Name: a lab-on-a-chip platform for stimulating osteocyte mechanotransduction and analyzing functional outcomes of bone remodeling
Uploaded: 2020-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט Nos. (CBET 1060990 ו-EBMS 1700299). כמו כן, חומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת על-ידי תוכנית המלגות למחקר בוגר קרן המדע הארצי תחת גרנט No. (2018250692). כל דעה, ממצאים, מסקנות או המלצות המתבטאת בחומר זה הן של המחברים והן אינן משקפות בהכרח את השקפות הקרן הלאומית למדע.

1. הכנת מסיכת שבב
הערה: שלבים 1.1-1.3 יש לבצע רק פעם אחת על קבלת הקבלה הראשונית של מסיכת השבב. הם מבטיחים שהמסיכה אינה משתחווה במהלך השימוש. העיצוב של המסכות המיקרופלואידיג תיאר בעבר11,14. מסכות תוכננו בתוך הבית מסחרי מפוברק באמצעות סטריאואוליתוגרפי...

<ol>
	<li>Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+Osteocytes,+and+Mechanotransduction.">Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction.</a> Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amazing+osteocyte.">The amazing osteocyte.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).</li><li>Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+co-culture+platform+for+investigating+osteocyte-osteoclast+signalling+during+fluid+shear+stress+mechanostimulation.">Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation.</a> Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).</li><li>Kou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multishear+microfluidic+device+for+quantitative+analysis+of+calcium+dynamics+in+osteoblasts.">A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).</li><li>Ma, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chip-based+co-culture+of+fibroblast-like+synoviocytes+with+osteoblasts+and+osteoclasts+to+test+bone+erosion+and+drug+evaluation.">A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation.</a> Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).</li><li>Jang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+osteoblast-based+3D+continuous-perfusion+microfluidic+system+for+drug+screening.">Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic-based+multi-shear+device+for+investigating+the+effects+of+low+fluid-induced+stresses+on+osteoblasts.">A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts.</a> PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).</li><li>Hwang, P. W., Horton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+osteogenic+performance+of+MC3T3-E1+subclones+impacts+their+utility+as+models+of+osteoblast+biology.">Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).</li><li>Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+lifetime+lead+exposure+impedes+osteoclast+activity+and+produces+an+increase+in+bone+mass+in+adolescent+mice.">Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice.</a> Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).</li><li>Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+growth+factor+control+of+bone+formation+through+osteoprogenitor+differentiation.">Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation.</a> Bone. 34 (3), 402-411 (2004).</li><li>George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip+platforms+for+quantification+of+multicellular+interactions+in+bone+remodeling.">Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling.</a> Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).</li><li>Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+considerations+for+optimizing+bone+cell+culture+and+remodeling+in+a+lab-on-a-chip+platform.">Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform.</a> Biotechniques. , (2019).</li><li>Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printed+loading+device+for+inducing+cellular+mechanotransduction+via+matrix+deformation.">3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation.</a> Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).</li><li>George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+mechanically+loaded+osteocytes+and+inflammation+on+bone+remodeling+in+a+bisphosphonate-induced+environment.">The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment.</a> Bone. 127, 460-473 (2019).</li><li>George, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , (2019).</li><li>York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+osteocytic+microdamage+and+viability+quantification+using+a+microloading+platform.">In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform.</a> Medical Engineering &amp; Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).</li><li>Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+plasma+treatment+of+polymer+surface+for+irreversible+sealing+of+microfluidic+devices.">Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices.</a> Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).</li><li>Millare, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+the+quality+of+adhesion+between+poly(dimethylsiloxane)+and+glass+surfaces+on+the+conditions+of+treatment+with+oxygen+plasma.">Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma.</a> Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).</li><li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+compatibility+of+poly(dimethylsiloxane)-based+microfluidic+devices.">Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices.</a> Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).</li><li>Regehr, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+implications+of+polydimethylsiloxane-based+microfluidic+cell+culture.">Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture.</a> Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).</li><li>Wang, Y., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncured+PDMS+inhibits+myosin+in+vitro+motility+in+a+microfluidic+flow+cell.">Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell.</a> Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).</li><li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities.">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).</li><li>Kilic, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-on-a-chip+model+enables+analysis+of+human+neuronal+differentiation+and+chemotaxis.">Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis.</a> Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).</li><li>Van Scoy, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+automata+model+of+bone+formation.">A cellular automata model of bone formation.</a> Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).</li><li>Truesdell, S. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+remodeling+platforms:+Understanding+the+need+for+multicellular+lab-on-a-chip+systems+and+predictive+agent-based+models.">Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models.</a> Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).</li></ol>

