Name: a lab-on-a-chip platform for stimulating osteocyte mechanotransduction and analyzing functional outcomes of bone remodeling
Uploaded: 2020-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling at JoVE.com

この研究は、グラント・ノーズ(CBET 1060990およびEBMS 1700299)の下で国立科学財団によって支援されました。また、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラム(2018250692)の支援を受けた研究成果を基にしています。この資料で表明された意見、調査結果、結論、または勧告は著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映しているわけではありません。

1. チップマスクの準備
注: ステップ 1.1 ~ 1.3 は、チップ マスクを最初に受け取った時点で 1 回だけ実行する必要があります。彼らはマスクが使用中に弓をしないようにします。マイクロ流体マスクの設計は、前に11,14,14を説明した。マスクは、高解像度のステレオリソグラフィを使用して社内で設計され、商業的に製造された(<st...

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	<li>Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+Osteocytes,+and+Mechanotransduction.">Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction.</a> Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).</li><li>Bonewald, L. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chip-based+co-culture+of+fibroblast-like+synoviocytes+with+osteoblasts+and+osteoclasts+to+test+bone+erosion+and+drug+evaluation.">A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation.</a> Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).</li><li>Jang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+osteoblast-based+3D+continuous-perfusion+microfluidic+system+for+drug+screening.">Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic-based+multi-shear+device+for+investigating+the+effects+of+low+fluid-induced+stresses+on+osteoblasts.">A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts.</a> PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).</li><li>Hwang, P. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+growth+factor+control+of+bone+formation+through+osteoprogenitor+differentiation.">Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation.</a> Bone. 34 (3), 402-411 (2004).</li><li>George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip+platforms+for+quantification+of+multicellular+interactions+in+bone+remodeling.">Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling.</a> Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).</li><li>Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+considerations+for+optimizing+bone+cell+culture+and+remodeling+in+a+lab-on-a-chip+platform.">Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform.</a> Biotechniques. , (2019).</li><li>Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printed+loading+device+for+inducing+cellular+mechanotransduction+via+matrix+deformation.">3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation.</a> Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).</li><li>George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+mechanically+loaded+osteocytes+and+inflammation+on+bone+remodeling+in+a+bisphosphonate-induced+environment.">The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment.</a> Bone. 127, 460-473 (2019).</li><li>George, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , (2019).</li><li>York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+osteocytic+microdamage+and+viability+quantification+using+a+microloading+platform.">In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform.</a> Medical Engineering &amp; Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).</li><li>Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+plasma+treatment+of+polymer+surface+for+irreversible+sealing+of+microfluidic+devices.">Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices.</a> Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).</li><li>Millare, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+the+quality+of+adhesion+between+poly(dimethylsiloxane)+and+glass+surfaces+on+the+conditions+of+treatment+with+oxygen+plasma.">Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma.</a> Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).</li><li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+compatibility+of+poly(dimethylsiloxane)-based+microfluidic+devices.">Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices.</a> Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).</li><li>Regehr, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+implications+of+polydimethylsiloxane-based+microfluidic+cell+culture.">Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture.</a> Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).</li><li>Wang, Y., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncured+PDMS+inhibits+myosin+in+vitro+motility+in+a+microfluidic+flow+cell.">Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell.</a> Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).</li><li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities.">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).</li><li>Kilic, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-on-a-chip+model+enables+analysis+of+human+neuronal+differentiation+and+chemotaxis.">Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis.</a> Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).</li><li>Van Scoy, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+automata+model+of+bone+formation.">A cellular automata model of bone formation.</a> Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).</li><li>Truesdell, S. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+remodeling+platforms:+Understanding+the+need+for+multicellular+lab-on-a-chip+systems+and+predictive+agent-based+models.">Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models.</a> Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).</li></ol>

この記事では、骨細胞、破骨細胞、および骨芽細胞を培養するための骨リモデリングLOCプラットフォームを製造するための基礎について説明します。チップ内のウェルの深さと大きさを変更することにより、骨細胞を機械的負荷で刺激し、骨のリモデリングの機能的結果を定量化するために複数の構成が開発された(図1B)。
チップアセ?...

