Name: preparation of acute human hippocampal slices for electrophysiological recordings
Uploaded: 2020-05-07T15:00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings at JoVE.com

نشكر ماندي ماربلر-بوتر (Charite-Unversitätsmedizin، برلين) على المساعدة التقنية الممتازة. تم تمويل P.F. من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG، دويتشه Forschungsgemeinschaft) في إطار استراتيجية التميز في ألمانيا-EXC-2049-390688087. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مركز كويست لتحويل البحوث الطبية الحيوية في معهد برلين للصحة.

<ol>
	<li>Hirtz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+common+are+the+"common"+neurologic+disorders.">How common are the "common" neurologic disorders.</a> Neurology. 68 (5), 326-337 (2007).</li><li>Ngugi, A. K., Bottomley, C., Kleinschmidt, I., Sander, J. W., Newton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+burden+of+active+and+life-time+epilepsy:+a+meta-analytic+approach.">Estimation of the burden of active and life-time epilepsy: a meta-analytic approach.</a> Epilepsia. 51 (5), 883-890 (2010).</li><li>Kwan, P., Brodie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Identification+of+Refractory+Epilepsy.">Early Identification of Refractory Epilepsy.</a> New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).</li><li>L&#246;scher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+of+current+animal+models+of+seizures+and+epilepsy+used+in+the+discovery+and+development+of+new+antiepileptic+drugs.">Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs.</a> Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).</li><li>Ledri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Effect+of+Neuropeptides+on+Excitatory+Synaptic+Transmission+in+Human+Epileptic+Hippocampus.">Differential Effect of Neuropeptides on Excitatory Synaptic Transmission in Human Epileptic Hippocampus.</a> The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 35 (26), 9622-9631 (2015).</li><li>Qi, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+steroid+biosynthetic+pathways+in+the+human+prefrontal+cortex+in+mood+disorders:+A+post-mortem+study.">Alterations in the steroid biosynthetic pathways in the human prefrontal cortex in mood disorders: A post-mortem study.</a> Brain Pathology. 28 (4), 536-547 (2018).</li><li>Verwer, R. W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-mortem+brain+tissue+cultures+from+elderly+control+subjects+and+patients+with+a+neurodegenerative+disease.">Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease.</a> Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).</li><li>Verwer, R. W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+human+postmortem+brain+tissue+slices+remain+alive+for+several+weeks+in+culture.">Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture.</a> FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (1), 54-60 (2002).</li><li>Le Ma&#238;tre, T. W., Dhanabalan, G., Bogdanovic, N., Alkass, K., Druid, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Alcohol+Abuse+on+Proliferating+Cells,+Stem/Progenitor+Cells,+and+Immature+Neurons+in+the+Adult+Human+Hippocampus.">Effects of Alcohol Abuse on Proliferating Cells, Stem/Progenitor Cells, and Immature Neurons in the Adult Human Hippocampus.</a> Neuropsychopharmacology. 43 (4), 690-699 (2018).</li><li>Dennis, C. V., Suh, L. S., Rodriguez, M. L., Kril, J. J., Sutherland, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adult+neurogenesis+across+the+ages:+An+immunohistochemical+study.">Human adult neurogenesis across the ages: An immunohistochemical study.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 42 (7), 621-638 (2016).</li><li>Verwer, R. W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+astrocytes+in+the+adult+human+neocortex+express+the+early+neuronal+marker+doublecortin.">Mature astrocytes in the adult human neocortex express the early neuronal marker doublecortin.</a> Brain. 130 (12), 3321-3335 (2007).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+ex+vivo+experimental+platform+for+molecular-genetic+dissection+of+adult+human+neocortical+cell+types+and+circuits.">A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8407 (2018).</li><li>Le Duigou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pathological+activities+of+human+brain+tissue+in+organotypic+culture.">Imaging pathological activities of human brain tissue in organotypic culture.</a> Journal of Neuroscience Methods. 298, 33-44 (2018).</li><li>Agostinho, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynorphin-based+"release+on+demand"+gene+therapy+for+drug-resistant+temporal+lobe+epilepsy.">Dynorphin-based "release on demand" gene therapy for drug-resistant temporal lobe epilepsy.</a> EMBO molecular medicine. 11 (10), 9963 (2019).</li><li>Hodge, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+cell+types+with+divergent+features+in+human+versus+mouse+cortex.">Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex.</a> Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).</li><li>Beaulieu-Laroche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Dendritic+Compartmentalization+in+Human+Cortical+Neurons.">Enhanced Dendritic Compartmentalization in Human Cortical Neurons.</a> Cell. 175 (3), 643-651 (2018).</li><li>Sandow, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+in+cortical+and+hippocampal+slices+from+resected+tissue+of+epilepsy+patients:+no+significant+impact+of+p-glycoprotein+and+multidrug+resistance-associated+proteins.">Drug resistance in cortical and hippocampal slices from resected tissue of epilepsy patients: no significant impact of p-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins.</a> Frontiers in Neurology. 6, 30 (2015).</li><li>Wickham, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+life+of+human+acute+hippocampal+slices+from+temporal+lobe+epilepsy+surgery.">Prolonged life of human acute hippocampal slices from temporal lobe epilepsy surgery.</a> Scientific Reports. 8 (1), (2018).</li><li>Avoli, M., Jefferys, J. G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+drug-induced+epileptiform+synchronization+in+vitro.">Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. , (2015).</li><li>Kraus, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethylethanolamine+Decreases+Epileptiform+Activity+in+Acute+Human+Hippocampal+Slices+in+vitro.">Dimethylethanolamine Decreases Epileptiform Activity in Acute Human Hippocampal Slices in vitro.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 209 (2019).</li><li>Antonio, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+seizure+like+events+and+changes+in+ionic+concentration.">In vitro seizure like events and changes in ionic concentration.</a> Journal of Neuroscience Methods. , (2016).</li><li>Gabriel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+and+Potassium-Induced+Epileptiform+Activity+in+the+Human+Dentate+Gyrus+from+Patients+with+and+without+Hippocampal+Sclerosis.">Stimulus and Potassium-Induced Epileptiform Activity in the Human Dentate Gyrus from Patients with and without Hippocampal Sclerosis.</a> Journal of Neuroscience. 24 (46), 10416-10430 (2004).</li><li>Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+perfusion+chamber+for+the+study+of+nervous+tissue+slices+in+vitro.">A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).</li><li>Hill, M. R. H., Greenfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+chamber:+a+new+type+of+in+vitro+recording+chamber.">The membrane chamber: a new type of in vitro recording chamber.</a> Journal of neuroscience methods. 195 (1), 15-23 (2011).</li><li>Andersson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+human+neurons+in+organotypic+brain+cultures.">Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures.</a> Scientific Reports. 6, 24818 (2016).</li><li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals:+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics.">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in molecular biology. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Testa-Silva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+synapses+show+a+wide+temporal+window+for+spike-timing-dependent+plasticity.">Human synapses show a wide temporal window for spike-timing-dependent plasticity.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 2, 12 (2010).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method.">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li><li>Morris, G., Jiruska, P., Jefferys, J. G. R., Powell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Approach+of+Modified+Submerged+Patch+Clamp+Recording+Reveals+Interneuronal+Dynamics+during+Epileptiform+Oscillations.">A New Approach of Modified Submerged Patch Clamp Recording Reveals Interneuronal Dynamics during Epileptiform Oscillations.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 519 (2016).</li><li>Valeeva, G., Valiullina, F., Khazipov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+actions+of+GABA+in+the+intact+neonatal+rodent+hippocampus+in+vitro.">Excitatory actions of GABA in the intact neonatal rodent hippocampus in vitro.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2013).</li></ol>

