Name: a lab-on-a-chip platform for stimulating osteocyte mechanotransduction and analyzing functional outcomes of bone remodeling
Uploaded: 2020-05-21T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling at JoVE.com

Bu çalışma Grant Nos( CBET 1060990 ve EBMS 1700299) kapsamında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, bu materyal, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı tarafından Hibe No (2018250692) kapsamında desteklenen çalışmalara dayanmaktadır. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu, sonuç veya öneri yazarların görüşleridir ve Ulusal Bilim Vakfı'nın görüşlerini yansıtmak zorunda değildir.

1. Talaş maskesi hazırlama
NOT: Adım 1.1 - 1.3 yalnızca fiş maskesinin ilk alınmasından sonra bir kez yapılması gerekir. Maskenin kullanım sırasında eğilmemesini sağlarlar. Mikroakışkan maskelerin tasarımı daha önce11,14olarak tanımlanmıştır. Maskeler şirket içinde tasarlanmış ve yüksek çözünürlüklü stereolitografi kullanılarak ticari olarak üretilmiştir (Şekil 1...

<ol>
	<li>Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging,+Osteocytes,+and+Mechanotransduction.">Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction.</a> Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amazing+osteocyte.">The amazing osteocyte.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).</li><li>Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+co-culture+platform+for+investigating+osteocyte-osteoclast+signalling+during+fluid+shear+stress+mechanostimulation.">Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation.</a> Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).</li><li>Kou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multishear+microfluidic+device+for+quantitative+analysis+of+calcium+dynamics+in+osteoblasts.">A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).</li><li>Ma, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chip-based+co-culture+of+fibroblast-like+synoviocytes+with+osteoblasts+and+osteoclasts+to+test+bone+erosion+and+drug+evaluation.">A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation.</a> Royal Society Open Science. 5 (9), 180528 (2018).</li><li>Jang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+osteoblast-based+3D+continuous-perfusion+microfluidic+system+for+drug+screening.">Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic-based+multi-shear+device+for+investigating+the+effects+of+low+fluid-induced+stresses+on+osteoblasts.">A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts.</a> PLOS ONE. 9 (2), e89966 (2014).</li><li>Hwang, P. W., Horton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+osteogenic+performance+of+MC3T3-E1+subclones+impacts+their+utility+as+models+of+osteoblast+biology.">Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 8299 (2019).</li><li>Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+lifetime+lead+exposure+impedes+osteoclast+activity+and+produces+an+increase+in+bone+mass+in+adolescent+mice.">Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice.</a> Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).</li><li>Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+growth+factor+control+of+bone+formation+through+osteoprogenitor+differentiation.">Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation.</a> Bone. 34 (3), 402-411 (2004).</li><li>George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-chip+platforms+for+quantification+of+multicellular+interactions+in+bone+remodeling.">Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling.</a> Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).</li><li>Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+considerations+for+optimizing+bone+cell+culture+and+remodeling+in+a+lab-on-a-chip+platform.">Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform.</a> Biotechniques. , (2019).</li><li>Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printed+loading+device+for+inducing+cellular+mechanotransduction+via+matrix+deformation.">3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation.</a> Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).</li><li>George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+mechanically+loaded+osteocytes+and+inflammation+on+bone+remodeling+in+a+bisphosphonate-induced+environment.">The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment.</a> Bone. 127, 460-473 (2019).</li><li>George, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , (2019).</li><li>York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+osteocytic+microdamage+and+viability+quantification+using+a+microloading+platform.">In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform.</a> Medical Engineering &amp; Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).</li><li>Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave+plasma+treatment+of+polymer+surface+for+irreversible+sealing+of+microfluidic+devices.">Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices.</a> Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).</li><li>Millare, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+the+quality+of+adhesion+between+poly(dimethylsiloxane)+and+glass+surfaces+on+the+conditions+of+treatment+with+oxygen+plasma.">Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma.</a> Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).</li><li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+compatibility+of+poly(dimethylsiloxane)-based+microfluidic+devices.">Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices.</a> Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).</li><li>Regehr, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+implications+of+polydimethylsiloxane-based+microfluidic+cell+culture.">Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture.</a> Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).</li><li>Wang, Y., Burghardt, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncured+PDMS+inhibits+myosin+in+vitro+motility+in+a+microfluidic+flow+cell.">Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell.</a> Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).</li><li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities.">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).</li><li>Kilic, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-on-a-chip+model+enables+analysis+of+human+neuronal+differentiation+and+chemotaxis.">Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis.</a> Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).</li><li>Van Scoy, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+automata+model+of+bone+formation.">A cellular automata model of bone formation.</a> Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).</li><li>Truesdell, S. L., Saunders, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+remodeling+platforms:+Understanding+the+need+for+multicellular+lab-on-a-chip+systems+and+predictive+agent-based+models.">Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models.</a> Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).</li></ol>