骨は、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞の3つの主要な細胞タイプ間の複雑な調整を必要とする非常に動的な組織です。これらの細胞間の多細胞相互作用は、麻痺および長期不動の間に起こる骨の損失、および成長と運動に応答して起こる骨形成の原因である。骨細胞は、最も豊富な骨細胞型であり、骨に適用される機械的刺激に対して高感度である。機械的刺激は骨細胞の代謝活性を変化させ、主要なシグナル伝達分子11,22の増加をもたらす。このプロセスを通じて、メカノトランスダクションとして知られている骨細胞は、骨芽細胞(骨形成細胞)および破骨細胞(骨再生細胞)の活動を直接調整することができる。骨恒常性を維持するには、骨形成と骨吸収率の間に厳しい調節が必要です。しかし、このプロセスの中断は、骨粗鬆症や骨化などの疾患状態をもたらす可能性があります。
これら3種類の細胞間の相互作用の複雑さは、マイクロ流体およびラボ・オン・チップ(LOC)技術を利用した調査に適しています。そのために、私たちの研究室は最近、骨のリフォームプロセスにおける骨吸収と形成(機能的結果)を分析するためのLOCプラットフォームの概念実証を確立しました。このプラットフォームは、細胞間相互作用、変化したローディング環境、および治験薬スクリーニングの研究に使用できます。近年、骨のリモデリングを調節する分子シグナル伝達経路を調べるための様々なマイクロ流体デバイスが開発されています。しかし、これらのシステムの多くは、機能的な活動を示す間接的なマーカーを通してリモデリングを定量化する3,,4,5,6,,7.当社のシステムの利点は、機能的な結果を直接定量化するために使用できることです。骨の改造は長期的なプロセスです。したがって、骨吸収および形成の直接定量化には、少なくとも数週間から8ヶ月、9、10、119,10,の間維持できる培養システムが必要である。11このように、LOCプラットフォームを開発する際に、形成および吸収に必要な長期培養プロトコルを確立し、システム内の細胞を最大7週間11に維持しています。さらに、我々はプラットフォームに両方の細胞タイプの適切な培養基質を組み込んだ。破骨細胞を骨上で直接培養し、プラスチック付着であることが知られている骨芽細胞をポリスチレンディスク上で培養した。さらに、我々は、再モデリング解析11,12,12のための無菌性、長期細胞毒性および欠け分解に関する問題に対処した。
LOCプラットフォームは、マトリックス変形による骨細胞メカノトランスダクションを誘導するためにも使用できます。LOCとペアリングし、セル13を伸ばすために平面外の静電気を適用するために3Dプリントされた機械的ローディングデバイスが開発されました。この機械的負荷に対応するために、LOC内のウェルの深さが増加しました。この小規模でシンプルな機械的ローディングデバイスは、エンジニアリング経験が限られているラボで簡単に製造することができ、以前は3Dプリントコンポーネント13の図面を共有しています。現在の研究では、LOCの使用成功に必要な新しい技術のいくつかを実証します。具体的には、チップ製造、機能基質上の細胞播種、機械的ローディング、および再モデリングのためのチップ分解を実証しています。これらの手法の説明は、視覚的な形式から利益を得ると考えています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet</td>
			<td>Optix</td>
			<td>--</td>
			<td>3.175 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled dispensing tips</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG18-0.5X-90</td>
			<td>Remove plastic connector prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Robbins Instruments</td>
			<td>RBP-10</td>
			<td>1 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wafers</td>
			<td>Boneslices.com</td>
			<td>0.4 mm thick</td>
			<td>Bovine cortical bone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine calf serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calipers</td>
			<td>Global Industrial</td>
			<td>T9F534164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spatula</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip mask</td>
			<td>ProtoLabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Print material: Accura SL 5530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-865-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicator</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (100 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td>Sterile, Non-tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (150 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td>Sterile, Non-tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch 237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leveling box</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>--</td>
			<td>3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scoth 2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC3T3-E1 preosteoblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2593</td>
			<td>Subclone 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical loading device</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>--</td>
			<td>3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential alpha medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLO-Y4 osteocytes</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>Gift from Dr. Lynda Bonewald</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Packaging tape</td>
			<td>Duck Brand</td>
			<td>--</td>
			<td>Standard packaging tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis Parafilm</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>p4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td>Expanded plasma cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene coverslips</td>
			<td>Nunc Thermanox</td>
			<td>174942</td>
			<td>Sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Quincy Lab</td>
			<td>12-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7 preosteoclasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>372611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>ID: 1/32&#34; (0.79 mm), OD: 3/32&#34; (2.38 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks software</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td>--</td>
			<td>Used to generate 3D printed models and perform FEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>2323879</td>
			<td>Multi-purpose adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (5 ml)</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>309646</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2213</td>
			<td>Pump 11 Pico Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapered laboratory spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-part expoxy</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1395391</td>
			<td>5 minute quick set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Rat tail collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42010-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof sealant</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>8090001</td>
			<td>100% silicone sealant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a lab-on-a-chip platform for stimulating osteocyte mechanotransduction and analyzing functional outcomes of bone remodeling