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

إن نسيج الدماغ البشري الذي يُعاد استئصاله هو أداة قيمة للغاية في التقييم قبل الكلينيكي لـ AEDs ، لأنه يمثل بشكل صحيح شبكة صغيرة للدماغ البشري سليمة. يصف البروتوكول المعروض طريقة لنقل الأنسجة وإعدادها، والتي تضمن شرائح فرس النهر عالية الجودة بالإضافة إلى طريقة تحريضية مستقرة لنشاط الصرع الحاسم لتقييم AED.
وقد سبق أن أظهرت التحقيق في نشاط الصرع وكذلك طرق الحث الكيميائية أو الكهربائية في شرائح الدماغ البشري من قبل مجموعات أخرى17,20,21,22. يصف هذا البروتوكول تحريض نشاط الاندفاع المستقر في شرائح من المرضى المختلفين عن طريق تطبيق K++4-AP العالي وكذلك تحريض SLEs في منطقة CA1 عن طريق تطبيق من انخفاض Mg2 +BIC. ووجد أن تحريض نشاط الاندفاع أكثر اتساقا (80٪ من شرائح اختبارها في 15 مريضا) من تحريض SLEs (50٪ من شرائح اختبارها في مريض واحد). ومع ذلك ، حتى الآن ، تم اختبار تحريض SLEs فقط في مريض واحد. ومع ذلك, ويوصى التعريفي من SLEs من قبل منخفضة Mg2 ++ BIC, كما SLEs لم تكن قادرة حتى الآن على أن تكون مستحثة باستخدام K عالية++4-AP.
وقد أدخلت العديد من الدراسات أساليب لنقل وإعداد أنسجة الدماغ البشري وغالبا ما تسلط الضوء على ثلاثة عوامل حاسمة لبقاء الخلايا العصبية: وقت النقل، وحلول النقل المستخدمة، وظروف التخزين.
للحصول على القدرة على البقاء على النحو الأمثل شريحة, بعض المجموعات تشير إلى أن نقل أنسجة الدماغ مُجَرَّح تكون قصيرة قدر الإمكان. ومع ذلك، نادراً ما تكون غرف العمليات والمختبرات على مقربة، مما يعني أن جودة الشريحة قد تتعرض للخطر بسبب وسائل النقل الطويلة. وقد تغلبت بعض المجموعات على هذه العقبة بتطبيق ثابت O2 على الحل أثناء النقل12. لقد نقلنا أنسجة المخ لفترة قصيرة (الحد الأقصى = 15 دقيقة) وطويلة (تصل إلى 1 ساعة) فترات من الزمن دون ثابت إضافية O2 العرض أثناء النقل، على غرار مجموعات أخرى18،,25. في هذه الحالات، لم تلاحظ الاختلافات في جودة الأنسجة أثناء التسجيلات الصرعية. في التواصل مع مجموعات أخرى في معهدنا ، لم تتغير جودة الشريحة للتجارب المشبك ، سواء. في المقابل، التباين في نوعية الأنسجة ينبع ربما من الضرر أثناء العمليات، والتشريح لفترات طويلة، و تشريح الإجراء.
فيما يتعلق النقل وقطع الحل، وجميع الأساليب المنشورة حذف NaCl من الحلول للحد من تورم الخلايا بسبب الضغط التناضحي، على غرار الإجراء القياسي لتجارب القوارض التصحيح المشبك. ومع ذلك، فقد تم إدخال العديد من البدائل حتى الآن (أي السكروز القائم على aCSF13،22، NMDG القائم على aCSF12،26، والكولين القائم على aCSF27). قدم تينغ وزملاؤه aCSF القائم على NMDG لإعداد شريحة في 201426 وأضاف في وقت لاحق بروتوكول الانتعاش، الذي يعيد ببطء NaCl إلى شرائح28. ومع ذلك، كما وصفها Ting وآخرون، الخلايا العصبية من أنسجة الدماغ أعدت في ACSF المستندة إلى NMDG إظهار مقاومة الغشاء أعلى، مما يؤثر على ختم الخلية الكاملة خلال التجارب التصحيح المشبك26. ولذلك, لقد انتقلنا من NMDG القائم على aCSF إلى استخدام aCSF20القائم على الكولين , الذي ينتج شرائح عالية الجودة لكل من إمكانات الحقل والتسجيلات المشبك التصحيح.
فيما يتعلق بتخزين شرائح، فمن المسلم به عموما أن ظروف واجهة توفير الأوكسجين الأمثل حاسمة لشريحة طويلة البقاء على قيد الحياة18. ومع ذلك، تظهر مجموعات أخرى شريحة البقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى 72 ساعة تحت ظروف مغمورة12. على عكس الفرضية السابقة ، يبدو أن شرائح الدماغ البشرية أكثر مقاومة لانخفاض الأكسجين أو الإجهاد التأكسي مقارنة بشرائح القوارض. في المقام الأول، تم استخدام غرف الواجهة سابقًا لتخزين شرائح فرس النهر البشرية، على الرغم من أنه يوصى بالظروف المغمورة للحفاظ على شرائح الدماغ البشرية في تجارب المشبك.
