Name: preparation of small rna libraries for sequencing from early mouse embryos
Uploaded: 2020-10-09T13:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos at JoVE.com

Этот проект был поддержан Фондом Эндрю МакДоноу БЗ и NIH (R01-HD099252, R01-HD098131.   R.J.P. является стипендиатом CPRIT в области исследований рака (RR150106) и V Scholar in Cancer Research (V Foundation). <span style="border-width: 1pt; border-style: none; border-color: windowtext; padding: 0in; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">Авторы также хотели бы отметить цитометрию и ядро сортировки клеток в BCM за предоставление оборудования, необходимого для этого проекта.

<ol>
	<li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation.">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 557-568 (2008).</li><li>Abrahante, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+hunchback-like+gene+lin-57/hbl-1+controls+developmental+time+and+is+regulated+by+microRNAs.">The Caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs.</a> Developmental Cell. 4 (5), 625-637 (2003).</li><li>Lin, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C+elegans+hunchback+homolog,+hbl-1,+controls+temporal+patterning+and+is+a+probable+microRNA+target.">The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target.</a> Developmental Cell. 4 (5), 639-650 (2003).</li><li>Reinhart, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+21-nucleotide+let-7+RNA+regulates+developmental+timing+in+Caenorhabditis+elegans.">The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 403 (6772), 901 (2000).</li><li>Slack, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lin-41+RBCC+gene+acts+in+the+C.+elegans+heterochronic+pathway+between+the+let-7+regulatory+RNA+and+the+LIN-29+transcription+factor.">The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor.</a> Molecular Cell. 5 (4), 659-669 (2000).</li><li>Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+microRNA+let-7+binds+to+imperfect+let-7+complementary+sites+from+the+lin-41+3'UTR.">The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3'UTR.</a> Genes &amp; Development. 18 (2), 132-137 (2004).</li><li>Ventura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+reveals+essential+and+overlapping+functions+of+the+miR-17+92+family+of+miRNA+clusters.">Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 92 family of miRNA clusters.</a> Cell. 132 (5), 875-886 (2008).</li><li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Mirn140+modulates+Pdgf+signaling+during+palatogenesis.">MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis.</a> Nature Genetics. 40 (3), 290 (2008).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+small+RNAome+during+the+early+stage+of+cardiac+differentiation+from+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Dynamic regulation of small RNAome during the early stage of cardiac differentiation from pluripotent embryonic stem cells.</a> Genomics Data. 12, 136-145 (2017).</li><li>Chugh, P., Dittmer, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+pitfalls+in+microRNA+profiling.">Potential pitfalls in microRNA profiling.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 3 (5), 601-616 (2012).</li><li>Werber, M., Wittler, L., Timmermann, B., Grote, P., Herrmann, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tissue-specific+transcriptomic+landscape+of+the+mid-gestational+mouse+embryo.">The tissue-specific transcriptomic landscape of the mid-gestational mouse embryo.</a> Development. 141 (11), 2325-2330 (2014).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+sequencing+reveals+dynamic+modifications+and+activities+of+small+RNAs+in+mouse+oocytes+and+early+embryos.">Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos.</a> Science Advances. 2, (2016).</li><li>Ohnishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+class+transition+from+siRNA/piRNA+to+miRNA+during+pre-implantation+mouse+development.">Small RNA class transition from siRNA/piRNA to miRNA during pre-implantation mouse development.</a> Nucleic Acids Research. 38 (15), 5141-5151 (2010).</li><li>Loontiens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+high-quality+RNA+from+a+small+number+of+fluorescence+activated+cell+sorted+zebrafish+cells+for+RNA+sequencing+purposes.">Purification of high-quality RNA from a small number of fluorescence activated cell sorted zebrafish cells for RNA sequencing purposes.</a> BMC Genomics. 20 (1), 228 (2019).