骨のリフォームは、骨格の成長と修復だけでなく、機械的環境の変化に適応するために必要とされる厳しく調整されたプロセスです。この過程で、メカノセンシティを受けた骨細胞は、異化破骨細胞と同化破骨芽細胞との間の対立する応答を調節する。このプロセスを調節する非常に複雑なシグナル伝達経路をよりよく理解するために、私たちの研究室は、小規模システム内の骨改造の機能的成果(形成および吸収)を分析するための基礎的なラボオンチップ(LOC)プラットフォームを開発しました。骨のリモデリングは数週間から数ヶ月の順序で起こる長いプロセスであるため、我々はシステム内で長期的な細胞培養プロトコルを開発しました。骨芽細胞および破骨細胞は、LOC内の機能的活性基質上で成長し、最大7週間維持した。その後、チップを分解して骨形成と吸収の定量化を可能にした。さらにLOCプラットフォームと組み合わせた3Dプリント式メカニカルローディングデバイスを設計し、細胞マトリックスを変形させることで骨細胞メカノトランスダクションを誘導することができます。LOCプラットフォーム内で骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞の細胞培養プロトコルを最適化し、無菌性と細胞毒性の問題に対処してきました。ここでは、LOCの製造と滅菌、機能基質上の細胞の播種、機械的負荷の誘導、およびLOCを分解してエンドポイントの結果を定量化するためのプロトコルを紹介します。これらの技術は、骨のリモデリングのための真のオルガンオンチップを開発するための基礎を築いたと考えています。

浅い井戸構成は骨芽細胞および破骨細胞の機能活性を分析するために使用することができる。骨芽細胞を介した骨形成と破骨細胞による吸収は、数週間から数ヶ月のオーダーで培養時間を必要とする。MC3T3-E1前骨芽細胞からの骨形成は、アリザリン赤とフォンコッサ染色11、15,15を用いて定量した。49日目において、アリザリ...

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A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

ここでは、ラボオンチッププラットフォーム内で骨のリモデリングを分析するためのプロトコルを紹介します。3Dプリントされた機械的ローディング装置は、細胞マトリックスを変形させることによって骨細胞のメカノストランスダクションを誘導するプラットフォームと組み合わせることができます。このプラットフォームは、破骨細胞および骨芽細胞(吸収/形成)からの骨リモデリング機能の結果を定量化するためにも使用できます。