Bu makalede, osteositler, osteoklastlar ve osteoblastlar için bir kemik remodeling LOC platformu imal için temelleri açıklanmaktadır. Çip içindeki kuyunun derinliğini ve boyutunu değiştirerek, osteositlerin mekanik yük ile uyarLanması ve kemik remodelinginin fonksiyonel sonuçlarının ölçülmesi için birden fazla konfigürasyon geliştirilmiştir(Şekil 1B).
Talaş montajı sırasında plazma oksidasyon protokolünün optimize edil...

Kemik üç ana hücre tipleri arasında karmaşık koordinasyon gerektiren son derece dinamik bir dokudur: osteositler, osteoblastlar, ve osteoklastlar. Bu hücreler arasındaki çok hücreli etkileşimler felç ve uzun süreli hareketsizlik sırasında meydana gelen kemik kaybından ve büyüme ve egzersize yanıt olarak oluşan kemik oluşumundan sorumludur. Osteositler, en bol kemik hücre tipi, kemiğe uygulanan mekanik uyaranlara karşı son derece duyarlıdır. Mekanik stimülasyon osteosit metabolik aktivitesini değiştirir ve anahtar sinyal molekülleri bir artışa yol açar1,2. Bu süreç sayesinde, mekanotransdüksiyon olarak bilinen, osteositler doğrudan osteoblastlar (kemik oluşturan hücreler) ve osteoklastlar (kemik rezorbülasyon hücreleri) faaliyetlerini koordine edebilirsiniz. Kemik homeostazBakımı kemik oluşumu ve kemik rezorpsiyon oranları arasında sıkı bir düzenleme gerektirir; ancak, bu süreçte ki aksaklıklar osteoporoz veya osteopetrozis gibi hastalık durumlarına neden olabilir.
Bu üç hücre tipi arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığı, mikroakışkan ve laboratuvar-on-a-chip (LOC) teknolojilerini kullanarak araştırmaya iyi katkıda bulunur. Bu amaçla, laboratuvarımız son zamanlarda kemik rezorpsiyon ve oluşumu (fonksiyonel sonuçlar) kemik remodeling sürecinde analiz etmek için bir LOC platformu kavramı kanıtı kurmuştur. Platform hücresel etkileşimlerin, değiştirilmiş yükleme ortamlarının ve araştırma ilaç taraması nın incelenmesi nde kullanılabilir. Son yıllarda, çeşitli mikroakışkan cihazlar kemik remodeling düzenleyen moleküler sinyal yollarını araştırmak için geliştirilmiştir; ancak, bu sistemlerin çoğu fonksiyonel aktivite3,4,,5,,6,7göstergesidir dolaylı belirteçleri ile remodeling ölçmek . Sistemimizin bir avantajı, fonksiyonel sonuçların doğrudan ölçülmesi için kullanılabilmesidir. Kemik remodeling uzun vadeli bir süreçtir. Bu nedenle, kemik rezorpsiyonu ve oluşumunun doğrudan nicelleştirilmesi, en az birkaç hafta8ile 8 ,9,,10,11arasında tutulabilen bir kültür sistemi gerektirir. Böylece LOC platformünü geliştirirken, oluşum ve rezorpsiyon için gerekli uzun vadeli kültür protokolleri oluşturduk ve sistem içinde yedi haftaya kadar hücreleri koruduk11. Ayrıca, her iki hücre tipi için uygun culturing yüzeyleri platforma dahil ettik; osteoklastlar doğrudan kemik üzerine, ve plastik yapışık olduğu bilinen osteoblastlar polistiren diskler üzerinde kültürlendi. Ayrıca, remodeling analizi11,,12için sterilite, uzun vadeli sitotoksisite ve talaş demontaj ile ilgili konuları ele aldı.
LOC platformu da matris deformasyon yoluyla osteosit mechanotransdüksiyon indüklemek için kullanılabilir. 3D baskılı mekanik yükleme cihazı LOC ile eşleştirmek ve hücreleri13germek için düzlem dışında statik bir dağıtım uygulamak için geliştirilmiştir. Bu mekanik yükü karşılamak için LOC içindeki kuyunun derinliği artırıldı. Bu küçük ölçekli, basit mekanik yükleme cihazı kolayca sınırlı mühendislik deneyimi ile laboratuvarlar tarafından üretilebilir, ve biz daha önce 3D baskılı bileşenlerin çizimleri paylaştık13. Mevcut çalışmada, LOC'un başarılı kullanımı için gerekli olan bazı yeni teknikleri gösteriyoruz. Bu tekniklerin açıklanmasının görsel bir formattan yararlandığına inanıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic sheet</td>
			<td>Optix</td>
			<td>--</td>
			<td>3.175 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled dispensing tips</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG18-0.5X-90</td>
			<td>Remove plastic connector prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Robbins Instruments</td>