מאמר זה מתאר את היסודות עבור בדיית העצם שיפוצים LOC פלטפורמה עבור culturing אוסטאופציטים, אוסטאופתיים ומחזיק מכשולים. על ידי שינוי עומק וגודל של הבאר בתוך השבב, תצורות מרובות פותחו עבור מגרה אוסטאופציטים עם עומס מכני ובדיקת תוצאות פונקציונליות של שיפוץ העצם (איור 1B).
...

עצם היא רקמה דינמית מאוד הדורשת תיאום מורכב בין שלושת סוגי התאים העיקריים: אוסטאופציטים, אוסטאופה ומחזיק מכשולים. אינטראקציות רב-תאיים בין תאים אלה אחראיות לאובדן העצם המתרחש במהלך שיתוק ובלתי ניידות ארוכת טווח ולהיווצרות העצם המתרחשת בתגובה לצמיחה ולהתעמלות. אוסטאופציטים, הסוג השופע ביותר תא העצם, הם רגישים מאוד גירוי מכני להחיל את העצם. גירוי מכני משנה את הפעילות המטבולית האוסטאופתית ומוביל לעלייה במולקולות איתות מפתח1,2. באמצעות תהליך זה, הידוע בשם מכניזציה, אוסטאופציטים יכול לתאם ישירות את הפעילויות של האוסטאופתית (תאים ויוצרים העצם) ו osteoclasts עצם ספיגת תאים). תחזוקת עצם הומאוסטזיס דורש רגולציה הדוקה בין היווצרות העצם לבין שיעורי ספיגת העצם; עם זאת, שיבושים בתהליך זה יכול לגרום למצבי מחלה כגון אוסטאופורוזיס או אוסטאופאואטזיס.
המורכבות של אינטראקציות בין שלושת סוגי התאים האלה משאיל את עצמה היטב לחקירה באמצעות microfluidic ומעבדה-על-שבב (LOC) טכנולוגיות. לשם כך, המעבדה שלנו הקימה לאחרונה הוכחת המושג של פלטפורמת LOC לניתוח ספיגת עצם והיווצרות (תוצאות פונקציונליות) בתהליך שיפוץ העצם. הפלטפורמה יכולה לשמש לחקר אינטראקציות סלולריות, שינוי סביבות טעינה, והקרנת תרופות למחקר. בשנים האחרונות, התקנים מיקרופלואידיג שונים פותחו לחקירת מסלולים איתות מולקולרי המסדירים שיפוץ העצם; עם זאת, רבים של מערכות אלה לכמת שיפוץ באמצעות סמנים עקיפים הרומז על פעילות תפקודית3,4,5,6,7. יתרון של המערכת שלנו היא כי הוא יכול לשמש לכימות ישיר של תוצאות פונקציונליות. שיפוץ עצם הוא תהליך ארוך טווח. ככזה, כימות ישיר של ספיגת עצם והיווצרות דורש מערכת culturing שניתן לשמור למינימום של מספר שבועות עד חודשים8,9,10,11. כך, בעת פיתוח פלטפורמת LOC, הקמנו פרוטוקולים לטווח ארוך culturing הדרושים להיווצרות וספיגת התאים ושמרו על תאי המערכת במשך עד שבעה שבועות11. בנוסף, אנו שולבו מצעים culturing המתאים לשני סוגי תאים לתוך הפלטפורמה; האוסטאופיויום היו מתורבתים ישירות על העצם, והאוסטאופאוקות, אשר ידועים כחסיד מפלסטיק, היו מתורבתים בדיסקים פוליסטירן. יתרה מזאת, הגענו לסוגיות הנוגעות לעקרות, רעילות לטווח ארוך ופירוק השבב לניתוח שיפוץ11,12.
פלטפורמת LOC יכול לשמש גם כדי לגרום להאצלת מכניציט באמצעות דפורמציה מטריצה. 3D מודפס התקן טעינה מכני פותחה לזוג עם LOC ולהחיל סטטי מתוך distention המטוס כדי למתוח את התאים13. כדי להכיל עומס מכני זה, העומק של הבאר בתוך LOC היה גדל. זה בקנה מידה קטן, מכשיר פשוט טעינה מכני יכול להיות מיוצר בקלות על ידי מעבדות עם ניסיון הנדסי מוגבל, ויש לנו שיתוף בעבר ציורים של רכיבים תלת-ממדיים מודפסים13. בעבודה הנוכחית, אנו מדגימים כמה טכניקות הרומן הדרוש לשימוש מוצלח של LOC. באופן ספציפי, אנו מדגימים הייצור שבב, התאים זריעת על מצעים פונקציונליים, העמסה טעינה מכני שבב עבור שיפוץ כימות. אנו מאמינים שההסבר לטכניקות אלה מפיקים תועלת מתבנית חזותית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet</td>
			<td>Optix</td>
			<td>--</td>
			<td>3.175 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled dispensing tips</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG18-0.5X-90</td>
			<td>Remove plastic connector prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Robbins Instruments</td>
			<td>RBP-10</td>
			<td>1 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wafers</td>
			<td>Boneslices.com</td>
			<td>0.4 mm thick</td>
			<td>Bovine cortical bone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine calf serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calipers</td>
			<td>Global Industrial</td>
			<td>T9F534164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spatula</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip mask</td>
			<td>ProtoLabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Print material: Accura SL 5530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-865-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicator</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (100 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td>Sterile, Non-tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (150 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td>Sterile, Non-tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch 237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leveling box</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>--</td>
			<td>3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scoth 2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC3T3-E1 preosteoblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2593</td>
			<td>Subclone 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical loading device</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>--</td>
			<td>3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential alpha medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLO-Y4 osteocytes</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>Gift from Dr. Lynda Bonewald</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Packaging tape</td>
			<td>Duck Brand</td>
			<td>--</td>
			<td>Standard packaging tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis Parafilm</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>p4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td>Expanded plasma cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene coverslips</td>
			<td>Nunc Thermanox</td>
			<td>174942</td>
			<td>Sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Quincy Lab</td>
			<td>12-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7 preosteoclasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>372611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>ID: 1/32&#34; (0.79 mm), OD: 3/32&#34; (2.38 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks software</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td>--</td>
			<td>Used to generate 3D printed models and perform FEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>2323879</td>
			<td>Multi-purpose adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (5 ml)</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>309646</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2213</td>
			<td>Pump 11 Pico Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapered laboratory spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-part expoxy</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1395391</td>
			<td>5 minute quick set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Rat tail collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42010-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof sealant</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>8090001</td>
			<td>100% silicone sealant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a lab-on-a-chip platform for stimulating osteocyte mechanotransduction and analyzing functional outcomes of bone remodeling

