Name: preparation of acute human hippocampal slices for electrophysiological recordings
Uploaded: 2020-05-07T15:00:00
Duration: 7 min 31 s
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हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मैंडी मार्बलर-पोटर (चार्नाइट-अनवर्सिट्समेडिन, बर्लिन) का शुक्रिया अदा करते हैं। पीएफ को जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति-EXC-2049-390688087 के तहत जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी, ड्यूश फोर्स्चुंग्सगेमेस्चैफ्ट) द्वारा वित्त पोषित किया गया था । इस काम को बर्लिन इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ में बायोमेडिकल रिसर्च को बदलने के लिए क्वेस्ट सेंटर द्वारा समर्थित किया गया है ।

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लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

जीवित पुनः प्राप्त मानव मस्तिष्क ऊतक AEDs के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन में एक अत्यधिक मूल्यवान उपकरण है, क्योंकि यह ठीक से एक अक्षुण्ण मानव मस्तिष्क माइक्रो नेटवर्क का प्रतिनिधित्व करता है । प्रस्तुत प्रोटोकॉल ऊतक परिवहन और तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन करता है, जो उच्च गुणवत्ता वाले हिप्पोकैम्पस स्लाइस के साथ-साथ एईड मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण मिर्गी गतिविधि के लिए एक स्थिर प्रेरण विधि सुनिश्चित करता है।
मिर्गी की गतिविधि की जांच के साथ - साथ मानव मस्तिष्क के स्लाइस में रासायनिक या विद्युत प्रेरण के तरीकों की जांच पहले अन्य समूहोंद्वारा 17, 20,21,2221को22दिखाई गई है । यह प्रोटोकॉल उच्च के+ +4-एपी के आवेदन के माध्यम से विभिन्न रोगियों से स्लाइस में स्थिर फट गतिविधि के शामिल होने के साथ-साथ कम एमजी2 + +बीआईसी के आवेदन के माध्यम से CA1 क्षेत्र में SLEs के शामिल होने का वर्णन करता है । यह पाया गया कि फट गतिविधि का प्रेरण SLEs (एक रोगी में परीक्षण स्लाइस का 50%) के शामिल होने की तुलना में अधिक सुसंगत है (15 रोगियों में परीक्षण स्लाइस का 80%)। हालांकि, इस प्रकार अब तक, SLEs के शामिल केवल एक मरीज में परीक्षण किया गया है । फिर भी, कम एमजी2 + +बीआईसी द्वारा SLEs के शामिल करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि SLEs अभी तक उच्च कश्मीर+ ++ 4-एपी का उपयोग करके प्रेरित नहीं किया जा सका है ।
कई अध्ययनों ने मानव मस्तिष्क के ऊतकों के परिवहन और तैयारी के तरीके शुरू किए हैं और अक्सर न्यूरोनल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण तीन कारकों को उजागर करते हैं: परिवहन समय, परिवहन समाधान का उपयोग किया जाता है, और शर्तों का भंडारण होता है।
इष्टतम टुकड़ा व्यवहार्यता के लिए, कुछ समूहों का सुझाव है कि पुनः प्राप्त मस्तिष्क ऊतक के परिवहन के रूप में संभव के रूप में कम हो । हालांकि, ऑपरेशन रूम और प्रयोगशालाएं शायद ही कभी निकटता में होती हैं, जिसका अर्थ है कि स्लाइस गुणवत्ता को लंबे परिवहन के कारण समझौता किया जा सकता है। कुछ समूहों ने परिवहन12के दौरान समाधान के लिए निरंतर O2 लागू करके इस बाधा को दूर किया है । हमने परिवहन के दौरान लगातार अतिरिक्त ओ2 आपूर्ति के बिना कम (अधिकतम = 15 मिनट) और लंबी (1 घंटे तक) अवधि के लिए मस्तिष्क के ऊतकों को ले जाया है, जो अन्य समूहों18,,25के समान है। इन मामलों में, मिर्गी रिकॉर्डिंग के दौरान ऊतक की गुणवत्ता में अंतर नहीं देखा गया था। हमारे संस्थान में अन्य समूहों के साथ संचार में, स्लाइस गुणवत्ता पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए नहीं बदली, या तो। इसके विपरीत, ऊतक की गुणवत्ता में भिन्नता संभवतः संचालन, लंबे समय तक पुनर्सेक्शन और स्लाइसिंग प्रक्रिया के दौरान नुकसान से उपजी है।