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Процессы развития могут происходить быстро, и клетки проходят много последовательных спецификаций, таких как, чтобы захватить всеобъемлющее представление о miRNAs способствует ранней судьбы решений, более конкретные постановки необходимо, чем широко используется полдня приращения. Недавнее исследование провело РНК секвенирования из Theiler этапе 12 эмбрионов, которые варьируются от 3 до 6 somites11. Мы находим, что в течение этого периода времени, нервные клетки гребня указаны (3 сомитов возраста), delaminate (4 сомитов возраста), и мигрировать (5-6 somites возраста). Мы также находим, что помимо Cre-драйвера, используемого для отслеживания популяций клеток, возраст является крупнейшим источником вариаций между биологическими образцами, и только сомитные эмбрионы должны рассматриваться как репликации. Это также следует принимать во внимание при сравнении трансгенных эмбрионов с контролем дикоготипа.
Предыдущие методы профиля miRNAs во время раннего развития использовали между 10-100 нг РНК ввода для небольшой РНК секвенирования библиотеки подготовки и объединили несколько эмбрионов водин образец 13,14. Мы демонстрируем изоляцию РНК и подготовку библиотеки от одного эмбриона E7.5 или от отсортированных нейронных клеток гребня на E8.5 и E9.5, используя приблизительно 100 нг общей РНК в качестве входного сигнала. При диссоциации эмбрионов для сортировки, следует позаботиться, чтобы наблюдать за диссоциацией под микроскопом и утолить реакцию наблюдать, когда одиночные клетки получены. Мы находим, что диссоциация черепной области эмбрионов E8.5-E9.5 почти мгновенно с нежным ручным пипетки, как описано в протоколе. Для больших тканей и все более старых эмбрионов время диссоциации может быть больше в зависимости от части диссоциации эмбриона. Для эмбрионов E7.5-E9.5 скопления клеток легко видны под микроскопом, и диссоциация должна продолжаться до тех пор, пока не будут видны больше сгустки. Одиночные ячейки видны в растворе, если вы отрегулируете фокус через раствор в вашем амо где угодно от 5-10x. Предыдущие методы сортировки ячеек непосредственно в буфер лиза для секвенирования РНК для подготовки объемных РНК из небольшого числа ячеек14. Здесь мы сортим непосредственно в растворе лиза извлечения РНК, так что РНК может быть изолирована до начала подготовки библиотеки. Использование мини-столбцов с объемом элюции 11 МКЛ позволило проработать достаточно высокую концентрацию РНК, так что одна РНК-подготовка могла быть разделена между небольшой РНК и секвенированием рнк навалом.
Одним из нынешних ограничений большинства малых методов секвенирования РНК является усиление ПЦР преобразованного кДНК. Наш метод не преодолевает это ограничение, но мы смогли свести к минимуму количество циклов ПЦР с 25-максимально рекомендованных до 16 циклов. Это сокращение усиления уменьшает искусственное усиление смещения, введенной ПЦР. Другим источником смещения является перевязка адаптеров, где известно, что конкретные последовательности, расположенные на концах адаптеров и miRNAs может ligate вместе с большей эффективностью, чем другие последовательности. Чтобы избежать этого, адаптеры, используемые в этом протоколе, имеют 4 случайные базы, включенные в конце каждого адаптера, чтобы предотвратить предвзятость в реакциях перевязки. Кроме того, другой распространенной проблемой является количество адаптерных димеров, которые образуются при низком входе РНК. Комплект подготовки библиотеки включает в себя шаги по сокращению образования адаптера димера, такие как инактивация адаптера и очистка бисера для удаления избыточных адаптеров после каждой перевязки. Мы также разбавили 3' и 5' 4N адаптеры на 1/4, чтобы уменьшить количество адаптера димер, который может образовываться. Мы обнаружили, что, когда не разбавленный, 130 bp интенсивность полосы увеличивается, что затрудняет отличить от 150 bp полоса, содержащая желаемые небольшие библиотеки РНК на гель.
Еще одной текущей проблемой подготовки библиотек секвенирования является точная количественная оценка продукта до секвенирования. Мы обнаружили, что различные методы дают различные результаты в одной библиотеке. Мы предлагаем исследователям использовать несколько методов количественной оценки, чтобы получить точную оценку концентрации.
Этот протокол может быть широко применен к генетическим исследованиям, исследованиям в области развития или другим приложениям, где РНК собирается из небольшого количества клеток. Этот подход упрощает височные исследования, избегая объединения эмбрионов и может быть легко применен как к не сортированы и отсортированы клетки.