			<td>RBP-10</td>
			<td>1 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wafers</td>
			<td>Boneslices.com</td>
			<td>0.4 mm thick</td>
			<td>Bovine cortical bone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine calf serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calipers</td>
			<td>Global Industrial</td>
			<td>T9F534164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell spatula</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip mask</td>
			<td>ProtoLabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Print material: Accura SL 5530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-865-10B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicator</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WCL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (100 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td>Sterile, Non-tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture dish (150 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430597</td>
			<td>Sterile, Non-tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scotch 237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leveling box</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>--</td>
			<td>3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masking tape</td>
			<td>3M Company</td>
			<td>Scoth 2600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MC3T3-E1 preosteoblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2593</td>
			<td>Subclone 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical loading device</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>--</td>
			<td>3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential alpha medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLO-Y4 osteocytes</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>Gift from Dr. Lynda Bonewald</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Packaging tape</td>
			<td>Duck Brand</td>
			<td>--</td>
			<td>Standard packaging tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>Bemis Parafilm</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>p4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-001</td>
			<td>Expanded plasma cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene coverslips</td>
			<td>Nunc Thermanox</td>
			<td>174942</td>
			<td>Sterile, tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Quincy Lab</td>
			<td>12-180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7 preosteoclasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>372611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing</td>
			<td>Saint-Gobain Tygon</td>
			<td>ABW00001</td>
			<td>ID: 1/32&#34; (0.79 mm), OD: 3/32&#34; (2.38 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks software</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td>--</td>
			<td>Used to generate 3D printed models and perform FEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>2323879</td>
			<td>Multi-purpose adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (5 ml)</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>309646</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2213</td>
			<td>Pump 11 Pico Plus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapered laboratory spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-401-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-part expoxy</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1395391</td>
			<td>5 minute quick set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td>Rat tail collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42010-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof sealant</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>8090001</td>
			<td>100% silicone sealant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a lab-on-a-chip platform for stimulating osteocyte mechanotransduction and analyzing functional outcomes of bone remodeling