שיפוץ עצם הוא תהליך מוסדר היטב הנדרש עבור צמיחת השלד ותיקון, כמו גם הסתגלות לשינויים בסביבה המכנית. במהלך תהליך זה, מכונאי האוסטאופא רגיש לווסת את התגובות הנגדיות בין הcatabolic אוסטאוקלנמשך ו אנבוליים האוסטאופה. כדי להבין טוב יותר את מסלולים איתות מסובכים ביותר המסדירים את תהליך זה, המעבדה שלנו פיתחה מעבדה על-ידי שבב-על-a-chip (LOC) פלטפורמה לניתוח התוצאות פונקציונלי (היווצרות וריפורמציה) של שיפוץ העצם בתוך מערכת בקנה מידה קטן. כמו שיפוץ העצם הוא תהליך ממושך המתרחש בסדר של שבועות עד חודשים, פיתחנו לטווח ארוך פרוטוקולים תא culturing בתוך המערכת. אוסטאוקיים ו osteoclasts גדלו על מצעים פונקציונליים בתוך LOC ונשמר עד שבעה שבועות. לאחר מכן, השבבים היו מפורקים כדי לאפשר את כימות העצם של היווצרות וספיגת העצמות. בנוסף, עיצבנו 3D מודפס טעינת מכשיר מכני כי זוגות עם פלטפורמת LOC והוא יכול לשמש כדי לגרום התמרה מכניזציה על ידי ביטול היווצרות מטריצה הסלולר. יש לנו אופטימיזציה תא culturing פרוטוקולים עבור אוסטאופציטים, האוסטאופתיים, ו osteoclasts חזיקה בתוך פלטפורמת LOC והתייחסו חששות של עקרות ו ציטורעילות. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים עבור בדיית ועיקור של LOC, זריעת תאים על מצעים פונקציונליים, גרימת עומס מכני, ופירוק LOC כדי לכמת תוצאות נקודת הקצה. אנו מאמינים כי טכניקות אלה מניחים את היסודות לפיתוח איבר אמיתי על שבב על שיפוץ העצם.