Центральным вопросом биологии развития является то, как одна недифференцированная клетка может привести к развитию всего организма с многочисленными сложными типами клеток. Во время эмбриогенеза, потенциал развития клеток становится постепенно ограничен, как организм развивается. Одним из примеров является линия нервного гребня, которая постепенно отличается от многопотентной популяции клеток на различные производные терминала, такие как периферические нейроны, глиа, черепная кость и хрящ. Нейронные клетки гребня указаны от эктодерма во время гастрипуляции, а затем проходят эпителиальный мезенхимальный переход и мигрируют через эмбрион в дискретные места по всему телу, где они будут неизлечимодифференцировать 1. Десятилетия работы выявили транскрипционные гены нормативной сети, но гораздо меньше известно о механизмах пост-транскрипционные регулирования, которые контролируют сроки развития нервного гребня.
Предыдущая работа предполагает, что микроРНК (миРНК) подавляют экспрессию генов для правильного времени развитияи решения судьбы клеток 2,,3,,4,,5,,6. Исследования миРНК в развитии нервного гребня в значительной степени сосредоточены на более поздних стадиях черепно-мозгового развития. Например, miR-17-92 и miR-140 имеют решающее значение для небогенеза во время черепно-мозгового развития у мыши изебры, соответственно 7,8. Вклад миРНК в самые ранние решения судьбы нервного гребня эмбриона не был тщательно исследован. Исследования миРНК в ранних решениях судьбы были ограничены техническими проблемами, такими как низкое число клеток, присутствующих в ранних эмбрионах.
MiRNAs были профилированы в пробирке от клеточных линий с использованием эмбриональных тел на разных стадиях дифференциации для моделирования раннейразработки мыши 9. Исследование малых РНК in vivo во время раннего развития млекопитающих было относительно ограниченным. Предыдущие методы профиля miRNAs привели к предвзятости, как известная последовательность используется для анализа экспрессии конкретной миРНК в таких методах, как qPCR, microarrays, и северныепятна 10. Секвенирование следующего поколения и постоянно совершенствующиеся молекулярные инструменты теперь позволяют относительно объективному анализу экспрессии миРНК изучить их вклад в раннее развитие млекопитающих и решения судьбы клеток.
Здесь мы сообщаем о технике сбора и последовательности малых РНК, выраженных в нервных клетках гребня от ранних эмбрионов мыши, охватывающих гастрипуляцию (E7.5) до начала органогенеза (E9.5). Этот метод прост и сочетает в себе отслеживание линий, сортировку клеток и выбор размеров на основе геля для подготовки небольших библиотек секвенирования РНК из минимального количества ячеек для секвенирования следующего поколения. Мы подчеркиваем важность строгого сопоставления стадии сомитов эмбрионов для разрешения 6-часовых интервалов времени для получения всестороннего представления о миРНК во время быстрых изменений раннего развития. Этот метод может быть широко применен к генетическим исследованиям и исследованиям в области развития и позволяет избежать объединения эмбрионов. Мы описываем способ преодоления проблем, связанных с современными методами, такими как обогащение миРНК с помощью очистки на основе геля, библиотечной количественной оценки и минимизации предубеждений, связанных с ПЦР. Этот метод был использован для выявления моделей экспрессии miRNA с течением времени, чтобы изучить, как miRNAs контролировать время развития в нейронной линии гребня эмбрионов мыши.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 Forceps Fine Science Tools</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9277114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-202-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Miilapore Sigma</td>
			<td>I9516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 &#181;L</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>3450047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5200 Fragment Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>M5310AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>HSS9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>bdbiosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, fraction V</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gendepot</td>
			<td>CA008-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Pure, 200 proof anhydrous</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FC-404-2001</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-404-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS NGS Fragment kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-474-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-472-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1289113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-404-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS Fragment kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-473-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LK003176</td>
			<td>resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol LS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>UVP95044701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9609583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of small rna libraries for sequencing from early mouse embryos

МикроРНК (миРНК) имеют важное значение для комплексного регулирования решений судьбы клеток и сроков развития. In vivo исследования вклада miRNAs во время раннего развития являются технически сложными из-за ограничения числа клеток. Кроме того, многие подходы требуют, чтобы в таких анализах, как северная blotting, microarray и qPCR, была определена мирная РНК, представляющих интерес. Таким образом, выражение многих miRNAs и их изоформы не были изучены в начале развития. Здесь мы демонстрируем протокол для небольшого РНК-секвенирования отсортированных клеток ранних эмбрионов мышей, чтобы обеспечить относительно объективное профилирование миРНК в ранних популяциях нервных клеток гребня. Мы преодолеваем трудности низкого ввода клеток и выбора размеров во время подготовки библиотеки с использованием усиления и очистки на основе геля. Мы определяем эмбриональный возраст как переменную, учитывая различия между репликациями и сценическими эмбрионами мыши, которые должны использоваться для точного профиля миРНК в биологических репликациях. Наши результаты показывают, что этот метод может быть широко применен для профиля выражения miRNAs из других линий клеток. Таким образом, этот протокол может быть использован для изучения того, как миРНК регулируют программы развития в различных клеточных линиях раннего эмбриона мыши.