Kemik remodeling iskelet büyüme ve onarım yanı sıra mekanik ortamda değişikliklere adapte için gerekli olan sıkı düzenlenmiş bir süreçtir. Bu süreçte, mekanosensit osteositler katabolik osteoklastlar ve anabolik osteoblastlar arasındaki karşıt tepkileri düzenler. Bu süreci düzenleyen son derece karmaşık sinyal yollarını daha iyi anlamak için, laboratuvarımız küçük ölçekli bir sistem içinde kemik remodeling fonksiyonel sonuçları (oluşumu ve rezorpsiyon) analiz etmek için temel bir laboratuvar-on-a-chip (LOC) platformu geliştirdi. Kemik remodeling hafta lar ay sırasına göre meydana gelen uzun bir süreç olduğundan, sistem içinde uzun vadeli hücre culturing protokolleri geliştirdi. Osteoblastlar ve osteoklastlar LOC içinde fonksiyonel aktivite substratları üzerinde yetiştirilen ve yedi haftakadar muhafaza edildi. Daha sonra, talaşkemik oluşumu ve rezorpsiyon kantitatifikasyon uyracak şekilde söküldü. Ayrıca, loc platformu ile eşleşen ve hücresel matris deforme ederek osteosit mekanotransdüksiyon ikna etmek için kullanılabilir bir 3D baskılı mekanik yükleme cihazı tasarladık. Loc platformu içinde osteositler, osteoblastlar ve osteoklastlar için hücre kültür protokollerini optimize ettik ve sterilite ve sitotoksisite ile ilgili endişeleri ele aldık. Burada, LOC'un üretilmesi ve sterilizasyonu, fonksiyonel yüzeylerde hücrelerin tohumlanması, mekanik yükün indüklenmesi ve uç nokta sonuçlarını ölçmek için LOC'un sökülmesi için protokoller sunuyoruz. Bu tekniklerin kemik remodeling için gerçek bir organ-on-a-chip geliştirmek için zemin yatıyordu inanıyoruz.

Sığ-iyi yapılandırma osteoblastlar ve osteoklastların fonksiyonel aktivitesini analiz etmek için kullanılabilir. Osteoblastlar yoluyla kemik oluşumu ve osteoklastlar yoluyla rezorpsiyon birkaç hafta ay sırasına göre kültür asyon süreleri gerektirir. MC3T3-E1 ön osteoblastlarından kemik oluşumu alizarin kırmızısı ve von Kossa lekeleri kullanılarak ölçüldü11,15. 49. günde alizarin kırmızısı ile boyanm...

Watch this Scientific Journal Video about A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling at JoVE.com

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Burada, bir laboratuvar-on-a-chip platformu içinde kemik remodeling analiz için protokoller sıyoruz. Bir 3D baskılı mekanik yükleme cihazı hücresel matris deforme ederek osteosit mekanostransdüksiyon neden platform ile eşleştirilmiş olabilir. Platform aynı zamanda osteoklastlar ve osteoblastlar (rezorpsiyon / oluşumu) kemik remodeling fonksiyonel sonuçları ölçmek için kullanılabilir.

Osteosit Mekanotransdüksiyonu Uyaran ve Kemik Remodeling Fonksiyonel Sonuçları Analiz için Bir Lab-On-A-Chip Platformu