התצורה הרדודה-היטב ניתן להשתמש כדי לנתח את הפעילות הפונקציונלית של האוסטאופיואולים והאוסטאופה. היווצרות העצם דרך אוסטאופתיים וספיגת העצמות באמצעות osteoclasts דורש פעמים culturing על הסדר של מספר שבועות עד חודשים. היווצרות העצם מ MC3T3-E1 הטרום האוסטאופה היה ככמת באמצעות אליזרין אד...

Watch this Scientific Journal Video about A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling at JoVE.com

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לניתוח שיפוץ. עצם בתוך פלטפורמת מעבדה על שבב 3D מודפס התקן טעינה מכני יכול להיות מזווג עם פלטפורמת כדי לגרום אוסטאופציט המכונה מנגנון על ידי ביטול היווצרות מטריצה הסלולר. הפלטפורמה יכולה לשמש גם כדי לכמת העצם שיפוצים שיפוץ התוצאות הפונקציונליות של אוסטאוקלנמשך ו אוסטאופאוטור/היווצרות.

פלטפורמת מעבדה על שבב לעירור מכניציט וניתוח תוצאות פונקציונליות של שיפוץ עצם

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור culturing תאי עצם בתוך פלטפורמת מעבדה על שבב הסתגלות. טכניקות אלה יכולות לשמש כדי לקדם את ההבנה שלנו של המנגנונים המווסתים שיפוץ עצם הנגרמת מכנית. המערכת שלנו מאפשרת culturing לטווח ארוך של תאי העצם, המאפשר כימות ישיר של היווצרות העצם ו resorption בתגובה סביבות טעינה מכניות השתנה.שימוש בטכניקות יסוד אלה יכול להוביל לתגליות המשתרעות על מספר נושאים הקשורים לעצם כגון אוסטאופורוזיס, ריפוי שברים ואוסטאוליזה פריפרוסתטית. כדי ליצור את שכבת הבאר והמיקרו-ערוצים, שלבו את הפולימר והריפוי של PDMS ביחס של 10 לאחד ב פלסטיק ומערבבים במרץ, ואז מגזים את הפולימר במשך 30 דקות. יוצקים לאט את התערובת על המסכה המתאימה מראש.תן לו לשבת במשך 30 דקות ואופים אותו ב 45 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות. שחררו את הקצוות של ה-PDMS עם מרית מעבדה מחודדת וקרפו אותה בזהירות מהמסכה, ואז חתכו שבבים בודדים עם אזמל ותבנית המודפסת בתלת-ממד ונקו אותם עם סרט אריזה. כדי ליצור את שכבת הממברנה PDMS, חזור על השלבים הקודמים לערבוב, שפיכה ואפייה של ה- PDMS.הסר את גיליון ה- PDMS מתיבת ההיתוך וגזור ממברנות בודדות התואמות לממדים של הבאר ושכבת המיקרו-ערוצים. השתמש calipers כדי למדוד את עובי הממברנה במרכז ולהשליך את כל הממברנות כי הם מחוץ לעובי הרצוי, ולאחר מכן לנקות בזהירות את הממברנות עם סרט אריזה ולהציב אותם על פיסת סרט פרפין. כדי ליצור את שכבת המכסה של PDMS, חזור על השלבים הקודמים לערבוב, שפיכה ואפייה של ה- PDMS.לאחר חיתוך מכסים בודדים לגודל, ניקוב חורי גישה דרך PDMS עם ניקוב ביופסיה מילימטר אחד ולאחר מכן משטח לנקות אותם עם סרט אריזה. הפעל את משטחי השכבות 1 ו-2 עם מנקה פלזמה למשך 30 שניות על הגדרת מתח של תדר רדיו בינוני, ולאחר מכן יישר את חורי הגישה בשכבה הראשונה עם המיקרו-ערוצים בשכבה 2 ולחץ בחוזקה על שתי השכבות יחד. עבור עיצוב עמוק היטב, לחזור על תהליך זה עם שכבות שתיים ושלוש באמצעות סרט דו צדדי כדי לחבר את הסרט פרפין של שכבה שלוש על משטח שטוח במהלך טיפול פלזמה.