Name: preparation of small rna libraries for sequencing from early mouse embryos
Uploaded: 2020-10-09T13:30:00
Duration: 8 min 37 s
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इस परियोजना को एंड्रयू मैकडोनोफ बी + फाउंडेशन और एनआईएच (R01-HD099252, R01-HD098131 द्वारा समर्थित किया गया था।   आर.जेपी कैंसर रिसर्च (RR150106) में एक CPRIT विद्वान और कैंसर अनुसंधान (वी फाउंडेशन) में वी विद्वान है। <span style="border-width: 1pt; border-style: none; border-color: windowtext; padding: 0in; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">लेखक इस परियोजना के लिए आवश्यक उपकरण उपलब्ध कराने के लिए बीसीएम में साइटोमेट्री और सेल सॉर्टिंग कोर को भी स्वीकार करना चाहेंगे।

<ol>
	<li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation.">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 557-568 (2008).</li><li>Abrahante, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+hunchback-like+gene+lin-57/hbl-1+controls+developmental+time+and+is+regulated+by+microRNAs.">The Caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs.</a> Developmental Cell. 4 (5), 625-637 (2003).</li><li>Lin, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C+elegans+hunchback+homolog,+hbl-1,+controls+temporal+patterning+and+is+a+probable+microRNA+target.">The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target.</a> Developmental Cell. 4 (5), 639-650 (2003).</li><li>Reinhart, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+21-nucleotide+let-7+RNA+regulates+developmental+timing+in+Caenorhabditis+elegans.">The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 403 (6772), 901 (2000).</li><li>Slack, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lin-41+RBCC+gene+acts+in+the+C.+elegans+heterochronic+pathway+between+the+let-7+regulatory+RNA+and+the+LIN-29+transcription+factor.">The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor.</a> Molecular Cell. 5 (4), 659-669 (2000).</li><li>Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+microRNA+let-7+binds+to+imperfect+let-7+complementary+sites+from+the+lin-41+3'UTR.">The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR.</a> Genes &amp; Development. 18 (2), 132-137 (2004).</li><li>Ventura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+reveals+essential+and+overlapping+functions+of+the+miR-17+92+family+of+miRNA+clusters.">Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 92 family of miRNA clusters.</a> Cell. 132 (5), 875-886 (2008).</li><li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Mirn140+modulates+Pdgf+signaling+during+palatogenesis.">MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis.</a> Nature Genetics. 40 (3), 290 (2008).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+small+RNAome+during+the+early+stage+of+cardiac+differentiation+from+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Dynamic regulation of small RNAome during the early stage of cardiac differentiation from pluripotent embryonic stem cells.</a> Genomics Data. 12, 136-145 (2017).</li><li>Chugh, P., Dittmer, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+pitfalls+in+microRNA+profiling.">Potential pitfalls in microRNA profiling.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 3 (5), 601-616 (2012).</li><li>Werber, M., Wittler, L., Timmermann, B., Grote, P., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tissue-specific+transcriptomic+landscape+of+the+mid-gestational+mouse+embryo.">The tissue-specific transcriptomic landscape of the mid-gestational mouse embryo.</a> Development. 141 (11), 2325-2330 (2014).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+sequencing+reveals+dynamic+modifications+and+activities+of+small+RNAs+in+mouse+oocytes+and+early+embryos.">Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos.</a> Science Advances. 2, (2016).</li><li>Ohnishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+class+transition+from+siRNA/piRNA+to+miRNA+during+pre-implantation+mouse+development.">Small RNA class transition from siRNA/piRNA to miRNA during pre-implantation mouse development.</a> Nucleic Acids Research. 38 (15), 5141-5151 (2010).</li><li>Loontiens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+high-quality+RNA+from+a+small+number+of+fluorescence+activated+cell+sorted+zebrafish+cells+for+RNA+sequencing+purposes.">Purification of high-quality RNA from a small number of fluorescence activated cell sorted zebrafish cells for RNA sequencing purposes.</a> BMC Genomics. 20 (1), 228 (2019).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