كما ناقشته مجموعات أخرى، خطوة إضافية حاسمة للبقاء على قيد الحياة شريحة طويلة (واجهة ل<48 ح18،المغمورة ل< 72 ح12) هو منع التلوث البكتيري. وعادة ما تستخدم شرائح الدماغ القوارض في التسجيلات الكهربائية الفيزيولوجية لمدة تصل إلى 8 ساعات، والتلوث البكتيري لا يعتبر يؤثر على صلاحية شريحة خلال هذه الفترة. ويبرز العدد الكبير من الشرائح المعدة من استئصال واحد والتوافر غير المألوف لأنسجة الدماغ البشري الحاجة إلى إطالة أمد صلاحية شرائح الدماغ البشري. هذه الطريقة تصف بنجاح إعداد الحية الإنسان شرائح الدماغ قرن آمون، والتي يمكن بسهولة تكييفها لظروف معقمة. ومع ذلك ، للتسجيلات التي أجريت هنا ، فإن بقاء الشريحة الممتد 20 ساعة لم يكن أولوية.
كما تبين أن التسجيل في غرف الواجهة ضروري لاستقراء نشاط الصرع مثل SLEs22. نادرا ما تستخدم الظروف المغمورة، بسبب انخفاض الأوكسجين، لتسجيل SLEs. على الرغم من ذلك، فهي ضرورية للدقة الضوئية عالية اللازمة للتجارب التصحيح المشبك. استخدام غرفة تسجيل نوع مغمورة الأمثل تمكن من تسجيل نشاط الصرع (خارج الخلية مجال أو خلية عصبية واحدة) في شرائح الدماغ البشري، وذلك بسبب ارتفاع الأوكسجين وتطبيق المخدراتالسريعة 29. هنا، يتم وصف أساليب ونتائج التسجيلات المحتملة الميدانية، ولكن ينبغي التأكيد على أن تسجيلات اللصقات تم تنفيذها بنجاح في شرائح الماوس والدماغ البشري باستخدام هذه الغرفة التسجيل المعدلة (البيانات غير مبينة).
أنسجة الدماغ البشرية المُجَرَّح لها قيمة تحويلية أعلى مقارنةً بنماذج القوارض. وهو يمثل الكبار, شبكة الخلايا العصبية المريضة التي لا يمكن استنساخها من قبل iPSCs. ومع ذلك ، كما هو الحال في أي نظام في المختبر ، شرائح الدماغ البشري لا تمثل الدماغ البشري سليمة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تخضع الشبكات العصبية المسجلة من أنسجة الدماغ المُجَرَّحَة لتغييرات جزيئية ووظيفية كبيرة بسبب التلف أثناء التشغيل أو الإعداد. وقد تبين أن إجراءات تشريح تؤثر على وظيفة GABAergic وقد تؤثر على تحريض النشاط الصرع30. وينبغي النظر في هذه القيود عند صياغة فرضية. عند اختبار الأدوية المضادة للصرع المحتملة ، ينبغي النظر في استخدام مناطق مختلفة من الدماغ ، حيث قد لا يتم التعبير عن أهداف المخدرات في جميع مناطق الدماغ البشري أو جميع المرضى. على وجه الخصوص، وفرس النهر من المرضى TLE غالبا ما تظهر علامات التصلب قرن آمون يرافقه فقدان الخلايا العصبية الشديدة. من المستحسن الحصول على معلومات المريض عن التغيرات المرضية وتاريخ المرض ، مثل الانكسار المحتمل تجاه الأدوية ، والنظر في ذلك أثناء تفسير البيانات.
في الختام، هذه الطريقة تصف بنجاح إعداد الحية الإنسان شرائح الدماغ قرن آمون وتقنيات الحث لتسجيل نوعين مختلفين من نشاط الصرع. وبما أن توافر أنسجة الدماغ البشرية الحية أمر نادر الحدوث، ينبغي استخدام ظروف النقل والتسجيل المثلى لضمان أقصى قدر من الناتج من التجارب باستخدام شرائح الدماغ البشري. ويقترح أن أنسجة الدماغ البشرية التي تم استئصالها يمكن استخدامها كأداة للتحقق قبل التثبت من صحة القوارض وتجارب زراعة الخلايا.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61085/preparation-acute-human-hippocampal-slices-for-electrophysiological">Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings</a>. Step 2.1.3 in the Protocol was corrected.
Step 2.1.3 in the Protocol was updated from:
Add final concentrations of glucose and MgCl, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).
to:
Add final concentrations of glucose and CaCl2, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61085/preparation-acute-human-hippocampal-slices-for-electrophysiological">Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings</a>. Step 2.1.3 in the&#160;Protocol was corrected.