परिवहन और काटने के समाधान के संबंध में, सभी प्रकाशित तरीके एनएसीएल को ओएस्मोटिक दबाव के कारण कोशिका सूजन को कम करने के लिए समाधानों से छोड़ देते हैं, जो कृंतक पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए मानक प्रक्रिया के समान होते हैं। हालांकि, अब तक कई विकल्प पेश किए गए हैं (यानी सुक्रोज आधारित एसीसीएफ13,,22,एनएमडीजी आधारित एसीएसएफ12,,26और कोलीन आधारित एसीएसएफ27)। टिंग और सहयोगियों ने 201426 में स्लाइस तैयारी के लिए एनएमडीजी आधारित एसीएसएफ पेश किया और बाद में एक रिकवरी प्रोटोकॉल जोड़ा, जो धीरे-धीरे एनएसीएल को स्लाइस28में फिर से पेश करता है। हालांकि, जैसा कि टिंग एट अल द्वारा वर्णित है, एनएमडीजी-आधारित aCSF में तैयार मस्तिष्क ऊतक के न्यूरॉन्स उच्च झिल्ली प्रतिरोध दिखाते हैं, इस प्रकार पैच-क्लैंप प्रयोगों26के दौरान पूरे सेल सील को प्रभावित करते हैं। इसलिए, हमने एनएमडीजी आधारित एसीएसएफ से कोलीन-आधारित एसीएसएफ20के उपयोग में संक्रमण किया है, जो क्षेत्र की क्षमता और पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग दोनों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले स्लाइस पैदा करता है।
स्लाइस के भंडारण के संबंध में, यह आम तौर पर स्वीकार किया जाता है कि इंटरफ़ेस की स्थिति लंबे स्लाइस अस्तित्व18के लिए महत्वपूर्ण इष्टतम ऑक्सीजन प्रदान करती है। हालांकि, अन्य समूह जलमग्न परिस्थितियों में 72 घंटे तक के लिए स्लाइस अस्तित्व दिखाते हैं12। पिछली परिकल्पना के विपरीत, मानव मस्तिष्क स्लाइस कृंतक स्लाइस की तुलना में कम ऑक्सीजन या ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए अधिक प्रतिरोधी प्रतीत होते हैं। मुख्य रूप से, इंटरफ़ेस कक्षों का उपयोग पहले मानव हिप्पोकैम्पल स्लाइस के भंडारण के लिए किया गया है, हालांकि पैच-क्लैंप प्रयोगों में मानव मस्तिष्क स्लाइस के रखरखाव के लिए जलमग्न स्थितियों की सिफारिश की जाती है।
जैसा कि अन्य समूहों द्वारा चर्चा की गई है, लंबे स्लाइस सर्वाइवल (इंटरफ़ेस फॉर &48 एच18,के लिए जलमग्न <72 h12)के लिए एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम बैक्टीरियल संदूषण की रोकथाम है। कृंतक मस्तिष्क स्लाइस आमतौर पर 8 घंटे तक के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग में उपयोग किए जाते हैं, और इस अवधि के दौरान बैक्टीरियल संदूषण को स्लाइस व्यवहार्यता को प्रभावित करने के लिए नहीं माना जाता है। एक resection से तैयार स्लाइस की उच्च संख्या और मानव मस्तिष्क ऊतक की असामान्य उपलब्धता मानव मस्तिष्क स्लाइस की व्यवहार्यता को लम्बा करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया । यह विधि सफलतापूर्वक जीवित मानव हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी का वर्णन करती है, जिसे आसानी से बाँझ स्थितियों के अनुकूल किया जा सकता है। हालांकि, यहां प्रदर्शन की रिकॉर्डिंग के लिए, स्लाइस अस्तित्व 20 एच का विस्तार एक प्राथमिकता नहीं थी ।