विकासात्मक प्रक्रियाएं तेजी से आगे बढ़ सकती हैं, और कोशिकाएं कई अनुक्रमिक विनिर्देशों से गुजर रही हैं जैसे कि प्रारंभिक भाग्य निर्णयों में योगदान देने वाले मिरनास के व्यापक दृष्टिकोण को पकड़ने के लिए, व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले आधे दिन की वेतन वृद्धि की तुलना में अधिक विशिष्ट मंचन की आवश्यकता है। हाल ही में हुए एक अध्ययन में थेलर स्टेज 12 भ्रूणों से आरएनए अनुक्रमण किया गया है जो 3 से 6 सोमाइट्स11तक है । हम पाते हैं कि इस अवधि के दौरान, तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं को निर्दिष्ट किया जाता है (उम्र के 3 सोमेट्स), डेलामिनेट (उम्र के 4 सोमाइट्स), और माइग्रेट (उम्र के 5-6 सोमाइट्स)। हम यह भी पाते है कि क्रे-ड्राइवर के अलावा वंश का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया सेल आबादी, उंर जैविक नमूनों के बीच भिन्नता का सबसे बड़ा स्रोत है, और केवल somite मिलान भ्रूण प्रतिकृति के रूप में माना जाना चाहिए । ट्रांसजेनिक भ्रूण की तुलना वाइल्डटाइप कंट्रोल से करते समय इस पर भी ध्यान दिया जाना चाहिए ।
प्रारंभिक विकास के दौरान मीनएनए को प्रोफाइल करने के पिछले तरीकों ने छोटे आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालय तैयार करने के लिए आरएनए इनपुट के 10-100 एनजी के बीच उपयोग किया है और एक नमूना13,,14में कई भ्रूणों को एकत्र किया है। हम एक ही E7.5 भ्रूण से या E8.5 और E9.5 पर सॉर्ट तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं से इनपुट के रूप में कुल आरएनए के लगभग १०० एनजी का उपयोग कर आरएनए अलगाव और पुस्तकालय की तैयारी का प्रदर्शन करते हैं । जब छंटाई के लिए भ्रूण अलग, एक माइक्रोस्कोप के तहत वियोजन देखने के लिए और प्रतिक्रिया बुझाने के लिए निरीक्षण जब एकल कोशिकाओं को प्राप्त कर रहे है ध्यान रखना चाहिए । हम पाते हैं कि E8.5-E9.5 भ्रूण के कपाल क्षेत्र का वियोजन प्रोटोकॉल में वर्णित कोमल मैनुअल पिपटिंग के साथ लगभग तुरंत है। बड़े ऊतकों और तेजी से पुराने भ्रूण के लिए, वियोजन समय भ्रूण के हिस्से के आधार पर अब हो सकता है अलग किया जा रहा है । E7.5-E9.5 भ्रूण के लिए, कोशिकाओं के झुरमुट माइक्रोस्कोप के नीचे आसानी से दिखाई दे रहे हैं और वियोजन तब तक जारी रहना चाहिए जब तक कि कोई और झुरमुट दिखाई न दे। यदि आप 5-10x से कहीं भी समाधान के माध्यम से ध्यान केंद्रित करते हैं तो एकल कोशिकाएं समाधान में दिखाई देती हैं। पिछले तरीकों कोशिकाओं की एक कम संख्या से थोक आरएनए प्रस्तुत करने के लिए आरएनए अनुक्रमण के लिए सीधे लाइसिस बफर में कोशिकाओंतरह 14। यहां हम सीधे आरएनए निष्कर्षण लाइसिस समाधान में सॉर्ट करते हैं ताकि आरएनए को पुस्तकालय की तैयारी शुरू होने से पहले अलग किया जा सके। 