Erratum: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

الصرع هو واحد من الاضطرابات العصبية الأكثر شيوعا، التي تؤثر على 1٪ من سكان العالم، ويرتبط مع زيادة معدلات الاعتلال والوفيات1،2. للأسف، ثلث المرضى الذين يعانون من الصرع مقاومة للأدوية، على الرغم من وفرة من خيارات العلاج المتاحة بما في ذلك أكثر من 20 الأدوية المضادة للصرع المعتمدة (AEDs)3. الفشل في ترجمة النتائج من البحوث الحيوانية قبل السريرية إلى التجارب السريرية هو أحد الأسباب التي تجعل استراتيجيات العلاج الواعدة ليست فعالة في العديد من المرضى4. في الآونة الأخيرة, وقد ثبت neuropeptide Y (NPY) و galanin أن يكون لها آثار مكافحة البُلَد في النماذج الحيوانية; على الرغم من, عندما اختبارها في أنسجة الدماغ البشري مُجَذَّب, فقط كان NPY فعالة5.
21- ومعظم المعارف القائمة المتعلقة بالآليات العصبية الأساسية ومناهج العلاج بالأمراض تنبع من نماذج حيوانية وتجارب استزراع الخلايا. على الرغم من أن المعلومات، وهذه النماذج تمثل جوانب واحدة فقط من الأمراض البشرية المعقدة وشبكة الدماغ البشري الكبار. بدلا من ذلك، أنسجة الدماغ البشرية لديها القدرة على سد الفجوة الترجمية ولكن نادرا ما تكون متاحة للدراسات الوظيفية. على سبيل المثال، أنسجة الدماغ بعد الوفاة كانت أداة قيمة في التحقيق في التعبير البروتيني، مورفولوجيا الدماغ، أو الاتصالات التشريحية، على الرغم من أن نشاط الخلايا العصبية غالبا ما يتعرض للخطر هو هذا النسيج6،,7،,8،,9،,10،,11.
في المقابل، تم التحقيق في الأنسجة المخية البشرية الحية المُجَرَّحَة فيما يتعلق بتقييم الأدوية قبل الكلينيكية، وظائف الخلايا العصبية الأساسية وأنماط التعبير الجيني12،13،14،15،16،17. ميزة كبيرة من شرائح الدماغ البشري مقارنة مع شرائح القوارض هو جدوى طويلة من الأنسجة العصبية بعد استئصال وإعداد. بالمقارنة مع شرائح الدماغ القوارض، والتي يمكن عادة أن تسجل لمدة تصل إلى 8 ساعة بعد إعداد، شرائح الدماغ البشري تظهر نشاط الخلايا العصبية مستقرة لمدة تصل إلى 72 ساعة، مما يتيح إجراء تحقيق شامل لهذه العينات النادرة وقيمة12،18.
وقد بحثت العديد من الدراسات خصائص نشاط الصرع في مناطق مختلفة من الأنسجة القشرية وهرون الدماغ الإنسان استئصالها واستخدمت أساليب مختلفة لالتحث على نشاط الصرع. في شرائح القوارض، يمكن أن يسبب نشاط الصرع عدة طرق: التحفيز الكهربائي لخلايا DG hilar، زيادة K+ خارج الخلية (8-12 mM KCl)، حظر مستقبلات GABAA بواسطة bicuculline (BIC)، منع قنوات البوتاسيوم من قبل 4-أمينوبيريدين (4-AP)، وإزالة أو تقليل Mg2+ في محلول خارج الخلية19. ومع ذلك ، فإن تحريض نشاط الصرع في الأنسجة البشرية يتطلب الجمع بين اثنين على الأقل من الطرق المذكورة أعلاه20،21،22.
هنا هو طريقة لإعداد شرائح الدماغ فرس النهر الإنسان, التي هي قابلة للحياة لمدة تصل إلى 20 ح وإظهار تحريض النشاط الصرع عند تطبيق عالية K+ (8 mM) و 4-AP أو منخفضة ملغ2 + و BIC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(+)-Na L-ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>275875-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>eliteSERVE GmbH</td>
			<td>HW3</td>
			<td>used for the vibratome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Cl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Tiffen</td>
			<td>EK1546027T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas-tight bottle caps</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co.KG</td>
			<td>E694.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>GB150F-8P</td>
			<td>for recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass gas disperser</td>
			<td>DWK Life Sciences GmbH</td>
			<td>258573309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface Chamber</td>
			<td>inhouse made</td>
			<td>-</td>
			<td>see Haas et al., 1979</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>131494.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane (Cell culture inserts)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PICM030050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane chamber</td>
			<td>inhouse made</td>
			<td>-</td>
			<td>see Hill and Greenfield, 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8729;6H2O</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HNO3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HNO1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice holder</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>SHD-41/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of acute human hippocampal slices for electrophysiological recordings