एसएलएस22जैसी मिर्गी की गतिविधि को शामिल करने के लिए इंटरफेस कक्षों में रिकॉर्डिंग भी आवश्यक दिखाई गई है । कम ऑक्सीजन के कारण जलमग्न स्थितियों, शायद ही कभी SLEs की रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किया जाता है; हालांकि, वे पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए आवश्यक ऑप्टिकल उच्च संकल्प के लिए आवश्यक हैं। एक अनुकूलित जलमग्न प्रकार रिकॉर्डिंग कक्ष का उपयोग उच्च ऑक्सीजन और तेजी से दवा आवेदन29के कारण, मानव मस्तिष्क स्लाइस में मिर्गी गतिविधि (बाह्य क्षेत्र या एकल न्यूरॉन) की रिकॉर्डिंग को सक्षम बनाता है। यहां, क्षेत्र संभावित रिकॉर्डिंग के लिए तरीकों और परिणामों का वर्णन किया जाता है, लेकिन इस बात पर जोर दिया जाना चाहिए कि इस संशोधित रिकॉर्डिंग कक्ष (डेटा नहीं दिखाए गए) का उपयोग करके माउस और मानव मस्तिष्क स्लाइस में पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग सफलतापूर्वक की गई है।
कृंतक मॉडल की तुलना में मानव मस्तिष्क के ऊतकों का पुनर्संरस्रीय मूल्य अधिक होता है। यह एक वयस्क, रोगग्रस्त न्यूरोनल नेटवर्क का प्रतिनिधित्व करता है जिसे आईपीएससी द्वारा पुन: पेश नहीं किया जा सकता है। हालांकि, किसी भी इन विट्रो सिस्टम की तरह, मानव मस्तिष्क स्लाइस एक अक्षुण्ण मानव मस्तिष्क का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। इसके अतिरिक्त, पुनः प्राप्त मस्तिष्क ऊतक के रिकॉर्ड किए गए न्यूरोनल नेटवर्क ऑपरेशन या तैयारी के दौरान नुकसान के कारण पर्याप्त आणविक और कार्यात्मक परिवर्तनों से गुजर सकते हैं। टुकड़ा करने की प्रक्रियाओं को गाबैर्जिक कार्य को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है और मिर्गी की गतिविधि30को शामिल करने पर प्रभाव पड़ सकता है । परिकल्पना तैयार करते समय इन सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए। संभावित एंटीएपिप्टिक दवाओं का परीक्षण करते समय, विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों के उपयोग पर विचार किया जाना चाहिए, क्योंकि सभी मानव मस्तिष्क क्षेत्रों या सभी रोगियों में दवा लक्ष्य व्यक्त नहीं किए जा सकते हैं। विशेष रूप से, TLE रोगियों के हिप्पोकैम्पी अक्सर गंभीर न्यूरोनल सेल हानि के साथ हिप्पोकैम्पल स्क्लेरोसिस के लक्षण दिखाते हैं। रोग परिवर्तन और रोग के इतिहास पर रोगी की जानकारी प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है, जैसे दवाओं के प्रति संभावित रिफ्रैक्टरी, और डेटा व्याख्या के दौरान इस पर विचार करें।
अंत में, यह विधि सफलतापूर्वक दो अलग-अलग प्रकार की मिर्गी गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए जीवित मानव हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस और प्रेरण तकनीकों की तैयारी का वर्णन करती है। चूंकि जीवित मानव मस्तिष्क ऊतक की उपलब्धता दुर्लभ है, इसलिए मानव मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करके प्रयोगों से अधिकतम उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित परिवहन और रिकॉर्डिंग शर्तों का उपयोग किया जाना चाहिए। यह सुझाव दिया जाता है कि मानव मस्तिष्क ऊतक को कृंतक मॉडल और सेल संस्कृति प्रयोगों के अलावा एक प्रीक्लीनिकल सत्यापन उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61085/preparation-acute-human-hippocampal-slices-for-electrophysiological">Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings</a>. Step 2.1.3 in the Protocol was corrected.
Step 2.1.3 in the Protocol was updated from:
Add final concentrations of glucose and MgCl, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).
to:
Add final concentrations of glucose and CaCl2, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61085/preparation-acute-human-hippocampal-slices-for-electrophysiological">Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings</a>. Step 2.1.3 in the&#160;Protocol was corrected.

