform.</a> Biotechniques. , (2019).</li><li>Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printed+loading+device+for+inducing+cellular+mechanotransduction+via+matrix+deformation.">3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation.</a> Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).</li><li>George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+mechanically+loaded+osteocytes+and+inflammation+on+bone+remodeling+in+a+bisphosphonate-induced+environment.">The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment.</a> Bone. 127, 460-473 (2019).</li><li>George, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , (2019).</li><li>York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+osteocytic+microdamage+and+viability+quantification+using+a+microloading+platform.">In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform.</a> Medical Engineering &amp; Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).</li><li>Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+plasma+treatment+of+polymer+surface+for+irreversible+sealing+of+microfluidic+devices.">Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices.</a> Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).</li><li>Millare, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+the+quality+of+adhesion+between+poly(dimethylsiloxane)+and+glass+surfaces+on+the+conditions+of+treatment+with+oxygen+plasma.">Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma.</a> Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).</li><li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+compatibility+of+poly(dimethylsiloxane)-based+microfluidic+devices.">Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices.</a> Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).</li><li>Regehr, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+implications+of+polydimethylsiloxane-based+microfluidic+cell+culture.">Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture.</a> Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).</li><li>Wang, Y., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncured+PDMS+inhibits+myosin+in+vitro+motility+in+a+microfluidic+flow+cell.">Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell.</a> Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).</li><li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities.">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).</li><li>Kilic, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-on-a-chip+model+enables+analysis+of+human+neuronal+differentiation+and+chemotaxis.">Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis.</a> Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).</li><li>Van Scoy, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+automata+model+of+bone+formation.">A cellular automata model of bone formation.</a> Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).</li><li>Truesdell, S. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+remodeling+platforms:+Understanding+the+need+for+multicellular+lab-on-a-chip+systems+and+predictive+agent-based+models.">Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models.</a> Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).</li></ol>

Cet article décrit les fondations pour la fabrication d’une plate-forme LOC remodelant osseuse pour la culture des ostéocytes, des ostéoclastes et des ostéoblastes. En modifiant la profondeur et la taille du puits à l’intérieur de la puce, de multiples configurations ont été développées pour stimuler les ostéocytes avec une charge mécanique et quantifier les résultats fonctionnels du remodelage osseux(figure 1B).
Pendant l’assem...