ويصيب الصرع حوالي 1% من سكان العالم ويؤدي إلى انخفاض حاد في نوعية الحياة بسبب النوبات المستمرة وكذلك ارتفاع خطر الوفاة المفاجئة. على الرغم من وفرة من خيارات العلاج المتاحة، حوالي 30٪ من المرضى مقاومة للأدوية. وقد تم تطوير العديد من العلاجات الجديدة باستخدام نماذج حيوانية، على الرغم من أن معدل المرضى المقاومين للأدوية لا يزال دون تغيير. أحد الأسباب المحتملة هو عدم وجود ترجمة بين نماذج القوارض والبشر ، مثل ضعف تمثيل المقاومة الدوائية البشرية في النماذج الحيوانية. أنسجة الدماغ البشرية المُجَرَّدة كأداة تقييم قبل الإكلينيكية لديها ميزة سد هذه الفجوة الترجمية. هو موضح هنا هو وسيلة لإعداد عالية الجودة لشرائح الدماغ فرس النهر الإنسان والحث مستقرة لاحقة من نشاط الصرع. البروتوكول يصف تحريض نشاط انفجار أثناء تطبيق 8 م م KCl و 4-aminopyridin. هذا النشاط حساس لاكوساميد AED المنشأة أو المرشحين رواية لمكافحة البيبيل، مثل dimethylethanolamine (DMEA). بالإضافة إلى ذلك, الأسلوب يصف التعريفي من الأحداث مثل المضبوطات في CA1 من شرائح الدماغ فرس النهر الإنسان عن طريق الحد من خارج الخلية ملغ2 + وتطبيق bicuculline, مانع مستقبلات GABAA. يمكن استخدام الإعداد التجريبي لفحص المواد المضادة للصرع المحتملة لآثارها على نشاط الصرع. وعلاوة على ذلك، يمكن التحقق من صحة آليات العمل التي تُفترض بشأن مركبات معينة باستخدام هذا النهج في الأنسجة البشرية (على سبيل المثال، استخدام تسجيلات التحامل). في الختام، فإن التحقيق في الأنسجة الحيوية في الدماغ البشري السابقين في الدماغ (هنا، الحصين المُجَرَّح من المرضى الذين يعانون من صرع الفص الصدغي) سيحسن المعرفة الحالية للآليات الفسيولوجية والمرضية في الدماغ البشري.