11 माइक्रोन एल्यूशन वॉल्यूम के साथ मिनी कॉलम का उपयोग उच्च पर्याप्त आरएनए एकाग्रता के लिए अनुमति देता है ताकि एक भी आरएनए प्रेप को छोटे आरएनए और बल्क आरएनए अनुक्रमण के बीच विभाजित किया जा सके।
सबसे छोटे आरएनए अनुक्रमण विधियों की एक वर्तमान सीमा परिवर्तित सीडीएनए की पीसीआर प्रवर्धन है। हमारी विधि इस सीमा को दूर नहीं करती है, लेकिन हम पीसीआर चक्रों की संख्या को 25-अधिकतम अनुशंसित से 16 चक्रों तक कम करने में सक्षम थे। प्रवर्धन में यह कमी पीसीआर द्वारा शुरू किए गए कृत्रिम प्रवर्धन पूर्वाग्रह को कम कर देती है। पूर्वाग्रह का एक अन्य स्रोत एडाप्टर का बंधन है, जहां यह ज्ञात है कि एडाप्टर और मीन्राए के सिरों पर स्थित विशिष्ट दृश्य अन्य दृश्यों की तुलना में अधिक दक्षता के साथ एक साथ लिगेट कर सकते हैं। इससे बचने के लिए, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एडाप्टर में लिगाशन प्रतिक्रियाओं में पूर्वाग्रह को रोकने के लिए प्रत्येक एडाप्टर के अंत में 4 यादृच्छिक कुर्सियां शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, एक और आम मुद्दा एडाप्टर डिमर्स की मात्रा है जो आरएनए इनपुट कम होने पर बनती है। पुस्तकालय तैयारी किट में एडाप्टर डिमर गठन को कम करने के कदम शामिल हैं जैसे एडाप्टर निष्क्रियता और प्रत्येक लिगामेंट के बाद अतिरिक्त एडाप्टर को हटाने के लिए मनका सफाई। हमने 3 ' और 5 ' 4N एडाप्टर को 1/4 से पतला कर दिया ताकि एडाप्टर डाइमर की मात्रा को कम किया जा सके । हमने पाया कि जब पतला नहीं, १३० बीपी बैंड तीव्रता यह मुश्किल एक जेल पर वांछित छोटे आरएनए पुस्तकालयों युक्त १५० बीपी बैंड से अलग करने के लिए बना रही है ।
अनुक्रमण पुस्तकालयों को तैयार करने की एक और वर्तमान चुनौती अनुक्रमण से पहले उत्पाद का सटीक मात्राकरण है। हमने पाया है कि विभिन्न तरीकों से एक ही पुस्तकालय पर अलग-अलग परिणाम मिलते हैं। हमारा सुझाव है कि शोधकर्ता एकाग्रता का सटीक अनुमान प्राप्त करने के लिए परिमाणीकरण के कई तरीकों का उपयोग करते हैं।
इस प्रोटोकॉल को आनुवंशिक, विकासात्मक अध्ययनों या अन्य अनुप्रयोगों पर व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है जहां आरएनए को कम संख्या में कोशिकाओं से काटा जा रहा है। यह दृष्टिकोण भ्रूण के पूलिंग से बचने के द्वारा लौकिक अध्ययन को सरल बनाता है और आसानी से गैर-सॉर्ट और सॉर्ट कोशिकाओं दोनों पर लागू किया जा सकता है।