Используя продемонстрировав здесь процедуру, мы собрали эмбрионы на E7.5, E8.5 и E9.5. Внеэмбрионические структуры были удалены из всех эмбрионов, а затем эмбрионы были somite поставил решить 6-часовойинтервал времени (рисунок 1A-1B). Используя принципиальный анализ компонентов для группирования образцов на основе сходства, мы находим, что образцы кластера по возрасту, подчеркивая изменения в результате эмбрионального возраста и необходимость тщательного сопоставления сомита для биологических репликаций (Рисунок 1C). Мы профилированного плюрипотентного эпибласта на E7.5, линии прослеживается премьермигратурных и мигрирующих нейронных клеток гребня с помощью Wnt1-Cre на E8.5 и мигрирующих нейронных клеток гребня с использованием Sox10-Cre на E9.5 (Рисунок 1D). Здесь мы специально собираем черепный нервный гребень, обезглавливая эмбрион чуть выше otic placode. Сравнение двух Cre-драйверов (Wnt1 и Sox10), которые часто используются для обозначения нейронных клеток гребня подтверждает, что они отмечают различные популяции в ранних эмбрионах мыши(рисунок 1E). Стратегии Гэтинга использовались для получения живых одиночных положительных клеток RFP, которые сортируются непосредственно в растворе лиза извлечения РНК (см. таблицу материалов)и хранятся при -80 градусах по Цельсию(рисунок 1F). Важно отслеживать, сколько клеток было собрано из каждого образца.
Изоляция РНК была выполнена с использованием модифицированной версии протокола комплекта РНК. В частности, мы используем мини-столбцы РНК, которые должны храниться при 4 градусах Цельсия. Эти столбцы полезны для eluting в небольшом томе (11 йл) для получения максимально возможной концентрации РНК из образцов, где ввод клеток ограничивает. По этой же причине, важно, чтобы получить все aqueous фазы после извлечения фенола хлороформа. Медленный трубопровод и наклон трубки в одну сторону при сборе имеют решающее значение для максимизации урожайности. В этой процедуре, мы количественно РНК с помощью как спектрофотометр, чтобы получить информацию о соли / белкового загрязнения, и капиллярный электрофорез для измерения концентрации(рисунок 2). След спектрофотометра показывает, что РНК была изолирована без загрязняющих белков, но имеет высокое содержание соли(рисунок 2A-2B). В идеале соотношение 260/280 должно быть 1,8 евро, а соотношение 260/230 должно быть 2,0 евро. Общий выход РНК, измеряемый спектрофотометром, не увеличивается с возрастом между E8.5-E9.5. Это связано с разрешением спектрофотометра недостаточно чувствительны для обнаружения изменений концентрации РНК от количества клеток, которые мы собираем, и мы рекомендуем использовать информацию о концентрации, полученную из капиллярного электрофореза(рисунок 2C). След капиллярного электрофореза может быть использован для оценки концентрации и размера фрагментов РНК. Пики нуклеотидов lt;1000 свидетельствуют о деградации. Репрезентативный след согласуется с РНК, которая не деградирует. Пики в 2000 нуклеотидов и 5100 нуклеотидов 18s и 28s rRNA, соответственно. Небольшая область РНК расположена на уровне 150 нуклеотидов(рисунок 2D).
Небольшие библиотеки секвенирования РНК были подготовлены с использованием небольшой аптечки библиотеки РНК, описанной в таблице материалов. Здесь мы используем чуть менее половины РНК, полученной из каждой выборки (4 МКЛ из 11 ЭЛ элюция, 80-120 нг), что позволяет РНК-секвенирования библиотек, которые будут синтезированы из оставшейся РНК из каждого образца. Здесь мы разбавляем 3' и 5' небольшие РНК адаптеры 1/4, чтобы снизить количество адаптера димеры настоящее время и предположить, что адаптер перевязки, очистки и обратной транскрипции шаги завершены как можно больше в непрерывном порядке. Мы использовали 16 циклов ПЦР для усиления библиотек и предлагаем эмпирически определить минимальное количество циклов ПЦР для любого эксперимента. Заполнив избыточные циклы ПЦР, можно искусственно надуть количество читаемых низко выраженную миРНК.