وقد تم تسجيل نشاط الصرع بنجاح في أنسجة فرس النهر البشرية التي تم استئصالها والتي تنشأ من ما يصل إلى 15 مريضاً. إن وضع إجراءات نقل وإعداد مستقرة أمر بالغ الأهمية لنجاح الحث على نشاط الصرع في أنسجة الدماغ البشرية. وقد أظهرت النتائج التي نشرت مؤخرا 1) التعريفي مستقرة من النشاط الصرع في الأنسجة اصطياد من المرضى مختلفة وكذلك 2) استخدام أنسجة الدماغ البشري استئصال كأداة قبل اكلينيكي لتقييم آليات مكافحة رواية14,20.
تطبيق highK++4-AP النشاط الصرع المستحث في شكل نشاط انفجار في غضون بضع دقائق (الشكل 2A، B ، C ،D). بسبب انخفاض توزيع الخلايا العصبية في أنسجة فرس النهر البشرية أو فقدان الخلايا العصبية العالية بسبب صرع الفص الصدغي (TLE) ، يمكن تعديل موضع الأقطاب الكهربائية في بداية التسجيل. في الحالات التي يكون فيها نشاط الاندفاع من شرائح غير مرئية في منطقة CA1 بعد 10 دقيقة (مستقلة عن موضع القطب)، قد تكون عرضة للقابلية للقطعة، وسوف تحتاج إلى استبدال شريحة.
يمكن أن يسبب SLEs، مع مدة >10 ق، مع تطبيق lowMg2 ++ BIC(الشكل 2E،F). ويبين الشكل 2E التعريفي مستقرة من SLEs بعد بضع دقائق وتواتر مستقر في جميع أنحاء التسجيل. هنا ، تم إجراء نشاط SLE بنجاح في شريحتين من أربع شرائح من المريض الذي تم التحقيق فيه. وأظهرت شريحة واحدة نشاط انفجار فقط بعد 15 دقيقة من النشاط SLE، في حين أن شريحة أخرى لم تظهر SLEs حتى بعد 40 دقيقة.
وفيما يتعلق بالتقييم قبل التكيني لآثار المواد، تم التحقيق في تأثير محتمل مضاد للصرع على نشاط الانفجار الناجم عن ارتفاع درجة الانبعاثات++4-AP. تم اختبار المواد المضادة للصرع المعروفة والمحتملة (لاكوساميد ، DMEA ، dynorphine14) ، وتظهر أمثلة هنا لاكوساميد AED التقليدي (مانع قناة الصوديوم) وكذلك DMEA (مادة جديدة محتملة مانعة للصرع)20. انخفض عدد الأحداث والفاصل الزمني بين الأحداث (IEI) من أحداث الانفجار أثناء تطبيق اللاكوساميد و DMEA (الشكل 3C) ، على الرغم من أن السعات لم تتأثر في الغالب (الشكل 3D). في مجموعة فرعية من الشرائح، على الرغم من أن تم تحقيق تحريض أحداث الانفجار في الدقائق القليلة الأولى، لم يتعافى تواتر النشاط أثناء الغسل من AEDs التطبيقية (البيانات غير المبينة هنا، انظر Kraus et al.20). وهنا، اعتبرت العقاقير المطبقة من أجل إحداث آثار؛ ومع ذلك، قد تتأثر الانخفاضات في نشاط الاندفاع من قبل الاضمحلال التدريجي في النشاط أثناء التسجيلات الطويلة. وبالتالي، يجب تفسير النتائج بعناية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61085/61085fig1v2.jpg"> الشكل 1: غرفة الواجهة. لتخزين شرائح الدماغ قرن آمون الإنسان, يتم استخدام غرفة واجهة مع اثنين من أجزاء عقد شريحة الدماغ (A); على وجه التحديد، غرفة واجهة من نوع هاس23. هنا، شرائح الدماغ فرس النهر بقية على (d) ثلاث طبقات من ورقة التصفية، (ه) قطع أصغر لتمكين التعامل مع شرائح الدماغ الفردية، و (و) أكبر قطعة ورقة تصفية لضمان طبقة كافية من الحل تحت شريحة. (ج)سلسلة قطنية تحيط بشرائح الدماغ، أعلى أوراق التصفية، تضمن حتى تدفق الحل من المداخل فيالجزءالعلوي من المقصورة . (ب) غطاء الغلاف يوجه الأكسجين من أسفل المقصورة إلى شريحة. (ب) منظر علوي لحجرة واحدة ممسكة بالشرائح. (ج) عرض جانبي لتوضيح طبقات أوراق المرشح. (ز)أسفل الغرفة. (ح) أنبوب للتدفق الحل، الذي يرتبط مضخة ال peristaltic (الأسهم الزرقاء علامة اتجاه تدفق الحل). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61085/61085fig1v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61085/61085fig2v2.jpg"> الشكل 2: نشاط الصرع في شرائح قرن آمون الإنسان الناجمة عن هايك++4-AP و lowMg2 ++BIC. CA1 أمثلة على تسجيلات ومقتطفات من تطبيق هايك+ (8 مل م) +4-ا ف ب (100 ميكرومتر) (A, B, C, D) و lowMg2 ++ BIC (10 μM) (E, F). (أ) تطبيق حمام من highK++4-AP يحفز نشاط الصرع في غضون بضع دقائق، والنشاط مستقر لمدة 60 دقيقة على الأقل. يتم حث نوعين مختلفين من النشاط في منطقة CA1 لشرائح قرن آمون الإنسان: المسامير الشبيهة بالتشابكات (C، تفاصيل [B]) ونشاط الانفجار (D، تفاصيل [B]) .) ) وقد تبين أن نشاط الانفجار حساس للأدوية المضادة للصرع وبالتالي تم تحليله لمعرفة تأثير المواد المضادة للصرع المحتملة(الشكل 3). (هاء، واو) تطبيق lowMg2 +BIC يحفز سليبس في مدة > 10 ق (F) في CA1 في غضون بضع دقائق. ومع ذلك، يمكن أن تصل إلى 30 دقيقة في شرائح أخرى تحريض من SLEs. أشرطة المقياس = 0.2 mV، 2 دقيقة (A، E)، 5 s (B)، 500 مللي ثانية (C، D)، 5 دقائق (E)، و 2 ثانية (F). وقد تم تكييف هذا الرقم من كراوس وآخرون20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61085/61085fig2v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61085/61085fig3v2.jpg"> الشكل 3: انخفاض نشاط انفجار الصرع من شرائح الإنسان أثناء تطبيق اللاكوساميد أو DMEA. انخفض نشاط الاندفاع أثناء تطبيق (A) اللاكوساميد و (B) DMEA ، وهو جزيء جديد محتمل لمكافحة البيبيد. (أ) و (باء) تعرض تسجيلات نموذجية للمنطقة CA1 مع مقتطفات من المناطق المستخدمة للتحليل في (C) و (D). انخفض نشاط الاندفاع خلال لاكوساميد (100 ميكرومتر) وتطبيق DMEA (10 mM) ، كما يتضح من المقتطفات الوسطى ويزيد مرة أخرى أثناء