विकासात्मक जीव विज्ञान का एक केंद्रीय प्रश्न यह है कि कैसे एक भी अविभेदित कोशिका कई जटिल कोशिका प्रकारों के साथ एक पूरे जीव को जन्म दे सकती है। भ्रूणजीन के दौरान, कोशिकाओं की विकासात्मक क्षमता उत्तरोत्तर प्रतिबंधित हो जाती है क्योंकि जीव विकसित होता है। एक उदाहरण तंत्रिका क्रेस्ट वंश है, जो उत्तरोत्तर एक बहुपेंट सेल आबादी से विभिन्न टर्मिनल डेरिवेटिव में अलग करता है, जैसे परिधीय न्यूरॉन्स, ग्लिया, कपाल हड्डी और उपास्थि। तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं को गैस्ट्रेशन के दौरान एकोडोडर्म से निर्दिष्ट किया जाता है और फिर मेसेंकिमल संक्रमण के लिए एक एपीथेलियल से गुजरना पड़ता है और भ्रूण के माध्यम से पूरे शरीर में असतत स्थानों पर स्थानांतरित हो जाता है जहां वे मरणासन्न अंतरकरेंगे 1। काम के दशकों में एक प्रतिलेखन जीन नियामक नेटवर्क का पर्दाफाश किया है, लेकिन अभी तक कम के बाद ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन है कि तंत्रिका शिखा विकास के समय को नियंत्रित करने के तंत्र के बारे में जाना जाता है ।
पिछले कार्य से पता चलता है कि माइक्रोआरएनए (एमआईआरएन) उचित विकासात्मक समय और कोशिका भाग्य निर्णयों के लिए जीन अभिव्यक्ति का दमन करता है2,3,4,5,,6. तंत्रिका शिखा विकास में मिरनस के अध्ययन काफी हद तक क्रैनियोफेशियल विकास के बाद के चरणों पर केंद्रित हैं। उदाहरण के लिए, माउस और जेब्राफिश में क्रैनियोफेशियल विकास के दौरान पैलेटोजेनेसिस के लिए एमआईआर-17 ~ 92 और एमआईआर-140 क्रमशः7,,8हैं। भ्रूण के शुरुआती तंत्रिका शिखा भाग्य निर्णयों में मिर्ना के योगदान की पूरी तरह से जांच नहीं की गई है । प्रारंभिक भाग्य निर्णयों में miRNAs के अध्ययन तकनीकी चुनौतियों जैसे कम सेल संख्या जल्दी भ्रूण में मौजूद द्वारा सीमित किया गया है ।
MiRNAs को प्रारंभिक माउस विकास9मॉडल के लिए विभेदन के विभिन्न चरणों में भ्रूणीय निकायों का उपयोग करके सेल लाइनों से विट्रो में प्रोफाइल किया गया है। प्रारंभिक स्तनधारी विकास के दौरान वीवो में छोटे आरएनए की जांच अपेक्षाकृत सीमित रही है । मियार्ना को प्रोफाइल करने के पिछले तरीकों ने पूर्वाग्रह का नेतृत्व किया है क्योंकि क्यूपीसीआर, माइक्रोएरे और उत्तरी ब्लॉट्स10जैसे तरीकों में एक विशिष्ट मिरना की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए एक ज्ञात अनुक्रम का उपयोग किया जाता है। अगली पीढ़ी अनुक्रमण और कभी आणविक उपकरणों में सुधार अब जल्दी स्तनधारी विकास और सेल भाग्य निर्णयों के लिए उनके योगदान का अध्ययन करने के लिए miRNA अभिव्यक्ति के अपेक्षाकृत निष्पक्ष विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं ।
यहां, हम बोई फसल और अनुक्रम छोटे आरएनए को बुजेजनेसिस (E9.5) की शुरुआत तक गैस्ट्रुलेशन (E7.5) में फैले शुरुआती माउस भ्रूण से तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं में व्यक्त करने के लिए एक तकनीक की रिपोर्ट करते हैं। यह तकनीक सीधी है और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए कोशिकाओं की एक न्यूनतम संख्या से छोटे आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों को तैयार करने के लिए वंश ट्रेसिंग, सेल छंटाई, और जेल आधारित आकार चयन को जोड़ती है। हम प्रारंभिक विकास के तेजी से परिवर्तन के दौरान miRNAs के एक व्यापक दृश्य प्राप्त करने के लिए 6 घंटे के समय अंतराल को हल करने के लिए भ्रूण के सख्त somite मंच मिलान के लिए महत्व पर प्रकाश डाला । इस विधि को व्यापक रूप से आनुवंशिक और विकासात्मक अध्ययनों के लिए लागू किया जा सकता है और भ्रूण के पूलिंग से बचा जाता है। हम जेल आधारित शुद्धिकरण, पुस्तकालय मात्राकरण का उपयोग करके मिरना संवर्धन जैसी वर्तमान तरीकों की चुनौतियों से उबरने के तरीके का वर्णन करते हैं, और पीसीआर से शुरू किए गए पूर्वाग्रह को कम करते हैं। इस विधि का उपयोग समय के साथ मिरना अभिव्यक्ति पैटर्न की पहचान करने के लिए किया गया है ताकि यह अध्ययन किया जा सके कि मिरनास माउस भ्रूण के तंत्रिका क्रेस्ट वंश में विकासात्मक समय को कैसे नियंत्रित करता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 Forceps Fine Science Tools</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9277114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Miilapore Sigma</td>
			<td>I9516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 &#181;L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3450047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5200 Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>M5310AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSS9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>bdbiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gendepot</td>
			<td>CA008-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Pure, 200 proof anhydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-404-2001</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-404-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS NGS Fragment kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-474-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-472-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1289113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-404-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS Fragment kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-473-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK003176</td>
			<td>resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol LS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UVP95044701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9609583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of small rna libraries for sequencing from early mouse embryos