Erratum: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

मिर्गी दुनिया की आबादी के 1% को प्रभावित करने वाले सबसे आम न्यूरोलॉजिकल विकारों में से एक है, और बढ़ी हुई रुग्णता और मृत्यु दर1,,2से जुड़ा हुआ है। दुर्भाग्य से, मिर्गी से पीड़ित रोगियों में से एक तिहाई दवा प्रतिरोधी हैं, 20 से अधिक अनुमोदित एंटीएपिप्टिक दवाओं (AEDs)3सहित उपलब्ध उपचार विकल्पों की एक बहुतायत के बावजूद । पूर्व नैदानिक पशु अनुसंधान से नैदानिक परीक्षणों के लिए परिणामों का अनुवाद करने में विफलता एक कारण है कि कई रोगियों में आशाजनक उपचार रणनीतियां प्रभावी नहीं हैं4. हाल ही में, न्यूरोपेप्टाइड वाई (एनपीआई) और गैलेनिन को पशु मॉडलों में एंटीपाइप्टिक प्रभाव दिखाया गया है; हालांकि, जब पुनर्जीवित मानव मस्तिष्क ऊतक में परीक्षण किया, केवल NPY प्रभावी5था .
मौजूदा बुनियादी तंत्रिका विज्ञान तंत्र और रोग चिकित्सा दृष्टिकोण दृष्टिकोण के विषय में ज्ञान के अधिकांश पशु मॉडल और सेल संस्कृति प्रयोगों से स्टेम । हालांकि जानकारीपूर्ण, इन मॉडलों केवल जटिल मानव रोगों और वयस्क मानव मस्तिष्क नेटवर्क के एक पहलुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । वैकल्पिक रूप से, मानव मस्तिष्क ऊतक में ट्रांसलेशनल गैप को पाटने की क्षमता है लेकिन कार्यात्मक अध्ययन के लिए शायद ही कभी उपलब्ध है। उदाहरण के लिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति, मस्तिष्क आकृति विज्ञान, या शारीरिक कनेक्शन की जांच करने में पोस्टमार्टम मस्तिष्क ऊतक एक मूल्यवान उपकरण रहा है, हालांकि न्यूरोनल गतिविधि अक्सर समझौता किया जाता है यह ऊतक6,,7,,8,,9,10, 11,11है।,
इसके विपरीत, जीवित पुनः प्राप्त मानव मस्तिष्क के ऊतकों की जांच प्रीक्लिनिकल दवा मूल्यांकन, बुनियादी न्यूरोनल कार्यों और जीन,अभिव्यक्ति पैटर्न12, 13,14,,,15,,16,,17से संबंधित की गई है ।17 कृंतक स्लाइस की तुलना में मानव मस्तिष्क स्लाइस का एक बड़ा लाभ रीसेक्शन और तैयारी के बाद न्यूरोनल ऊतक की लंबी व्यवहार्यता है। कृंतक मस्तिष्क स्लाइस की तुलना में, जिसे आमतौर पर तैयारी के बाद 8 घंटे तक दर्ज किया जा सकता है, मानव मस्तिष्क स्लाइस 72 घंटे तक के लिए स्थिर न्यूरोनल गतिविधि दिखाते हैं, जिससे इन दुर्लभ और मूल्यवान नमूनों की पूरी जांच को सक्षम किया जाता है12,,18।
कई अध्ययनों ने पुनः प्राप्त कॉर्टिकल और हिप्पोकैम्पस मानव ऊतक के विभिन्न क्षेत्रों में मिर्गी गतिविधि के गुणों की जांच की है और मिर्गी गतिविधि को शामिल करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया है। कृंतक स्लाइस में, मिर्गी गतिविधि को कई तरीकों से प्रेरित किया जा सकता है: डीजी हिलर कोशिकाओं की विद्युत उत्तेजना, बाह्य के+ (8-12 mM KCl) की वृद्धि, बाइकक्यूक्लिन (बीआईसी) द्वारा गाबाए रिसेप्टर्स को अवरुद्ध करना, पोटेशियम चैनलों को 4-अमीनोपीरिडीन (4-एपी) द्वारा अवरुद्ध करना, और अतिरिक्त समाधानमें2 + को हटाना या कम करना। तथापि, मानव ऊतक में मिर्गी की गतिविधि को शामिल करने के लिए उपरोक्त विधियों में से कम से कम दो के संयोजन की आवश्यकता होती है20,21,22.
यहां प्रस्तुत मानव हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी के लिए एक विधि है, जो 20 घंटे तक के लिए व्यवहार्य हैं और उच्च K+ (8 mM) और 4-एपी या कम एमजी2 + और बीआईसी के आवेदन पर मिर्गी के रूप गतिविधि के शामिल दिखाने के लिए ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>(+)-Na L-ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>275875-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>eliteSERVE GmbH</td>
			<td>HW3</td>
			<td>used for the vibratome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline Cl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Tiffen</td>
			<td>EK1546027T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas-tight bottle caps</td>
			<td>Carl Roth GmbH+Co.KG</td>
			<td>E694.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments</td>
			<td>Science Products</td>
			<td>GB150F-8P</td>
			<td>for recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass gas disperser</td>
			<td>DWK Life Sciences GmbH</td>
			<td>258573309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface Chamber</td>
			<td>inhouse made</td>
			<td>-</td>
			<td>see Haas et al., 1979</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>131494.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane (Cell culture inserts)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PICM030050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane chamber</td>
			<td>inhouse made</td>
			<td>-</td>
			<td>see Hill and Greenfield, 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8729;6H2O</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HNO3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HNO1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice holder</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td>SHD-41/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of acute human hippocampal slices for electrophysiological recordings