Выбор размеров необходим для обогащения библиотек miRNAs, а не адаптер димеров, которые, как правило, присутствуют. Размер библиотечного продукта (150 б.п.) и адаптерных димеров (130 б.п.) очень похожи по размеру. Извлечение геля используется для изоляции небольших библиотек секвенирования РНК от адаптерных димеров(рисунок 3). Изображение геля PAGE перед иссечением показывает, что в каждом образце присутствует множество размеров продукта(рисунок 3A). Важно оставить одну полосу открытой между любыми двумя образцами или лестницей, которая загружается на гель. Миграционный фронт в нижней части геля слегка изогнут, что указывает на то, что бег на более низкой скорости может быть необходим, если полосу 150 bp трудно различить для всех образцов. Это репрезентативное изображение также показывает обилие 150 bp продукт от более высокой концентрации положительного контроля РНК (общая РНК из мозга крысы), которые пошли в библиотеку подготовки по сравнению с тем, который вошел в каждый эмбриональный образец. Отрицательный контроль показывает, что реагенты были свободны от загрязнения нуклеиновой кислоты видов(рисунок 3A). Иссечение полосы 150 bp должно быть сделано с чистым лезвием бритвы и область собрана показана на рисунке 3B. Капиллярные следы электрофореза до и после выбора размера показывают резкое улучшение чистоты библиотечного продукта 150 bp с очисткойгеля (рисунок 3C-3D). Важно отметить, что следы на рисунке 3C-3D имеют пики выборки выше маркеров, что свидетельствует о перегрузке. В этих случаях размер фрагментов может быть точным, однако концентрация не может. Количественная оценка может быть получена путем разбавления библиотек в диапазон маркеров или с использованием альтернативных методов. Мы находим некоторые различия в альтернативных методах количественной оценки библиотек и рекомендуем эмпирически протестировать несколько методов количественной оценки. Точная количественная оценка концентрации имеет важное значение при максимальном количестве образцов, которые должны быть секвенированы за один раз. Библиотеки будут разбавлены до 1,3 рМ для секвенирования и, как правило, в любом месте от 15-25 образцов могут быть секвенированы в одно время на 150 цикл последовательности комплект, который обеспечивает 140 миллионов фунтов стерлингов читает. Это приводит к примерно 5 миллионам считых данных на выборку. Как правило, картографические ставки находятся между 60-80%.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61086/61086fig01.jpg"> Рисунок 1: Сбор клеток из эмбрионов мыши для небольшого секвенирования РНК. (A) E8.5 эмбрион мыши, чтобы подчеркнуть удаление желточного мешка и сомитов, используемых для определения стадии эмбриона (B) Somite постановка эмбрионов мыши, чтобы захватить этапы развития нервного гребня (C) Принцип анализа компонентов библиотек, готовых от отсортированы клетки нервного гребня wildtype показывая, что образцы группы по возрасту ( D )Схемапоказывает, как образцы были собраны с помощью Wnt1-Cre на E8.5. для обозначения премьеры и мигрирующих нейронных клеток гребня и Sox10-Cre на E9.5 для обозначения только мигрирующих нейронных клеток гребня(E) Принцип анализа компонентов библиотек, готовых из отсортированных клеток нервного гребня дикого типа, показывающих образцы группы вместе Cre-driver независимо от возраста (F )Gatingстратегия, используемая для изоляции RFP' нейронных клеток гребня от E8.5 и E9.5 эмбрионов с использованием FACS сортировки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61086/61086fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61086/61086fig02.jpg"> Рисунок 2: ИЗОЛЯЦИя РНК от эмбрионов мыши E7.5-E9.5. (A)Представитель спектрофотометр след изоляции РНК от самой молодой стадии эмбриона, что мы применили этот протокол. (B)Таблица, показывающая репрезентативные значения качества РНК, полученные из спектрофотометра. (C)Пример РНК, собранной из отсортированных нервных клеток гребня изэмбрионов каждого возраста (D) Капиллярный электрофорез след, показывающий хорошее качество РНК. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61086/61086fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61086/61086fig03.jpg"> Рисунок 3: библиотеки miRNA до и после выбора размера. (A) TBE-PAGE гель, показывающий репрезентативные небольшие рнк библиотеки для четырех образцов и элементов управления до и (B) после 150 bp полосы иссечения. Стрелки представляют 150 bp полоса, которая будет вырезана ( C )Capillaryэлектрофорез след небольшой библиотеки РНК до и (D) после выбора размера. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61086/61086fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos at JoVE.com