माइक्रोआरएनए (miRNAs) सेल भाग्य निर्णयों और विकास के समय के जटिल विनियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं। प्रारंभिक विकास के दौरान मीनरना के योगदान के वीवो अध्ययन में सीमित सेल संख्या के कारण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं। इसके अलावा, कई दृष्टिकोणों को उत्तरी ब्लॉटिंग, माइक्रोएरी और क्यूपीसीआर जैसे परखों में परिभाषित करने के लिए ब्याज के मिरना की आवश्यकता होती है। इसलिए, प्रारंभिक विकास के दौरान कई मीन्रानों और उनके आइसोफॉर्म की अभिव्यक्ति का अध्ययन नहीं किया गया है। यहां, हम प्रारंभिक माउस भ्रूण से सॉर्ट कोशिकाओं के छोटे आरएनए अनुक्रमण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं ताकि तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं की प्रारंभिक आबादी में मिरनास की अपेक्षाकृत निष्पक्ष प्रोफाइलिंग को सक्षम किया जा सके। हम प्रवर्धन और जेल आधारित शुद्धिकरण का उपयोग कर पुस्तकालय तैयारी के दौरान कम सेल इनपुट और आकार चयन की चुनौतियों को दूर करते हैं। हम प्रतिकृति और मंच मिलान माउस भ्रूण के बीच भिन्नता के लिए एक चर लेखांकन के रूप में भ्रूण की पहचान जैविक प्रतिकृति में सही प्रोफ़ाइल miRNAs के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । हमारे परिणाम बताते हैं कि इस विधि को कोशिकाओं के अन्य वंशों से मीनरना की अभिव्यक्ति को प्रोफ़ाइल करने के लिए मोटे तौर पर लागू किया जा सकता है। संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे miRNAs प्रारंभिक माउस भ्रूण के विभिन्न सेल वंश में विकास कार्यक्रमों को विनियमित करते हैं।