मिर्गी दुनिया की आबादी के बारे में 1% को प्रभावित करता है और चल रहे दौरे के साथ-साथ अचानक मौत के लिए उच्च जोखिम के कारण जीवन की गुणवत्ता में गंभीर कमी की ओर जाता है। उपलब्ध उपचार विकल्पों की बहुतायत के बावजूद, लगभग 30% रोगी दवा प्रतिरोधी हैं। कई उपन्यास चिकित्सा पशु मॉडल का उपयोग कर विकसित किया गया है, हालांकि दवा प्रतिरोधी रोगियों की दर अनछुए रहता है । संभावित कारणों में से एक कृंतक मॉडल और मनुष्यों के बीच अनुवाद की कमी है, जैसे पशु मॉडल में मानव फार्मासियों का कमजोर प्रतिनिधित्व। एक पूर्व नैदानिक मूल्यांकन उपकरण के रूप में मानव मस्तिष्क ऊतक को फिर से उठाया इस अनुवाद अंतर को पाटने के लिए लाभ है। यहां वर्णित मानव हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस की उच्च गुणवत्ता की तैयारी और मिर्गी गतिविधि के बाद स्थिर प्रेरण के लिए एक विधि है। प्रोटोकॉल में 8 एमएमएम केसीएल और 4-अमीनोपिरिन के आवेदन के दौरान फट गतिविधि को शामिल करने का वर्णन किया गया है। यह गतिविधि स्थापित एईड लैकोसमाइड या उपन्यास एंटीपाइप्टिक उम्मीदवारों, जैसे डाइमेथाइलेथेनथेनमाइन (डीएमईए) के प्रति संवेदनशील है। इसके अलावा, विधि एक्सट्रासेलुलर एमजी2 + और बाइकक्यूलिन, एक गाबाए रिसेप्टर अवरोधक के आवेदन में कमी करके मानव हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क स्लाइस के CA1 में जब्ती जैसी घटनाओं को शामिल करने का वर्णन करती है। प्रयोगात्मक सेट-अप का उपयोग मिर्गी गतिविधि पर उनके प्रभाव के लिए संभावित एंटीपाइप्टिक पदार्थों को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, विशिष्ट यौगिकों के लिए पोस्ट किए गए कार्रवाई के तंत्र को मानव ऊतक में इस दृष्टिकोण का उपयोग करके मान्य किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग करके)। समाप्त करने के लिए, महत्वपूर्ण मानव मस्तिष्क ऊतक पूर्व वीवो की जांच (यहां, लौकिक पालि मिर्गी से पीड़ित रोगियों से हिप्पोकैम्पस को पुनः प्राप्त किया गया) मानव मस्तिष्क में शारीरिक और रोग तंत्र के वर्तमान ज्ञान में सुधार करेगा।