L’os est un tissu très dynamique qui nécessite une coordination complexe entre les trois principaux types de cellules : ostéocytes, ostéoblastes et ostéoclastes. Les interactions multicellulaires entre ces cellules sont responsables de la perte osseuse qui se produit pendant la paralysie et l’immobilité à long terme et de la formation osseuse qui se produit en réponse à la croissance et à l’exercice. Les ostéocytes, le type de cellule osseuse le plus abondant, sont très sensibles aux stimuli mécaniques appliqués sur l’os. La stimulation mécanique modifie l’activité métabolique des ostéocytes et entraîne une augmentation des molécules de signalisation clés1,2. Grâce à ce processus, connu sous le nom de méchanotransduction, les ostéocytes peuvent coordonner directement les activités des ostéoblastes (cellules formatrices osseuses) et des ostéoclastes (cellules de résorbage des os). Le maintien de l’homéostasie osseuse exige une réglementation stricte entre la formation osseuse et les taux de résorption osseuse; cependant, les perturbations dans ce processus peuvent avoir comme conséquence des états de maladie tels que l’ostéoporose ou l’ostéopétrose.
La complexité des interactions entre ces trois types de cellules se prête bien à l’investigation utilisant les technologies microfluidiques et de laboratoire sur puce (LOC). À cette fin, notre laboratoire a récemment établi la preuve de concept d’une plate-forme LOC pour analyser la résorption et la formation osseuses (résultats fonctionnels) dans le processus de remodelage des os. La plate-forme peut être utilisée pour l’étude des interactions cellulaires, des environnements de chargement modifiés et du dépistage des médicaments par voie d’investigation. Ces dernières années, divers dispositifs microfluidiques ont été développés pour étudier les voies de signalisation moléculaire qui régulent le remodelage des os; cependant, beaucoup de ces systèmes quantifient le remodelage par des marqueurs indirects qui sont indicatifs de l’activité fonctionnelle3,4,5,6,7. Un avantage de notre système est qu’il peut être utilisé pour la quantification directe des résultats fonctionnels. Le remodelage osseux est un processus à long terme. En tant que tel, la quantification directe de la résorption osseuse et la formation nécessite un système de culture qui peut être maintenu pendant un minimum de plusieurs semaines à mois8,9,10,11. Ainsi, lors du développement de la plate-forme LOC, nous avons établi des protocoles de culte à long terme nécessaires à la formation et à la résorption et avons maintenu des cellules dans le système jusqu’à sept semaines11. En outre, nous avons incorporé des substrats de culture appropriés pour les deux types de cellules dans la plate-forme; les ostéoclastres ont été cultivés directement sur l’os, et les ostéoblastes, qui sont connus pour être adhérents en plastique, ont été cultivés sur des disques de polystyrène. En outre, nous avons abordé les questions concernant la stérilité, la cytotoxicité à long terme et le démontage des puces pour la refonte de l’analyse11,12.
La plate-forme LOC peut également être utilisée pour induire la mécanotransduction ostéocyte par déformation de la matrice. Un dispositif de chargement mécanique imprimé en 3D a été développé pour jumeler avec le LOC et appliquer une distension statique hors de l’avion pour étirer les cellules13. Pour tenir compte de cette charge mécanique, la profondeur du puits à l’intérieur du COL a été augmentée. Ce dispositif de chargement mécanique simple à petite échelle peut être facilement produit par des laboratoires avec une expérience d’ingénierie limitée, et nous avons déjà partagé des dessins des composants imprimés 3D13. Dans les travaux en cours, nous démontrons quelques-unes des nouvelles techniques nécessaires à l’utilisation réussie du LOC. Plus précisément, nous démontrons la fabrication de puces, l’ensemencement cellulaire sur les substrats fonctionnels, le chargement mécanique et le démontage des copeaux pour remodeler la quantification. Nous croyons que l’explication de ces techniques bénéficie d’un format visuel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet</td>
			<td>Optix</td>
			<td>--</td>
			<td>3.175 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled dispensing tips</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG18-0.5X-90</td>
			<td>Remove plastic connector prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Robbins Instruments</td>
			<td>RBP-10</td>
			<td>1 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wafers</td>
			<td>Boneslices.com</td>
			<td>0.4 mm thick</td>
			<td>Bovine cortical bone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine calf serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calipers</td>
			<td>Global Industrial</td>
			<td>T9F534164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spatula</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip mask</td>
			<td>ProtoLabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Print material: Accura SL 5530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-865-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicator</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (100 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td>Sterile, Non-tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (150 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td>Sterile, Non-tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch 237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leveling box</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>--</td>
			<td>3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scoth 2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC3T3-E1 preosteoblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2593</td>
			<td>Subclone 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical loading device</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>--</td>
			<td>3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential alpha medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLO-Y4 osteocytes</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>Gift from Dr. Lynda Bonewald</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Packaging tape</td>
			<td>Duck Brand</td>
			<td>--</td>
			<td>Standard packaging tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis Parafilm</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>p4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td>Expanded plasma cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene coverslips</td>
			<td>Nunc Thermanox</td>
			<td>174942</td>
			<td>Sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Quincy Lab</td>
			<td>12-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7 preosteoclasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>372611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>ID: 1/32&#34; (0.79 mm), OD: 3/32&#34; (2.38 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks software</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td>--</td>
			<td>Used to generate 3D printed models and perform FEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>2323879</td>
			<td>Multi-purpose adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (5 ml)</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>309646</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2213</td>
			<td>Pump 11 Pico Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapered laboratory spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-part expoxy</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1395391</td>
			<td>5 minute quick set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Rat tail collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42010-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof sealant</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>8090001</td>
			<td>100% silicone sealant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a lab-on-a-chip platform for stimulating osteocyte mechanotransduction and analyzing functional outcomes of bone remodeling

Le remodelage osseux est un processus étroitement réglementé qui est nécessaire pour la croissance et la réparation squelettiques ainsi que pour s’adapter aux changements dans l’environnement mécanique. Pendant ce processus, les ostéocytes mécanosensitifs régulent les réponses opposées entre les ostéoclastes cataboliques et les ostéoblastes anabolisants. Pour mieux comprendre les voies de signalisation très complexes qui régulent ce processus, notre laboratoire a mis au point une plate-forme de laboratoire sur puce (LOC) pour analyser les résultats fonctionnels (formation et résorption) de remodelage osseux au sein d’un système à petite échelle. Comme le remodelage des os est un processus long qui se produit de l’ordre de semaines à des mois, nous avons développé des protocoles de culture cellulaire à long terme dans le système. Les ostéoblastes et les ostéoclastes ont été cultivés sur des substrats d’activité fonctionnelle dans le LOC et maintenus jusqu’à sept semaines. Par la suite, les copeaux ont été démontés pour permettre la quantification de la formation et de la résorption osseuses. En outre, nous avons conçu un dispositif de chargement mécanique imprimé en 3D qui s’associe à la plate-forme LOC et peut être utilisé pour induire la mécanotransduction ostéocyte en déformant la matrice cellulaire. Nous avons optimisé les protocoles de culturation cellulaire pour les ostéocytes, les ostéoblastes et les ostéoclastes au sein de la plate-forme LOC et avons abordé les préoccupations de stérilité et de cytotoxicité. Ici, nous présentons les protocoles pour fabriquer et stériliser le LOC, ensemencement des cellules sur des substrats fonctionnels, en induisant la charge mécanique, et en démontant le LOC pour quantifier les résultats des points de terminaison. Nous croyons que ces techniques je base pour développer un véritable organe sur puce pour le remodelage des os.