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Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

हम जल्दी माउस भ्रूण में microRNAs प्रोफाइलिंग के लिए एक तकनीक का वर्णन । यह प्रोटोकॉल कम सेल इनपुट और छोटे आरएनए संवर्धन की चुनौती पर काबू पा रहा है। इस परख का उपयोग प्रारंभिक माउस भ्रूण के विभिन्न सेल वंश में समय के साथ मिरना अभिव्यक्ति में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।

प्रारंभिक माउस भ्रूण से अनुक्रमण के लिए छोटे आरएनए पुस्तकालयों की तैयारी

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य भ्रूण के विकास को विनियमित करने वाले माइक्रोआरएनए को सही ढंग से प्रोफाइल करने के लिए शुरुआती भ्रूण से कम इनपुट, छोटे आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों की तैयारी को सरल बनाना है। इस तकनीक का लाभ यह है कि यह कम इनपुट नमूनों की पूलिंग से बचा जाता है और आसानी से गैर-छांट और क्रमबद्ध कोशिकाओं दोनों पर लागू किया जा सकता है। हम प्रतिकृति के बीच वेरिएंट से बचने के लिए सावधान भ्रूण मचान भी प्रदर्शित करते हैं।इस विधि को लौकिक, आनुवंशिक और विकासात्मक अध्ययन या अन्य अनुप्रयोगों पर लागू किया जा सकता है जहां इनपुट आरएनए सांद्रता कम है। भविष्य में, इस विधि का उपयोग संभावित रूप से विकासात्मक विकारों का निदान करने के लिए किया जा सकता है जिसमें माइक्रोआरएनए को डिमीवेट किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का सबसे तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हिस्सा भ्रूण विच्छेदन है।क्योंकि प्रत्येक भ्रूण को विच्छेदन किया जाना चाहिए, मंच, छवि, और फिर सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए जल्दी से अलग किया जाना चाहिए। भ्रूण को विच्छेदन करने के लिए, पीबीएस के साथ एक गर्भवती मादा माउस के गर्भाशय को कुल्ला करें और इसे बाँझ प्लास्टिक 10 सेंटीमीटर डिश में रखें। क्षेत्र वाले डिकिडुआ को अलग करने के लिए माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करें और सभी डेसिडुआ को बेनकाब करने के लिए गर्भाशय की मांसपेशी को छील दें।भ्रूण को विच्छेदन करने के लिए, पीबीएस के साथ एक गर्भवती मादा माउस के गर्भाशय को कुल्ला करें और इसे बाँझ प्लास्टिक 10 सेंटीमीटर डिश में रखें। क्षेत्र वाले डिसिडुआ को अलग करने के लिए माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करें। सभी भ्रूण को स्वच्छ पीबीएस के साथ एक नई डिश में ले जाएं और पूरे कूड़े की एक छवि लें।फिर प्रत्येक भ्रूण को व्यक्तिगत रूप से छवि करें, और प्रयोगों के बीच आवर्धन और एक्सपोजर को स्थिर रखते हुए, सोमाइट्स की संख्या की गणना करें। E8.0 से पुराने भ्रूण के लिए, बस otic placode के ऊपर decapitate और एक ४८ अच्छी तरह से थाली के एक साफ अच्छी तरह से सिर हस्तांतरण । कुएं में पापिन के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें।झुरमुटों की जांच करने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और एक एकल सेल निलंबन प्राप्त होने तक ऊपर और नीचे पाइपिंग जारी रखें। फिर कोशिकाओं में एफबीएस के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें और 35 माइक्रोमीटर नायलॉन जाल फिल्टर के माध्यम से निलंबन के 500 माइक्रोलीटर को फ़िल्टर करें। फिल्ट्रेट को एक नई 1.5 मिलीलीटर ट्यूब पर ले जाएं और इसे पांच मिनट के लिए 200 x ग्राम पर नीचे स्पिन करें।सुपरनेट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें, और बीएसए के साथ पीबीएस के 300 माइक्रोलीटर में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। जब एक फिल्टर कैप ट्यूब के माध्यम से फिर से कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए तैयार है और दाग लाइव कोशिकाओं के लिए DAPI जोड़ें । आरएनए निष्कर्षण लाइसिस समाधान के 500 माइक्रोलीटर में प्रत्येक नमूना सॉर्ट करने के लिए 70 माइक्रोमीटर नोजल के साथ एक सेल सॉर्टर का उपयोग करें, फिर नमूने को नकारात्मक 80 डिग्री सेल्सियस पर मिलाएं और स्टोर करें।प्रत्येक नमूने में 6X लोडिंग डाई के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मिलाएं। नमूनों को 6% TBE पॉलीएक्रेलैमाइड जेल पर लोड करें जो पहले कुएं में उत्तरार्द्ध से शुरू होता है और प्रत्येक नमूने के बीच एक लेन छोड़ता है। 0.5X TBE रनिंग बफर में 30 से 40 मिनट के लिए 150 वोल्ट पर जेल चलाएं।जब जेल चल रहा है, ध्यान से इसे कांच की प्लेटों से हटा दें और इसे अपनी मूल पैकेजिंग से ट्रे में रखें, अभिविन्यास को ध्यान में रखते हुए। चल रहे बफर को हटा दें और 15 मिनट के लिए जेल दाग। और फिर यह एक यूवी ट्रांस प्रकाशक पर छवि।150 बेस जोड़े पर बैंड की पहचान करें और इसे उत्पादित करने के लिए एक साफ रेजर ब्लेड का उपयोग करें। 130 बेस जोड़े पर एडाप्टर डिमर उत्पाद से बचना सुनिश्चित करना। जेल स्लाइस को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में डालें और उन्हें अधिकतम गति से 30 सेकंड के लिए नीचे स्पिन करें।