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Мы описываем метод профилирования микроРНК в ранних эмбрионах мышей. Этот протокол преодолевает проблему низкого ввода клеток и небольшого обогащения РНК. Этот анализ может быть использован для анализа изменений экспрессии miRNA с течением времени в различных клеточных линиях раннего эмбриона мыши.

Подготовка малых РНК-библиотек для секвенирования ранних эмбрионов мыши

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Этот протокол направлен на упрощение подготовки библиотек с низким уровнем ввода, малых РНК-секвенирования от ранних эмбрионов до точного профиля микроРНК, которые регулируют эмбриональное развитие. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет избежать объединения низко входных образцов и может быть легко применен как к не отсортированным, так и к отсортированным ячейкам. Мы также демонстрируем тщательную постановку эмбрионов, чтобы избежать вариантов между репликациями.Этот метод может быть применен к височных, генетических и исследований в области развития или других приложений, где концентрации РНК ввода являются низкими. В будущем этот метод потенциально может быть использован для диагностики нарушений развития, при которых микроРНК регулируются дисрегией. Наиболее технически сложной частью этого протокола является вскрытие эмбриона.Потому что каждый эмбрион должен быть вскрыт, этап, изображение, а затем отмежеваться быстро, чтобы обеспечить жизнеспособность клеток. Чтобы вскрыть эмбрионы, промыть матку беременной самки мыши с помощью PBS и поместить его в стерильный пластик 10 сантиметров блюдо. Используйте ножницы микроперегибки, чтобы отделить decidua содержащие области и отслаить мышцы матки, чтобы разоблачить все decidua.Чтобы вскрыть эмбрионы, промыть матку беременной самки мыши с помощью PBS и поместить его в стерильный пластик 10 сантиметров блюдо. Используйте ножницы микропересмешки, чтобы отделить решающую область, содержащую. Переместите все эмбрионы в новое блюдо с чистым PBS и возьмите изображение всего помета.Затем изображение каждого эмбриона по отдельности, и подсчитать количество somites, сохраняя увеличение и воздействие постоянной между экспериментами. Для эмбрионов старше E8.0, обезглавить чуть выше otic placode и передать голову в чистый колодец 48-хорошо пластины. Добавьте 250 микролитров папаина в колодец и пипетки вверх и вниз осторожно.Используйте микроскоп, чтобы проверить на комки и продолжать трубопроводов вверх и вниз, пока одна подвеска ячейки не будет достигнута. Затем добавьте 250 микролитров FBS в клетки и процепив 500 микролитров подвески через 35-метровый нейлоновый сетчатый фильтр. Перемести фильтрат в новую 1,5 миллилитровую трубку и закрути ее на 200 х г в течение пяти минут.Перенесите супернатант в новую трубку и повторно нанесите клеточные гранулы в 300 микролитров PBS с BSA. Когда готовы сортировать фильтр клетки снова через трубку крышки фильтра и добавить DAPI для окрашивания живых клеток. Используйте сортер клеток с 70 микрометровым соплом, чтобы сортировать каждый образец в 500 микролитров раствора лиза извлечения РНК, затем смешать и хранить образец при отрицательных 80 градусах по Цельсию.Добавьте пять микролитров 6X погрузочного красителя к каждому образцу и перемешайте с помощью пипетки. Загрузите образцы на 6%TBE полиакриламидный гель, начиная с последнего в первой хорошо и оставляя одну полосу между каждым образцом. Запустите гель на 150 вольт в течение 30 до 40 минут в 0.5X TBE работает буфер.Когда гель закончит работать, осторожно снимите его со стеклянных пластин и поместите его в лоток из оригинальной упаковки, увековечив ориентацию. Удалите бегущий буфер и окрашиваете гель в течение 15 минут. А затем изображение его на УФ транс-иллюминатор.Определите полосу на 150 базовых пар и использовать чистый лезвие бритвы, чтобы акциз его. Убедившись, чтобы избежать адаптера димер продукт на 130 базовых пар. Положите ломтики геля в микроцентрифуг трубки и спина их вниз на максимальной скорости в течение 30 секунд.Затем используйте наконечник P200, чтобы раздавить ломтик геля на самые маленькие кусочки и выбросить кончик в трубку. Добавьте 300 микролитров буфера элюции в каждую трубку, стирая кусочки геля со стороны. Прикрепите кончик пипетки и смойте его перед удалением из трубки.