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Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

प्रस्तुत प्रोटोकॉल संभावित एंटीएपिप्टिक पदार्थों के लिए एक प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन उपकरण के रूप में महत्वपूर्ण मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करने के अंतिम लक्ष्य के साथ पुनः प्राप्त मानव हिप्पोकैम्पस ऊतक के परिवहन और तैयारी का वर्णन करता है।

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए तीव्र मानव हिप्पोकैम्पल स्लाइस की तैयारी

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

हमारी तकनीक का उपयोग करना, हम लौकिक पालि मिर्गी के लिए दवा के विकास में सहायता करने के लिए मानव मस्तिष्क के नमूनों के भीतर संभावित विरोधी मिर्गी पदार्थों का परीक्षण कर सकते हैं । मानव मस्तिष्क ऊतक बुनियादी अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों के बीच अनुवाद टोपी उल्लंघन का लाभ है। प्रक्रिया के दिन या पहले दिन संभव के रूप में देर से, एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में एक 10x कोलीन aCSF समाधान के ५० मिलीलीटर गल और गल समाधान और 10x समाधान दो के ५० मिलीलीटर डबल आसुत पानी के लगभग ३०० मिलीलीटर जोड़ें ।मिश्रण में ग्लूकोज और कैल्शियम क्लोराइड की अंतिम सांद्रता जोड़ें और भंग होने तक हलचल करें। फिर, 500 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में डबल-डिस्टिल्ड पानी जोड़ें। ऑस्मोलेरिटी को मापें।और 1x कोलीन aCSF के लगभग 100 मिलीलीटर के साथ एक बोतल भरें। प्रक्रिया के दिन, बर्फ पर 1x कोलीन aCSF ठंडा करें और कम से कम 10 से 15 मिनट के लिए समाधान को कार्बोजन गैस से जुड़े ग्लास गैस डिस्पेंसर का उपयोग करें। प्रक्रिया से कम से कम 10 से 15 मिनट पहले, भंडारण एसीएसएफ, उच्च पोटेशियम प्लस 4-अमीनोपीडिन एएसएसएफ, और कम मैग्नीशियम प्लस बाइक्यूलिन को कार्बोजेनेशन के साथ 35 डिग्री सेल्सियस तक प्रीवार्म करें।इंटरफ़ेस चैंबर तैयार करने के लिए, प्रत्येक स्लाइस-होल्डिंग डिब्बे के लिए फिल्टर पेपर के दो चार-बाय-दो सेंटीमीटर टुकड़े काटें और टुकड़ों को एक-दूसरे के ऊपर ढेर करें। फिर, समाधान के तनाव को तोड़ने और एक भी प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए डिब्बों के अंदर फिल्टर पेपर के टुकड़ों के चारों ओर पतली कपास तार रखें। और प्रत्येक डिब्बे में फिल्टर पेपर के बड़े टुकड़े के शीर्ष पर फिल्टर पेपर के तीन से चार 1.5-बाय-एक सेंटीमीटर टुकड़े रखें।ऊतक स्लाइस प्राप्त करने से पहले, तैयारी क्षेत्र को मिटाने और क्षेत्र पर एक कवर रखने के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करें। सुपर गोंद, दो तेज चिमटी, एक स्पैटुला, ब्लेड के साथ एक स्केलपेल, और कंपन के पास मस्तिष्क के ऊतकों के किसी न किसी काटने के लिए एक ब्लेड रखें। 70% इथेनॉल के साथ वाइब्रेटोम की बफर ट्रे और नमूना प्लेट को पोंछें।जब बफर ट्रे पूरी तरह से सूखी हो जाए तो इसे एल्यूमीनियम फॉयल से ढक कर आइस बाथ में ट्रे रखें। कुचल बर्फ के साथ बर्फ स्नान भरें और तैयारी तक शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर स्नान बनाए रखें। फिर, 70% इथेनॉल के साथ वाइब्रेटम और रेजर ब्लेड को मिटा दें और स्लाइसिंग प्रक्रिया के दौरान किसी भी ऊर्ध्वाधर कंपन और ऊतक क्षति को कम करने के लिए वाइब्रेकोम को कैलिब्रेट करें।