الغسل. (جيم، دال) تم تحليل عدد و اتساع نشاط الانفجار لآخر 5 دقائق من كل مرحلة تطبيق (خط الأساس ، اللاكوساميد / DMEA ، قم بالاغتسال) ويظهران على النحو النتائج الموجزة لجميع المرضى (عدد الأحداث ، C ؛ السعة ، D) على أن متوسط ± SD. كل نقطة تشير إلى مريض واحد. علامة النجمة علامة اختلافات كبيرة كما تم تقييمها من قبل اختبار فريدمان و ما بعد مخصص مع مقارنة دونيت متعددة من المجموعات لتحليل تطبيق اللاكوساميد (* p < 0.05, n = 4) أو عن طريق القياس المتكرر ANOVA وما بعد hoc مع مقارنة توكي لتحليل تطبيق DMEA (**p<lt;0.01, n = 10). أشرطة المقياس = 0.2 mV، 2 دقيقة (تسجيل كامل، A)، 5 s (مقتطفات، أ)، 3 دقائق (التسجيل الكامل، B)، و 1 s (مقتطفات، B). وقد تم تكييف هذا الرقم من كراوس وآخرون20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61085/61085fig3v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">الحل 1.1 الكولين ACSF</td>
		</tr>
<tr>
<td>مضمون</td>
			<td>تركيز 10x (mM)</td>
			<td>1x تركيز (mM)</td>
			<td>ملاحظه</td>
		</tr>
<tr>
<td>الكولين كل</td>
			<td>1100</td>
			<td>110</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(+)-نا L-أسكوربات</td>
			<td>116</td>
			<td>11.6</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2x6H2O</td>
			<td>70</td>
			<td>7</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>نا بيروفات</td>
			<td>31</td>
			<td>3.1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>25</td>
			<td>2.5</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4</td>
			<td>12.5</td>
			<td>1.25</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
			<td>260</td>
			<td>26</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2</td>
			<td>-</td>
			<td>0.5</td>
			<td>إضافة إلى الحل النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>الجلوكوز</td>
			<td>-</td>
			<td>10</td>
			<td>إضافة إلى الحل النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">الحل 1.2 aCSF</td>
		</tr>
<tr>
<td>مضمون</td>
			<td>تركيز 10x (mM)</td>
			<td>1x تركيز (mM)</td>
			<td>ملاحظه</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>1290</td>
			<td>129</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4</td>
			<td>12.5</td>
			<td>1.25</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2</td>
			<td>16</td>
			<td>1.6</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>30</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>مغس 4</td>
			<td>18</td>
			<td>1.8</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الجلوكوز</td>
			<td>-</td>
			<td>10</td>
			<td>إضافة إلى الحل النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">الحل 1.3 هايك++4-AP aCSF</td>
		</tr>
<tr>
<td>مضمون</td>
			<td>تركيز 10x (mM)</td>
			<td>1x تركيز (mM)</td>
			<td>ملاحظه</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>1240</td>
			<td>124</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4</td>
			<td>12.5</td>
			<td>1.25</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2</td>
			<td>16</td>
			<td>1.6</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>80</td>
			<td>8</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>مغس 4</td>
			<td>18</td>
			<td>1.8</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الجلوكوز</td>
			<td>-</td>
			<td>10</td>
			<td>إضافة إلى الحل النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>4-AP</td>
			<td>-</td>
			<td>0.1</td>
			<td>إضافة إلى الحل النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">الحل 1.4 lowMg2++ BIC aCSF</td>
		</tr>
<tr>
<td>مضمون</td>
			<td>تركيز 10x (mM)</td>
			<td>1x تركيز (mM)</td>
			<td>ملاحظه</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>1300</td>
			<td>130</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4</td>
			<td>12.5</td>
			<td>1.25</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2</td>
			<td>16</td>
			<td>1.6</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>30</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>الجلوكوز</td>
			<td>-</td>
			<td>10</td>
			<td>إضافة إلى الحل النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bic</td>
			<td>-</td>
			<td>0.01</td>
			<td>إضافة إلى الحل النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">الحل 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>مضمون</td>
			<td>تركيز 10x (mM)</td>
			<td>1x تركيز (mM)</td>
			<td>ملاحظه</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
			<td>210</td>
			<td>21</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: إعداد حلول 10x و1x النهائية للنقل والإعداد والتسجيل.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings at JoVE.com