La configuration des puits peu profonds peut être utilisée pour analyser l’activité fonctionnelle des ostéoblastes et des ostéoclastres. La formation osseuse par ostéoblastes et la résorption par l’intermédiaire d’ostéoclastes nécessite des temps de culture de l’ordre de plusieurs semaines à des mois. La formation osseuse des pré-ostéoblastes MC3T3-E1 a été quantifiée à l’aide de taches alizarin rouge et von Kossa11,<sup class=...

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A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Ici, nous présentons des protocoles pour analyser le remodelage des os dans une plate-forme de laboratoire sur puce. Un dispositif de chargement mécanique imprimé en 3D peut être jumelé à la plate-forme pour induire la mécanostransduction ostéocyte en déformant la matrice cellulaire. La plate-forme peut également être utilisée pour quantifier les résultats fonctionnels de remodelage des ostéoclastres et des ostéoblastes (résorption/formation).

Une plate-forme Lab-On-A-Chip pour stimuler la mécanotransduction ostéocyte et analyser les résultats fonctionnels du remodelage des os

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

Ici, nous présentons des protocoles pour la culture des cellules osseuses au sein d’une plate-forme adaptable de laboratoire sur puce. Ces techniques peuvent être utilisées pour mieux comprendre les mécanismes qui régulent le remodelage osseux induit mécaniquement. Notre système permet une culture à long terme des cellules osseuses, ce qui permet une quantification directe de la formation osseuse et de la résorption en réponse à des environnements de chargement mécanique modifiés.L’utilisation de ces techniques fondamentales peut mener à des découvertes qui s’étendent à un certain nombre de questions liées aux os telles que l’ostéoporose, la guérison des fractures et l’ostéolyse périprothétique. Pour créer le puits et la couche de microcanal, mélanger le prépolymer PDMS et l’agent de séchage à un rapport de 10 pour un dans une tasse en plastique et mélanger vigoureusement, puis dégazer le polymère pendant 30 minutes. Verser lentement le mélange sur le masque pré-nivelé approprié.Laissez reposer pendant 30 minutes et faites-le cuire à 45 degrés Celsius pendant 18 heures. Desserrez les bords du PDMS à l’aide d’une spatule de laboratoire effilée et pelez-le soigneusement du masque, puis découpez les copeaux individuels à l’aide d’un scalpel et d’un modèle imprimé en 3D et nettoyez-les à la surface avec du ruban adhésif. Pour faire la couche de membrane PDMS, répétez les étapes précédentes pour mélanger, verser et cuire le PDMS.Retirez la feuille PDMS de la boîte de nivellement et coupez les membranes individuelles qui correspondent aux dimensions du puits et de la couche de microcanal. Utilisez des étriers pour mesurer l’épaisseur de la membrane au centre et jetez toutes les membranes qui sont en dehors de l’épaisseur désirée, puis nettoyez soigneusement les membranes avec du ruban d’emballage et placez-les sur un morceau de film de paraffine. Pour faire la couche de couvercle PDMS, répétez les étapes précédentes pour mélanger, verser et cuire le PDMS.Après avoir coupé les couvercles individuels à la taille, percer des trous d’accès à travers le PDMS avec un poinçon biopsie d’un millimètre, puis la surface les nettoyer avec du ruban d’emballage. Activez les surfaces des couches 1 et 2 avec un nettoyeur plasma pendant 30 secondes sur un réglage de puissance de radiofréquence moyenne, puis alignez les trous d’accès dans la première couche avec les microcanaux dans la couche deux et appuyez fermement sur les deux couches ensemble. Pour la conception deep-well, répétez ce processus avec les couches deux et trois en utilisant du ruban adhésif à double face pour fixer le film de paraffine de la couche trois à une surface plane pendant le traitement au plasma.Coupez l’excès de matière de la membrane PDMS et épluchez soigneusement la feuille de film de paraffine du fond de la puce. Cuire la puce à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes pour augmenter la résistance des liaisons entre les couches PDMS, puis insérer des pointes de distribution d’angle dans les trous d’accès dans le couvercle et les fixer avec un époxy en deux parties à l’aide d’une pointe de micropipette pour appliquer l’époxy autour de chaque pointe. Une fois l’époxy complètement durci, nettoyez la puce à la surface avec 70 % d’éthanol et transférez-la dans une armoire de biosécurité.Connectez une seringue de cinq millilitres aux bouts de distribution avec des tubes stériles en silicone et remplissez la puce entière de 70 % d’éthanol pendant au moins 30 secondes. Retirez l’éthanol de la puce et stérilisez-le avec de la lumière UV pendant la nuit. Le lendemain, lavez la puce trois fois avec de l’eau distillée, remplissez-la d’eau et retirez le tube des bouts de distribution.Incuber