इसके बाद, जेल के टुकड़े को सबसे छोटे बिट्स में कुचलने और ट्यूब में टिप को बाहर निकालने के लिए P200 टिप का उपयोग करें। प्रत्येक ट्यूब में एल्यूशन बफर के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें, जेल बिट्स को साइड से धोएं। पिपेट टिप को फिर से संलग्न करें और इसे ट्यूब से हटाने से पहले धो लें।1, 000 आरपीएम मिलाते हुए 25 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूनों को इनक्यूबेट करें। अगले दिन, उन्हें 10 मिनट के लिए अधिकतम गति से नीचे स्पिन और एक RNase मुक्त ९६-अच्छी तरह से थाली के लिए supernatant हस्तांतरण । मिश्रण करने के लिए प्रत्येक नमूना और पिपेट में सफाई मोतियों के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें।फिर आइसोप्रोपैनॉल के 350 माइक्रोलीटर जोड़ें, नमूना मिलाएं और कमाल करते समय 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, प्लेट को स्पिन करें और इसे दो मिनट के लिए चुंबकीय करें। सुपरनेट को छोड़ दें और 30 सेकंड के लिए 80% इथेनॉल के 950 माइक्रोलीटर के साथ मोतियों को धोएं।नमूना को तीन मिनट के लिए सुखा लें, फिर कुएं के नीचे सभी अवशिष्ट तरल को हटा दें। प्लेट को मैग्नेटिक स्टैंड से हटा दें। और रीसस्पेन बफर के 13 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से खर्च करें।प्लेट को दो मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, फिर इसे तीन मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड पर वापस स्थानांतरित करें। सुपरनेट के 12 माइक्रोलीटर को एक साफ ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे रात भर चार डिग्री सेल्सियस या दीर्घकालिक नकारात्मक 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। E7.5, E8.5, और E9.5 पर भ्रूण काटा गया ।और सोमाइट ने छह घंटे के समय के अंतराल को हल करने के लिए मंचन किया । जब सिद्धांत घटक विश्लेषण समानता के आधार पर नमूनों समूह के लिए इस्तेमाल किया गया था, यह पाया गया कि नमूने उंर के अनुसार क्लस्टर । प्रीमिगेटरी और प्रवासी तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं को लेबल किया गया था कि Wnt1-Cre के साथ E8.5 और Sox10-Cre के साथ एक E9.5।दो सीआरई ड्राइवरों की तुलना इस बात की पुष्टि करती है कि वे शुरुआती माउस भ्रूण में विभिन्न आबादी को चिह्नित करते हैं। आरएनए को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस के साथ निर्धारित किया गया था। जबकि स्पेक्ट्रोफोटोमीटर ट्रेस से पता चला है कि आरएनए में कोई दूषित प्रोटीन और एक उच्च कोशिका एकाग्रता शामिल नहीं है, यह उम्र के साथ आरएनए एकाग्रता में परिवर्तन का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं था ।केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस ट्रेस का उपयोग आरएनए टुकड़ों की एकाग्रता और आकार का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। 2, 000 और 5 पर चोटियों, 100 न्यूक्लियोटाइड क्रमशः 18S और 28S रिबोसोमल आरएनए हैं। जबकि छोटा आरएनए क्षेत्र लगभग 150 न्यूक्लियोटाइड्स पर स्थित है।जेल निष्कर्षण का उपयोग एडाप्टर प्राइमर से दूर छोटे आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों को अलग करने के लिए किया जा सकता है। एक्सिशन से पहले, प्रत्येक नमूने में उत्पाद आकारों की एक भीड़ मौजूद होती है। आकार चयन से पहले और बाद में केशिलरी इलेक्ट्रोफोरेसिस निशान जेल शुद्धिकरण के बाद 150 बेस पेयर लाइब्रेरी उत्पाद की शुद्धता में सुधार दिखाते हैं।हमने इस प्रोटोकॉल को एक नमूने से एक आरएनए प्रेप को एक छोटे आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों और थोक एमआरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों में विभाजित करने के लिए डिज़ाइन किया है। यह न केवल माइक्रोआरएनए अभिव्यक्ति के आसपास के सवालों का समाधान करेगा, बल्कि यह भी कि किन एमआरएनए लक्ष्यों को व्यक्त माइक्रोआरएनए द्वारा विनियमित किया जा सकता है । इस तकनीक ने हमें सबसे उच्च व्यक्त माइक्रोआरएनए का व्यापक दृश्य प्राप्त करने और गैस्ट्रुलेशन और तंत्रिका ट्यूब बंद होने के बीच कपाल तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं में उनके लक्ष्यों के नियमन को प्राप्त करने में सक्षम बनाया।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

प्रारंभिक Postimplantation माउस भ्रूण में कोशिकाओं या डीएनए के ठीक स्थानीय स्थानांतरण के लिए तरीके

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माइक्रो-सीटी इमेजिंग के लिए वयस्क और प्रारंभिक प्रसवोत्तर माउस फेफड़ों की संवहनी कास्टिंग

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A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

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प्रारंभिक ड्रोसोफिला भ्रूण के भीतर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और आरएनए इन-सीटू वितरण के लिए एक प्रोटोकॉल

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

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जेब्राफिश भ्रूण से भोले ब्लास्टोडर्म एक्सप्लांट की पीढ़ी

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...