Инкубировать образцы на ночь при 25 градусах по Цельсию с 1000 об /мин встряхивания. На следующий день, спина их вниз на максимальной скорости в течение 10 минут и передачи supernatant на RNase-бесплатно 96-хорошо пластины. Добавьте 50 микролитров бус для очистки в каждый образец и пипетку для смешивания.Затем добавьте 350 микролитров изопропанола, смешайте образец и инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 10 минут во время качания. После инкубации, потяните спина пластины и намагничить его в течение двух минут. Откажитесь от супернатанта и помойте бисер 950 микролитров 80%этанола в течение 30 секунд.Высушите образец в течение трех минут, затем удалите всю остаточную жидкость на дне хорошо. Снимите пластину с магнитного стенда. И повторно посовещение бисера в 13 микролитров буфера повторного незаменимия.Инкубировать пластину в течение двух минут, а затем передать его обратно на магнитный стенд в течение трех минут. Перенесите 12 микролитров супернатанта в чистую трубку и храните его на ночь при четырех градусах Цельсия или в долгосрочной перспективе при отрицательных 20 градусах по Цельсию. Эмбрионы на E7.5, E8.5 и E9.5 были собраны.И somite поставил решить шестичасовые интервалы времени. Когда анализ принципиальных компонентов использовался для группы образцов на основе сходства, было установлено, что образцы группируются по возрасту. Premigratory и мигрирующие нервные клетки гребня были обозначены то E8.5 с Wnt1-Cre и E9.5 с Sox10-Cre.Сравнение двух драйверов CRE подтверждает, что они отмечают различные популяции в ранних эмбрионах мыши. РНК была количественно с спектрофотометром и капиллярным электрофорезом. Хотя спектрофотометр след показал, что РНК не содержит загрязняющих белков и высокой концентрации клеток, он не был достаточно чувствительным, чтобы обнаружить изменения в концентрации РНК с возрастом.След капиллярного электрофореза может быть использован для оценки концентрации и размера фрагментов РНК. Пики на 2000 и 5, 100 нуклеотидов 18S и 28S рибосомной РНК, соответственно. В то время как небольшой регион РНК находится на уровне около 150 нуклеотидов.Извлечение геля может быть использовано для изоляции небольших библиотек секвенирования РНК от праймеров адаптера. Перед иссечением в каждом образце присутствует множество размеров продукта. Капиллярные следы электрофореза до и после выбора размера показывают улучшение чистоты 150 базовых пар библиотечного продукта после очистки геля.Мы разработали этот протокол, чтобы разделить подготовку РНК из одного образца как в небольшие библиотеки секвенирования РНК, так и в библиотеки последовательности мРНК. Это позволит решить вопросы, связанные не только с выражением микроРНК, но и с тем, какие цели мРНК могут регулироваться выраженными микроРНК. Этот метод позволил нам получить полное представление о наиболее высоко выраженных микроРНК и регуляции их целей в черепных нервных клетках гребня между гастрипуляцией и закрытием нервной трубки.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Методы Именно локализованного передачи ячеек или ДНК в начале постимплантационных эмбрионов мыши

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Убыт- и Gain-оф-функции подход к расследованию Early Cell Судьба определителям предимплантационной эмбрионов мыши

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Транскриптом профилирование<em&gt; In-Vivo</em&gt; Производимые Бычьи Эмбрионы предимплантационной Использование Двухцветный Microarray платформы

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Дифференцирование линий стволовых клеток мыши Предимплантационная эмбрионов

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

Роман использования трехмерного УЗИ высокой частоты для ранней беременности характеристика в мышь

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Визуализация сотовой электрической активности в Zebrafish ранних эмбрионов и опухоли

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Сосудистый литье взрослых и ранних постнатальных легких мыши для micro-CT изображений

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Протокол иммуногистохимии и распределения РНК in-situ в раннем эмбрионе дрозофилы

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Generation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Поколение наивных эксплантов Бластодерм из эмбрионов рыбок данио

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...