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

Burada, kemik hücrelerinin uyarlanabilir bir laboratuvar-on-a-chip platformu içinde kültüre için protokoller sıyoruz. Bu teknikler, mekanik kaynaklı kemik remodeling düzenleyen mekanizmaları anlayışımızı daha da anlamak için kullanılabilir. Sistemimiz, kemik hücrelerinin uzun süreli birliş yapmasına olanak sağlar, bu da değiştirilmiş mekanik yükleme ortamlarına yanıt olarak kemik oluşumunun ve rezorpsiyonunun doğrudan ölçülmesini sağlar.Bu temel tekniklerin kullanımı osteoporoz, kırık iyileşmesi ve periprotez osteoliz gibi kemikle ilgili bir dizi soruna kadar uzanan keşiflere yol açabilir. Kuyu ve mikrokanal tabakası oluşturmak için, PDMS prepolimer ve kür ajan 10 plastik bir fincan bir oranda birleştirmek ve şiddetle karıştırın, sonra 30 dakika boyunca polimer degas. Yavaş yavaş uygun önceden tesviye maske üzerine karışımı dökün.30 dakika oturup 45 derecede 18 saat pişirin. Konik bir laboratuvar spatulası ile PDMS'nin kenarlarını gevşetin ve maskeden dikkatlice soyun, sonra neşter ve 3D baskılı şablonla tek tek talaşları kesip ambalaj bandıyla temizleyin. PDMS membran tabakasını yapmak için, PDMS'yi karıştırma, dökme ve pişirme için önceki adımları tekrarlayın.PDMS sayfasını tesviye kutusundan çıkarın ve kuyu ve mikrokanal tabakasının boyutlarıyla eşleşen tek tek membranları kesin. Merkezdeki membran kalınlığını ölçmek ve istenilen kalınlığın dışında kalan membranları atmak için kaliperler kullanın, ardından membranları ambalaj bandı yla dikkatlice temizleyin ve bir parça parafin filminin üzerine yerleştirin. PDMS kapak katmanı yapmak için, PDMS karıştırma, dökme ve pişirme için önceki adımları tekrarlayın.Tek tek kapakları boyuta kestikten sonra, pdms üzerinden erişim deliklerini bir milimetrelik biyopsi zımbasıyla delin ve ardından ambalaj bandı ile yüzeyden temizleyin. Orta radyo frekansı güç ayarında bir plazma temizleyicisi ile birinci ve ikinci katmanların yüzeylerini etkinleştirin, ardından birinci katmandaki erişim deliklerini ikinci katmandaki mikrokanallarla hizalayın ve iki katmanı sıkıca birbirine bastırın. Derin kuyu tasarımı için, plazma tedavisi sırasında üçüncü tabakanın parafin filmini düz bir yüzeye takmak için çift taraflı bant kullanarak iki ve üç katmanla bu işlemi tekrarlayın.PDMS membranından fazla malzemeyi kırpın ve çipin altından parafin film tabakasını dikkatlice soyun. PDMS katmanları arasındaki bağ gücünü artırmak için çipi 65 derecede 10 dakika pişirin, ardından kapaktaki erişim deliklerine açı dağıtma ipuçları yerleştirin ve her ucun etrafına epoksi uygulamak için bir mikropipet ucu kullanarak iki parçalı epoksi ile sabitleyin. Epoksi tamamen iyileştikten sonra, yüzey% 70 etanol ile çip temiz ve bir biyogüvenlik kabine aktarın.Steril silikon boru ile dağıtım uçlarına beş mililitrelik şırınga bağlayın ve en az 30 saniye boyunca tüm çipi %70 etanolle doldurun. Etanol'ü çipten çıkarın ve bir gecede UV ışığıyla sterilize edin. Ertesi gün, talaşı üç kez distile suyla yıkayın, suyla doldurun ve boruyu dağıtım uçlarından çıkarın.Çipi en az 48 saat 37 derecede kuluçkaya yatırın. Plakanın şaftına bir sıkıştırma yay yerleştirin ve tabanın altındaki merkezi deliğe yerleştirin, ardından kadran bloğunu dört kendinden dokunan vidayla tabanın dibine takın. Merkezi vidanın etrafına ikinci bir sıkıştırma yay yerleştirin.Vidayı kadranaltındaki altıgen şekilli deliğe yerleştirin ve tertibatı kadran bloğunun ortasındaki dişli deliğe vidalayın. Üssün dibine dört erkek-kadın soğukluğu vidalayın. Plakanın üst kısmı tabanın üst kısmı altına gelene kadar kadranı saat yönünün tersine çevirerek cihazdaki bolluğu çıkarın ve plakanın üst kısmı tabanın üstüyle aynı seviyeye gelene kadar çevirmeyi saat yönünde yavaşça çevirin.Bir saat boyunca asetik asit tip I kollajen 200 mikrolitre ile derin kuyu çip ve kat kuyunun alt su kaldırmak için beş mililitreşli şırınga kullanın. DPBS kullanarak talaşı üç kez kalsiyum ve magnezyumla durulayın ve talaş tutucuya yerleştirin. Buzağı serumu, FBS ve penisilin/streptomisin ile takviye edilmiş MEM alfa ortamda MLO-Y4 osteositli çipi tohumla.Boruları dağıtım uçlarından çıkarın, çipi derin bir kültür yemeğine yerleştirin ve hücreleri 37 santigrat derecede ve yüzde 5 karbondioksitle 72 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, dağıtım ipuçlarına steril borular takın ve harcanan kültür ortamını çipten çıkarmak için beş mililitrelik bir şırınga kullanın, ardından çipi yavaşça taze ortamla doldurun. Talaş tutucuyu yükleme cihazı tabanının üstüne dikdörtgen insetiçine yerleştirin, tüpü kapakta bulunan yuvalardan besleyin ve kapağı tabanına sabitleyin.