חותכים את החומר העודף מן קרום PDMS בזהירות לקלף את הסדין של סרט פרפין מתחתית השבב. אופים את השבב ב 65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להגדיל את חוזק הקשר בין שכבות PDMS, ולאחר מכן להכניס טיפים חלוקת זווית לתוך חורי הגישה במכסה ולאבטח אותם עם אפוקסי שני חלקים באמצעות קצה micropipette להחיל את אפוקסי סביב כל קצה. לאחר האפוקסי נרפא במלואו, משטח לנקות את השבב עם 70% אתנול ולהעביר אותו לארון biosafety.חבר מזרק חמישה מיליליטר לטיפים מחלק עם צינורות סיליקון סטריליים ולמלא את השבב כולו עם 70% אתנול לפחות 30 שניות. מוציאים את האתנול מהשבב ומעקרים אותו עם אור UV למשך הלילה. למחרת, לשטוף את השבב שלוש פעמים עם מים מזוקקים, למלא אותו במים, ולהסיר את הצינור מן הטיפים מחלק.דגירה השבב לפחות 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. מניחים קפיץ דחיסה סביב פיר הלוחית ומכניסים אותו לחור המרכזי בתחתית הבסיס, ואז מחברים את בלוק החיוג לתחתית הבסיס עם ארבעה ברגים בהקשה עצמית. מניחים קפיץ דחיסה שני סביב הבורג המרכזי.הכנס את הבורג לתוך החור בצורת משושה בתחתית החוגה והברג את ההרכבה לתוך החור הפתיל במרכז בלוק החיוג. בורג ארבעה תיקו זכר נקבה לתחתית הבסיס. הסר מרווח מההתקן על-ידי סיבוב החוגה נגד כיוון השעון עד שהחלק העליון של הלוחית נמצא מתחת לראש הבסיס, ולאחר מכן סובב באיטיות את החוגה בכיוון השעון עד שהחלק העליון של הלוחית יהיה ברמה עם החלק העליון של הבסיס.השתמש במזרק חמישה מיליליטר כדי להסיר את המים מן השבב עמוק היטב לצפות את החלק התחתון של באר עם 200 microliters מסוג אני קולגן בחומצה אצטית במשך שעה. שוטפים את השבב שלוש פעמים באמצעות DPBS עם סידן ומגנזיום וממקם אותו במחזיק השבב. זרע את השבב עם MLO-Y4 osteocytes ב MEM אלפא בינוני בתוספת סרום עגל, FBS, פניצילין / סטרפטומיצין.מוציאים את הצינורות מהטיפים מחלקים, מניחים את השבב לתוך צלחת תרבות עמוקה, ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני במשך 72 שעות. לאחר הדגירה, לצרף צינורות סטריליים טיפים מחלקים ולהשתמש מזרק חמישה מיליליטר כדי להסיר את מדיום התרבות בילה מן השבב, ואז לאט לאט מילוי השבב עם מדיום טרי. מניחים את מחזיק השבבים בהצבה המלבנית בחלק העליון של בסיס התקן הטעינה, מאכילים את הצינורות דרך החריצים הממוקמים על המכסה ומאבטחים את המכסה לבסיס.החל עומס על התאים על-ידי הפיכת החוגה בכיוון השעון עד להגבהת תזוזת הלוח הרצויה ולאחר מכן מקם את התקן הטעינה בתיבת קצה מיקרופיפט ריקה של P1000 ודגירה של התאים בעומס למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, הסר את העומס מהתאים על-ידי הפיכת החוגה נגד כיוון השעון למיקום ההתחלה המקורי, ולאחר מכן הסר את המכסה מההתקן, מקם את מחזיק השבב בצלחת התרבות העמוקה והדקר את התאים למשך 90 דקות לאחר תקופת שחזור העומס. השתמש במזרק חמישה מיליליטר כדי להסיר את המדיום המותנה מהשבב ולהסיר את השבב ממחזיק השבב, ולאחר מכן להשתמש מרית מחודדת כדי לשבור את הקשר בין מכסה PDMS שכבה היטב.