骨造形メカノダクタ化を刺激し、骨改造の機能的成果を解析するためのラボオンチッププラットフォーム

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

ここでは、適応可能なラボオンチッププラットフォーム内で骨細胞を培養するためのプロトコルを紹介します。これらの技術は、機械的に誘発された骨のリモデリングを調節するメカニズムの理解をさらに深めるために使用することができます。当社のシステムは、変化した機械的負荷環境に応じて骨形成と吸収を直接定量化する骨細胞の長期培養を可能にします。これらの基礎技術の使用は、骨粗鬆症、骨折治癒、骨形成障害などの骨関連の問題の数に及ぶ発見につながることができます。ウェルとマイクロチャネル層を作成するには、PDMSプリポリマーと硬化剤をプラスチックカップに1対1の比で組み合わせ、激しく混ぜ合わせ、30分間ポリマーを脱気します。適切な事前レベルのマスクの上にゆっくりと混合物を注ぎます。30分間座らせて、摂氏45度で18時間焼きます。先細りの実験室のへらでPDMSの端を緩め、慎重にマスクから離れてそれを剥がし、メスと3Dプリントされたテンプレートで個々のチップを切り取り、包装テープでそれらをきれいに表面。PDMS膜層を作るためには、PDMSを混合、注ぎ、焼成するための前の手順を繰り返します。ベレディングボックスからPDMSシートを取り外し、ウェル層とマイクロチャネル層の寸法に一致する個々の膜を切断します。キャリパーを使用して、中央の膜の厚さを測定し、所望の厚さの外側にある膜を捨て、包装テープで膜を慎重に洗浄し、パラフィンフィルムの一部に置きます。PDMSの蓋層を作るためには、PDMSを混合、注ぎ、焼成するための前の手順を繰り返します。個々の蓋をサイズに切断した後、1ミリメートルの生検パンチでPDMSを通してアクセス穴をパンチし、包装テープでそれらをきれいに表面化します。中程度の無線周波数電源設定で、プラズマクリーナーでレイヤ1と2の表面を30秒間アクティブにし、レイヤ1のアクセスホールをレイヤ2のマイクロチャネルに合わせて、2つのレイヤーをしっかりと押し合います。深い井戸の設計のために、プラズマ処理の間に平らな表面に層3のパラフィンフィルムを取り付けるために両面テープを使用して層2と3でこのプロセスを繰り返します。PDMS膜から余分な材料を切り取り、慎重にチップの底からパラフィンフィルムのシートを剥がします。チップを65°Cで10分間焼いてPDMS層間の接着強度を高め、蓋のアクセスホールに角度分配チップを挿入し、マイクロピペットチップを使用して2部構成のエポキシで固定し、各先端の周りにエポキシを塗布します。エポキシが完全に硬化した後、表面は70%エタノールでチップを洗浄し、バイオセーフティキャビネットに移します。5ミリリットルのシリンジを滅菌シリコーンチューブで分配チップに接続し、チップ全体に70%エタノールを少なくとも30秒間充填します。チップからエタノールを取り出し、一晩紫外線で殺菌します。翌日、チップを蒸留水で3回洗い、水で満たし、分配の先端からチューブを取り除きます。チップを摂氏37度で少なくとも48時間インキュベートします。プティンのシャフトの周りに圧縮スプリングを配置し、ベースの底部の中央の穴に挿入し、4つのセルフタッピングネジでベースの底にダイヤルブロックを取り付けます。中央のネジの周りに第2の圧縮スプリングを配置します。ダイヤルの底部にある六角形の穴にネジを挿入し、ダイヤルブロックの中央にあるネジ穴にアセンブリをねじ込みます。4人の男性と女性のスタンドオフをベースの底にねじ込みます。プメンの上部がベースの上部を下回るまでダイヤルを反時計回りに回してデバイスから緩みを取り除き、プ盤の上部がベースの上部に合うまでゆっくりとダイヤルを時計回りに回します。5ミリリットルのシリンジを使用して深井戸チップから水を取り除き、酢酸に200マイクロリットルのI型コラーゲンを1時間コーティングします。カルシウムとマグネシウムでDPBSを使用してチップを3回リンスし、チップホルダーに入れ.子牛血清、FBS、ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したMEMアルファ培地でMLO-Y4骨細胞をチップにシードします。分配チップからチューブを取り出し、チップを深層培養皿に入れ、セルを摂氏37度、炭酸ガス5%で72時間インキュベートします。インキュベーションの後、滅菌チューブを分配チップに取り付け、5ミリリットルのシリンジを使用して使用済み培養培地をチップから取り除き、チップに新鮮な培地をゆっくりと補充します。チップホルダーをローディングデバイスベースの上部にある長方形のインセットに入れ、蓋のスロットにチューブを供給し、蓋をベースに固定します。目的のプッキーの変位に達するまでダイヤルを時計回りに回してセルに負荷を加え、空のP1000マイクロピペットチップボックスに積み込み装置を置き、細胞を15分間負荷でインキュベートします。インキュベーション後、ダイヤルを反時計回りに元の開始位置に回して細胞から負荷を取り除き、装置から蓋を取り出し、チップホルダーを深層培養プレートに入れ、90分間のポストロード回復期間細胞をインキュベートします。5ミリリットルのシリンジを使用して、調整された媒体をチップホルダーから取り出し、チップホルダーからチップを取り出し、テーパードスパチュラを使用してPDMS蓋とウェル層の間の結合を破ります。これで、セルを分析する準備が整いました。浅い井戸構成は骨芽細胞および破骨細胞の機能活性を分析するために使用することができる。前骨芽細胞からの骨形成は、アリザリン赤とフォンコッサ染色を用いて定量した。破骨細胞からの骨吸収をトルイジンブルー染色法および走査電子顕微鏡を用いて定量し、吸収ピットの存在を検証するために使用した。深いウェルチップ構成を使用して、細胞を静止で伸張して細胞を面外に伸ばして骨細胞メカノトランスダクションを誘導した。チップに播種された骨細胞の画像は、蒸留水でチップを48時間インキュベーションすることが、典型的な形態における細胞生存率を維持するために重要であることを示している。負荷の発作の間に、骨細胞はPDMS膜上で誘発されるひずみ勾配にさらされた。1ミリメートルと2ミリメートルの間の値に対する平均等価歪みとプラッセン変位の関係を決定し、誘導歪みの代表的なヒートマップを生成した。ローディング後、細胞生存率を乳酸デヒドロゲナーゼ染色およびアネキシンVおよび死細胞アッセイで分析した。伸伸骨細胞の乳酸脱水素酵素染色は、より高い歪み値の位置に対応するウェルの外縁付近で軽い染色を示した。当社のプラットフォームは、高い汎用性を提供し、負荷誘発メカノトランスダクション、炎症、薬物効果などの骨のリモデリングを調節する様々な要因を調査するために使用することができます。ここで紹介する技術は、骨の健康を調節する多細胞複雑さの理解を大幅に高めることができるチップ上の真の骨器官を開発するための基礎を提供します。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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軸索のストレッチの成長：神経成長のメカノトランスダ

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

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