İstenilen plaka deplasmanına ulaşılıncaya kadar kadranı saat yönünde çevirerek hücrelere yük uygulayın, ardından yükleme cihazını boş bir P1000 mikropipet ucu kutusuna yerleştirin ve hücreleri 15 dakika boyunca yükletin. Kuluçkadan sonra, kadranı saat yönünün tersine orijinal başlangıç konumuna çevirerek hücrelerden yükü çıkarın, ardından kapağı cihazdan çıkarın, talaş tutucuyu derin kuyukültür plakasına yerleştirin ve hücreleri 90 dakikalık bir yük sonrası kurtarma süresi için kuluçkaya yatırın. Koşullu ortayı çipten çıkarmak ve çip tutucudan çıkarmak için beş mililitrelik bir şırınga kullanın, ardından PDMS kapağı ile kuyu tabakası arasındaki bağı kırmak için konik bir spatula kullanın.Hücreler analiz edilmeye hazır. Sığ-iyi yapılandırma osteoblastlar ve osteoklastların fonksiyonel aktivitesini analiz etmek için kullanılabilir. Preosteoblastlardan kemik oluşumu alizarin kırmızısı ve von Kossa lekeleri kullanılarak ölçüldü.Osteoklastlardan kemik rezorpsiyonu toluidin maviboyama ve taramalı elektron mikroskobu kullanılarak rezorpsiyon çukurlarının varlığını doğrulamak için ölçüldü. Derin-iyi yonga yapılandırması düzlem distansiyon bir statik yoluyla hücreleri germe tarafından osteosit mechanotransdüksiyon indüklemek için kullanılmıştır. Cips tohumu osteosit görüntüleri distile su ile çipin 48 saatlik kuluçka tipik morfolojihücre canlılığını korumak için kritik olduğunu göstermektedir.Yükleme nöbetleri sırasında, osteositler PDMS membranında indüklenen bir gerinim gradyanına maruz kaldılar. Bir ile iki milimetre arasındaki değerler için ortalama eşdeğer gerinim ile plaka yer değiştirmesi arasındaki ilişki belirlendi ve indüklenen suşun temsili bir ısı haritası oluşturuldu. Yüklemenin ardından laktat dehidrogenaz boyama, ek V ve ölü hücre analizi ile hücre canlılığı analiz edildi.Gerilmiş osteositlerin laktat dehidrogenaz lekesi kuyunun dış kenarına yakın daha açık bir lekelenme gösterdi, bu da yüksek gerinim değerlerinin bulunduğu yere karşılık geliyor. Platformumuz çok yönlülük yüksek derecede sağlar ve yük kaynaklı mekanotransdüksiyon, inflamasyon ve ilaç etkileri gibi kemik remodeling düzenleyen çeşitli faktörlerin araştırmak için kullanılabilir. Burada sunulan teknikler büyük ölçüde kemik sağlığını düzenleyen çok hücreli incelikleri anlayışımızı artırabilir bir çip üzerinde gerçek bir kemik organı geliştirmek için bir temel sağlar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Akson Streç Büyüme: Nöronal Büyüme Mechanotransduction

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Için Mekanik-adaptif Polimer Nanokompozitler bir çevre kontrollü Mikrogerilim Test<em&gt; Ex vivo</em&gt; Karakterizasyonu

Implantable microdevices are gaining significant attention for several biomedical applications1-4. Such devices have been made from a range of materials, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Hücre ve Doku mechanobiology Applications A Novel Germe Platformu

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Hücre yüklü hidrojel uyarıcı hücresel davranışları için degrade zorlanma çip

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Parçacıkların Mekansal Takip için Çoklanmış Elektronik Algılama ile mikroakışkan Platformu

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

Bir Mikro Kuyruklu Dizi Platformunda Mikrobik Topluluk Geliştirmenin Montajı ve Takibi

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

İmalat ve Organ-on-chip sistemin doğrudan Transendothelial elektrik direncini ölçmek için entegre elektrotlar ile doğrulama

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...