la puce pendant au moins 48 heures à 37 degrés Celsius. Placez un ressort de compression autour de l’arbre du placage et insérez-le dans le trou central sur le fond de la base, puis fixez le bloc de cadran au fond de la base avec quatre vis auto-tapant. Placer un deuxième ressort de compression autour de la vis centrale.Insérez la vis dans le trou en forme hexagonale au bas du cadran et vissez l’assemblage dans le trou fileté au centre du bloc de cadran. Vissez quatre impasses homme-femme dans le fond de la base. Retirez le mou de l’appareil en tournant le cadran dans le sens inverse des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que le dessus du placage soit en dessous du haut de la base, puis tournez lentement le cadran dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que le dessus du placage soit de niveau avec le haut de la base.Utilisez une seringue de cinq millilitres pour enlever l’eau de la puce du puits profond et enduire le fond du puits de 200 microlitres de collagène de type I dans de l’acide acétique pendant une heure. Rincez la puce trois fois à l’aide de DPBS avec du calcium et du magnésium et placez-la dans le porte-copeaux. Ensemencer la puce avec des ostéocytes MLO-Y4 dans le milieu alpha MEM complété par le sérum de veau, FBS, et la pénicilline / streptomycine.Retirez le tube des bouts de distribution, placez la puce dans un plat de culture de puits profonds, et incubez les cellules à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Après l’incubation, fixer le tube stérile aux bouts de distribution et utiliser une seringue de cinq millilitres pour retirer le milieu de culture usé de la puce, puis remplir lentement la puce avec un milieu frais. Placez le porte-puce dans l’encart rectangulaire sur le dessus de la base du dispositif de chargement, alimentez le tube à travers les fentes situées sur le couvercle et fixez le couvercle à la base.Appliquez la charge sur les cellules en tournant le cadran dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que le déplacement plaqué désiré soit atteint, puis placez le dispositif de chargement dans une boîte à pointes de micropipette P1000 vide et incubez les cellules avec la charge pendant 15 minutes. Après l’incubation, retirez la charge des cellules en tournant le cadran dans le sens inverse des aiguilles d’une montre vers la position de départ d’origine, puis retirez le couvercle de l’appareil, placez le support de la puce dans la plaque de culture profonde et incubez les cellules pendant une période de récupération post-chargement de 90 minutes. Utilisez une seringue de cinq millilitres pour enlever le milieu conditionné de la puce et retirer la puce du support de la puce, puis utilisez une spatule conique pour briser le lien entre le couvercle PDMS et la couche de puits.Les cellules sont maintenant prêtes à être analysées. La configuration peu profonde peut être utilisée pour analyser l’activité fonctionnelle des ostéoblastes et des ostéoclastes. La formation osseuse des préosteoblastes a été quantifiée à l’aide de taches rouges alizarin et von Kossa.La résorption osseuse des ostéoclastes a été quantifiée à l’aide de la coloration bleue toluidine et la microscopie électronique de balayage a été utilisée pour vérifier la présence de fosses de résorption. La configuration des copeaux de puits profonds a été utilisée pour induire la mécanotransduction des ostéocytes en étirant les cellules par une distension statique hors plan. Les images d’ostéocytes ensemencés en copeaux démontrent que l’incubation de 48 heures de la puce avec de l’eau distillée est essentielle pour maintenir la viabilité cellulaire dans la morphologie typique.Pendant les épisodes de chargement, les ostéocytes ont été exposés à un gradient de contrainte induit sur la membrane PDMS. La relation entre la souche équivalente moyenne et le déplacement des plaquettes pour des valeurs comprises entre un et deux millimètres a été déterminée et une carte thermique représentative de la souche induite a été générée. Après chargement, la viabilité cellulaire a été analysée avec la coloration de déshydrogénase de lactate et l’annexe V et l’essai de cellules mortes.La tache de déshydrogénase lactate des ostéocytes étirés a montré une coloration plus légère près du bord externe du puits, qui correspond à l’emplacement des valeurs plus élevées de contrainte. Notre plate-forme fournit un degré élevé de polyvalence et peut être employée pour étudier une série de facteurs qui règlent le remodelage d’os tel que la méchanotransduction induite par la charge, l’inflammation, et les effets de drogue. Les techniques présentées ici fournissent une base pour développer un véritable organe osseux sur une puce qui pourrait grandement améliorer notre compréhension des subtilités multicellulaires qui régulent la santé des os.

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