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

ويصف البروتوكول المقدم نقل وإعداد أنسجة فرس النهر البشرية التي تم استئصالها بهدف نهائي هو استخدام شرائح الدماغ الحيوية كأداة تقييم قبل الظهر للمواد المضادة للصرع المحتملة.

إعداد شرائح فرس النهر البشري الحادة للتسجيلات الكهربية

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

باستخدام أسلوبنا، يمكننا اختبار المواد المضادة للصرع المحتملة داخل عينات الدماغ البشري للمساعدة في تطوير المخدرات للصرع الفص الصدغي. أنسجة الدماغ البشري لديه ميزة اختراق الغطاء الترجمي بين البحوث الأساسية والتطبيقات السريرية. في يوم الإجراء أو في وقت متأخر قدر الإمكان في اليوم السابق, ذوبان 50 ملليلتر من محلول 10x الكولين ACSF في حمام الماء 37 درجة مئوية وإضافة محلول ذوبان و 50 ملليلتر من 10x حل اثنين إلى ما يقرب من 300 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج.إضافة التركيزات النهائية من الجلوكوز وكلوريد الكالسيوم إلى الخليط ويحرك حتى يذوب. ثم، إضافة الماء المقطر المزدوج إلى حجم النهائي من 500 ملليلتر. قياس التناضح.وملء زجاجة مع ما يقرب من 100 ملليلتر من 1X الكولين ACSF. في يوم الإجراء, هدئ 1x الكولين aCSF على الجليد واستخدام موزع غاز الزجاج متصلة بغاز كاربوجين لcarogenate الحل لمدة لا تقل عن 10 إلى 15 دقيقة. على الأقل 10 إلى 15 دقيقة قبل الإجراء، قبل الدفء تخزين aCSF، والبوتاسيوم عالية بالإضافة إلى 4-أمينوبريدين aCSF، وانخفاض المغنيسيوم بالإضافة إلى bicuculline إلى 35 درجة مئوية مع carbogenation.لتحضير غرفة الواجهة، قم بقطع ورق الفلتر من أربعة في اثنين من السنتيمتر لكل حجرة تحمل الشريحة وكومة القطع فوق بعضها البعض. ثم، ضع سلاسل قطنية رقيقة حول قطعة من ورق التصفية داخل المقصورات لكسر التوتر في المحلول وضمان تدفق زوجي. ووضع ثلاثة إلى أربعة قطعة 1.5 في سنتيمتر واحد من ورق التصفية فوق قطعة أكبر من ورقة التصفية في كل حجرة.قبل الحصول على شرائح الأنسجة، استخدم 70٪ الإيثانول لمسح منطقة التحضير ووضع غطاء على المنطقة. مكان الغراء السوبر، واثنين من ملاقط حادة، ملعقة، مشرط مع شفرات، وشفرة لقطع الخام من أنسجة الدماغ بالقرب من الاهتزاز. مسح علبة العازلة ولوحة عينة من هزاز مع 70٪ الإيثانول.عندما تكون علبة العازلة جافة تمامًا، غطيها برقائق الألومنيوم ووضعها في حمام الثلج. ملء حمام الجليد مع الثلج المسحوق والحفاظ على الحمام في ناقص 20 درجة مئوية حتى التحضير. ثم، مسح شفرة هزاز وشفرة حلاقة مع 70٪ الإيثانول ومعايرة هزاز لتقليل أي اهتزازات عمودية وتلف الأنسجة أثناء إجراء التقطيع.مباشرة بعد الحصول على عينة الأنسجة, إزالة الأنسجة من نقل الكولين aCSF وقطع أي أجزاء محروقة من الأنسجة. قطع سطح حتى لتسهيل الإلتصاق من قطعة الأنسجة على لوحة العينة واستخدام هزاز لشريحة أنسجة الدماغ إلى شرائح 400 ميكرومتر سميكة، وضبط السعة وسرعة الهزاز حسب الضرورة أثناء القطع. يمكن لبعض أجزاء من الحصين الإنسان تكون أكثر مقاومة للقطع من غيرها.يمكن أن تأخذ المزيد من الرعاية والوقت إلى حد كبير تحسين نوعية العينة. استخدام مشرط لتقليم شرائح الدماغ لتناسب في غرفة تسجيل واستخدام ملعقة ملقط صغيرة لوضع بعناية شرائح على قطعة صغيرة من ورقة تصفية في غرفة واجهة لمدة ساعة واحدة على الأقل. لتسجيل نشاط الصرع ، ضع غشاء شبه نفاذي ملتصق بطوق بلاستيكي في الغرفة وربط أنابيب التدفق وتدفق الغرفة بمضخة م peristaltic.ملء الأنابيب والغرفة مع aCSF مُدفأة مسبقاً. لإعداد أقطاب تسجيل، سحبت ملء واحد إلى اثنين من ماصات الزجاج megaohm مع 154 ميل كلوريد الصوديوم ميليمولار. ضع الماصات في حامل قطب كهربائي واستخدم ملاقط وملعقة لنقل شريحة فرس النهر من غرفة الواجهة إلى طبق بيتري مليء بـ aCSF carbogenated.قم بإزالة ورق التصفية دون تقليب الشريحة ووضع الشريحة في غرفة التسجيل. عقد شريحة في مكان مع شبكة شريحة ووضع الأقطاب الكهربائية في المنطقة ذات الاهتمام. ابدأ التسجيل.وينبغي أن يكون نشاط الانفجار الناجم عن البوتاسيوم عالية بالإضافة إلى 4-aminopyridine مرئية بعد دقيقتين إلى خمس دقائق من الغسيل في, في حين أن تحريض الأحداث مثل المضبوطات من قبل المغنيسيوم منخفضة بالإضافة إلى bicuculline يمكن أن يستغرق ما يصل إلى 30 دقيقة. تطبيق البوتاسيوم عالية بالإضافة إلى 4-aminopyridine يحفز نشاط الصرع في شكل أحداث انفجار في غضون بضع دقائق. يمكن أن يسبب حدوث النوبات مثل مع مدة أكثر من 10 ثانية مع تطبيق المغنيسيوم منخفضة بالإضافة إلى bicuculline.عدد الأحداث انفجار يقلل سواء أثناء تطبيق اللاكوساميد وتطبيق dimethylethanolamine، على الرغم من أن السعات هي في معظمها لا تتأثر. ويمكن أيضا تحسين نوعية أنسجة المخ عن طريق الحد من التلوث والأضرار أثناء التحضير. ويمكن أيضا شرائح الدماغ البشرية المعدة مع أساليبنا يمكن استخدامها للتحقيق في الوظائف الفسيولوجية الأساسية للخلايا العصبية باستخدام المشبك التصحيح أو التحقيق في التعبير الجيني باستخدام تقنيات مختلفة.بدأت المختبرات في جميع أنحاء العالم في دراسة الآليات الأساسية داخل الدماغ البشري، ويمكن استخدام هذه الرؤى للمساعدة في تطوير الأدوية ويمكن اختبارها باستخدام أساليبنا المقترحة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

إعداد Oligomeric β اميلويد 1-42 والتعريفي للعاهة اللدونة متشابك على شرائح الحصين

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

إعداد شرائح الحصين الحادة من الجرذان والفئران المعدلة وراثيا لدراسة التعديلات متشابك وامراض الشيخوخة خلال اميلويد

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

إعداد شرائح الحاد المنطقة Subventricular للتصوير الكالسيوم

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

تحسين إعداد والحفاظ على شرائح الحصين ماوس لتسجيل مستقرة جدا وقابلة للتكرار من التقوية بعيدة المدى

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

تقرن تسجيلات خلية كاملة في عضوي شرائح الحصين

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

الكهربية والمورفولوجية توصيف العصبية الحادة رقائق في الدماغ عن طريق شرائح الموثوقة التصحيح، المشبك التسجيلات

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

التحقيق في متشابك وسم / القبض على والصليب التقاط باستخدام الحاد شرائح الحصين من القوارض

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

إعداد شرائح الدماغ الحادة باستخدام محسن N-الميثيل-د-أسلوب استرداد واقية جلوكاميني

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

إعداد شرائح أفقية من الكبار شبكية العين الفأر للدراسات الكهربية

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...