ऊतक नमूना प्राप्त करने के तुरंत बाद, परिवहन कोलीन aCSF से ऊतक को हटा दें और ऊतक के किसी भी जले हुए हिस्सों को काट दें। नमूना प्लेट पर ऊतक टुकड़े की चिपकाने की सुविधा के लिए एक भी सतह काटें और काटने के दौरान आवश्यक के रूप में कंपन की गति को समायोजित करते हुए, मस्तिष्क के ऊतकों को 400-माइक्रोमीटर-मोटी स्लाइस में काटने के लिए कंपन का उपयोग करें। मानव हिप्पोकैम्पस के कुछ हिस्से दूसरों की तुलना में काटने के लिए अधिक प्रतिरोधी हो सकते हैं।अतिरिक्त देखभाल और समय लेने से नमूना गुणवत्ता में काफी सुधार हो सकता है। रिकॉर्डिंग कक्ष में फिट होने के लिए मस्तिष्क स्लाइस को ट्रिम करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें और कम से कम एक घंटे के लिए इंटरफ़ेस कक्ष में फिल्टर पेपर के छोटे टुकड़ों पर स्लाइस को ध्यान से रखने के लिए एक स्पैटुला और छोटे संदंश का उपयोग करें। मिर्गी गतिविधि रिकॉर्डिंग के लिए, एक अर्ध-पारमी झिल्ली को एक प्लास्टिक की अंगूठी से चिपके हुए कक्ष में रखें और कक्ष के प्रवाह और बहिर्वाह ट्यूबों को एक पेरिस्टाल्टिक पंप से कनेक्ट करें।ट्यूब और चैंबर को पूर्व-गर्म कार्बोजनेटेड एसीएसएफ के साथ भरें। रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड तैयार करने के लिए, 154 मिलीमोलर सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ एक से दो मेगाओएम ग्लास पिपेट को भरें। पिपेट को इलेक्ट्रोड धारक में रखें और इंटरफेस चैंबर से एक हिप्पोकैम्पस स्लाइस को कार्बोजनेटेड एसीएसएफ से भरे पेट्री डिश में स्थानांतरित करने के लिए चिमटी और एक स्पैटुला का उपयोग करें।स्लाइस को फ्लिप किए बिना फिल्टर पेपर निकालें और स्लाइस को रिकॉर्डिंग चैंबर में रखें। स्लाइस जाल के साथ जगह में टुकड़ा पकड़ो और ब्याज के क्षेत्र में इलेक्ट्रोड जगह है। रिकॉर्डिंग शुरू करें।उच्च पोटेशियम प्लस 4-अमीनोपीडाइन द्वारा प्रेरित फट गतिविधि धोने के दो से पांच मिनट बाद दिखाई दी जानी चाहिए, जबकि कम मैग्नीशियम प्लस बाइक्यूलिन द्वारा जब्ती जैसी घटनाओं को शामिल करने में 30 मिनट तक का समय लग सकता है । उच्च पोटेशियम प्लस 4-अमीनोपिट्रिडीन का अनुप्रयोग कुछ ही मिनटों के भीतर फट घटनाओं के रूप में मिर्गी गतिविधि को प्रेरित करता है। 10 सेकंड से अधिक की अवधि के साथ जब्ती जैसी घटनाओं को कम मैग्नीशियम प्लस बाइकक्यूलाइन के अनुप्रयोग के साथ प्रेरित किया जा सकता है।लैकोसमाइड के आवेदन और डाइमेथाइलथेनथेनमाइनमाइन के आवेदन के दौरान फट घटनाओं की संख्या कम हो जाती है, हालांकि आयाम ज्यादातर अप्रभावित होते हैं। तैयारी के दौरान संदूषण और नुकसान को कम करके मस्तिष्क के ऊतकों की गुणवत्ता में भी सुधार किया जा सकता है। हमारे तरीकों के साथ तैयार मानव मस्तिष्क स्लाइस भी पैच क्लैंप का उपयोग कर न्यूरॉन्स के बुनियादी शारीरिक कार्यों की जांच या विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।दुनिया भर में प्रयोगशालाओं मानव मस्तिष्क के भीतर बुनियादी तंत्र का अध्ययन करने के लिए शुरू कर दिया है, और इन अंतर्दृष्टि दवा के विकास में सहायता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और हमारे प्रस्तावित तरीकों का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है ।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Oligomeric β-amyloid की तैयारी<sub1-42> Hippocampal स्लाइसें और synaptic plasticity हानि की प्रेरण