התאים מוכנים כעת לניתוח. ניתן להשתמש בתצורת באר רדודה לניתוח פעילות פונקציונלית של אוסטאובלסטים ואוסטיאוקלסטים. היווצרות עצם מ preosteoblasts היה לכמת באמצעות כתמי אליזרין אדום פון קוסה.כריתת עצם מאוסטיאוקלסטים כומתה באמצעות כתמים כחולים של טולואידין ומיקרוסקופ אלקטרונים סריקה שימשה כדי לאמת את נוכחותם של בורות התחדשות. תצורת השבב העמוק שימשה כדי לגרום mechanotransduction osteocyte על ידי מתיחת התאים באמצעות סטטי מתוך התנפחות המטוס. תמונות של osteocyte זרע שבבים להדגים כי הדגירה של 48 שעות של השבב עם מים מזוקקים הוא קריטי לשמירה על הכדאיות התא מורפולוגיה טיפוסית.במהלך התקפי טעינה, osteocytes נחשפו שיפוע זן המושרה על קרום PDMS. הקשר בין זן שווה ערך ממוצע ותזוזת צלחות לערכים בין מילימטר אחד לשני מילימטרים נקבע ונוצרה מפת חום מייצגת של הזן המושרה. לאחר הטעינה, יכולת הקיום של התא נותחה עם כתמי לקטט דהידרוגנאז והנספח V והתא המת.כתם לקטט דהידרוגנאז של אוסטוציטים מתוחים הראה כתמים קלים יותר ליד הקצה החיצוני של הבאר, אשר תואם את המיקום של ערכי זן גבוהים יותר. הפלטפורמה שלנו מספקת רמה גבוהה של רבגוניות ו ניתן להשתמש בה כדי לחקור מגוון גורמים המווסתים שיפוץ עצם כגון mechanotransduction המושרה עומס, דלקת, ואפקטים סמים. הטכניקות המוצגות כאן מספקות בסיס לפיתוח איבר עצם אמיתי על שבב שיכול לשפר מאוד את הבנתנו את המורכבויות הרב-תאיות המווסתות את בריאות העצם.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

אקסון צמיחה מתיחה: Mechanotransduction הצמיחה העצבית

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

בדיקת Microtensile לסביבה מבוקרת של nanocomposites הפולימר מכאני-מסתגל ל<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; אפיון

Implantable microdevices are gaining significant attention for several biomedical applications1-4. Such devices have been made from a range of materials, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

הכנת הידרוקסי-PAAm הידרוג לצימוד האפקטים של רמזי mechanotransduction

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

פלטפורמה חדשני מתיחה עבור יישומים בתאים והרקמות mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

מעבר צבע למתח שבב עבור מגרה בהתנהגויות הסלולר של הידרוג עמוסי תא

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

העצרת ומעקב אחר פיתוח הקהילה מיקרוביאלית בתוך פלטפורמת מערך Microell

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

ייצור ואימות מערכת איברים על שבב עם אלקטרודות משולבת ישירות לכמת התנגדות חשמלית Transendothelial

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...