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

चूहे और ट्रांसजेनिक चूहों से एजिंग और Amyloid पैथोलॉजी के दौरान Synaptic बदलाव के अध्ययन के लिए तीव्र hippocampal स्लाइस की तैयारी

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

कैल्शियम इमेजिंग के लिए तीव्र subventricular क्षेत्र स्लाइस की तैयारी

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

तीव्र hippocampal स्लाइस में Synaptically पैदा Astroglial और neuronal प्रतिक्रियाएँ की दोहरी electrophysiological रिकॉर्डिंग

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

दीर्घकालिक potentiation की एक बहुत ही स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रिकॉर्डिंग के लिए बेहतर तैयारी और hippocampal माउस स्लाइस का संरक्षण

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Organotypic hippocampal स्लाइस में बनती पूरे सेल रिकॉर्डिंग

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें में neuronal microcircuits के electrophysiological और morphological विशेषता बनती पैच दबाना रिकॉर्डिंग का उपयोग

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

कृन्तकों से तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस का उपयोग Synaptic टैगिंग / कैद और क्रॉस-कब्जा की जांच

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

एक अनुकूलित N-मिथाइल-D-glucamine सुरक्षात्मक वसूली विधि का उपयोग कर तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Electrophysiological अध्ययन के लिए वयस्क माउस रेटिना की क्षैतिज स्लाइस की तैयारी

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...