Name: multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment
Uploaded: 2020-05-06T13:30:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتور ميغيل سبوش - كالفار على مخطط تربية الأحياء في الشكل 3 وللدكتورة بيديا بيغوم كاراكوكاك على القراءة النقدية. وقد دعم هذه الدراسة مشروع الدوريات، وبرنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار في أفق 2020 بموجب اتفاقية المنحة رقم 760813، ومؤسسة أدولف ميركل. B.D. يشكر بيتر أوند ترادل إنغلهورن مؤسسة للدعم المالي.

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

10- إن إنتاج المواد الجديدة، بما في ذلك المواد الكيميائية والعقاقير، يزيد تدريجياً من الحاجة إلى نماذج تنبؤية في المختبر. الامتثال للمبادئ الثلاثة للاحلال، والحد، وصقل اختبار الحيوانات32، في المختبر نماذج الخلايا أصبحت أدوات قوية فيما يتعلق بجانب الاستبدال والحد من آليات توضيح المخدرات أو المادة العمل8،9،10،11. هنا هو بروتوكول مفصل لتجميع نموذج متعدد الخلايا باستخدام الخلايا المناعية التي هي إما معزولة حديثا أو إذابة من monocytes المجمدة سابقا. كما وصف زراعة النموذج في ALI. وأخيراً، يوضح البروتوكول مثالاً على التعرض للمحفزات البهوية ويقارن استجابة النموذجين اللذين يحتويان إما على وحدات أحادية جديدة أو مجمدة.
وقد أجريت دراسات مختلفة لتأكيد وتبرير القيمة المضافة للتعقيدات المعززة للنماذج التي نمت وتتعرض في ظل ظروف ALI مقارنة بالتعرض المغمور التقليدي7,22,31. مراقبة استجابة بروتينفلاmmatory أعلى في الثقافات المشتركة بالمقارنة مع الثقافات الأحادية للخلايا الظهارية تؤكد دراسة سابقة. واستخدمت الدراسة نموذج استزراع التكتهين (حفز مع LPS) وأظهرت استجابة أعلى عند مستويات التعبير الجيني لـ TNF و IL1B مقارنة بنموذج مكافئ A549 أحادي الثقافة7. من ناحية أخرى، أظهر كلا النموذجين اختلافات أعلى داخل قيم إطلاق الوسيط البروفلورية المقاسة مقارنة بزراعة A549 الأحادية. ويمكن تفسير ذلك باستخدام الخلايا المناعية من المتبرعين المختلفين (المعاطف البافية) ضمن التكرار البيولوجي (أي التكرار، متبرع واحد)، كما هو مبينسابقاً 7. إذا رغبت في ذلك، يمكن التغلب على الاختلافات بين التكرارات من قبل 1) باستخدام PBMs المذاب من نفس المانح أو 2) تجميع PBMs من مختلف المانحين قبل تجميد الخلايا، ثم استخدام لاحق لنفس التجمع في كل تكرار. كما يوصى أيضاً بإدراج المزيد من التكرارات البيولوجية.
يمكن اعتبار تقنية تجميد الخلايا كخطوة حاسمة; ومع ذلك، فمن إجراء مختبري مشترك للحفاظ على الخلايا لتحليل ظاهري وظيفية. وقد أظهرت الدراسات المختلفة أن نوعية PBMs المجمدة أمر حيوي لبقائهم، وتقنية التجميد المناسبة هي المفتاح لنجاح عمليات الفحص اللاحقة مع نفس الخلايا28,32. ويمكن إجراء تعديل للبروتوكول عن طريق تجميد PBMs، مما يوفر المرونة في الإعداد التجريبي، حيث أن توافر المعاطف البافي عادة ما يكون محدودا. ميزة أخرى لاستخدام PBMs المجمدة (في عدة قوارير) على تلك المعزولة حديثا هو أنها يمكن استخدامها في التجارب اللاحقة حتى بعد 1 سنة. ويقلل هذا الأمر من المسألة المحتملة للتباين بين المانحين والمانحين إذا كان هذا المعلمة مرغوباً أو مطلوباً في تجربة.
تظهر نتائج مقارنة بين الاحتياد التي أجريت بعد ما يصل إلى 13 شهراً أن PBMs، عندما تخزن بشكل صحيح في خزان النيتروجين السائل، يمكن استخدامها على مدى فترة طويلة دون أي تأثير على جدوى الخلية أو استعادة الخلايا33. قد تكون أوقات التخزين الأطول (أكثر من سنة) ممكنة عند التحقق من صحة الخلية وسرعة الاستجابة لها قبل إجراء تجربة. أيضا، يجب أن تظل درجة الحرارة في خزان النيتروجين السائل مستقرة في جميع الأوقات. ووجد أن العامل الرئيسي الذي يؤثر على صلاحية نظام PBMs المبردة هو تركيز نظام إدارة الاستدامة المالي، مع التركيز الأمثل من 10% إلى 20% (v/v)28. للتقليل من الآثار الضارة المحتملة للتجميد، مصادر مختلفة من البروتينات، FBS أو BSA (مع مجموعة واسعة من التركيز من 40٪ تصل إلى 100٪34)غالبا ما تضاف إلى وسيطة تجميد كمكونات وقائية طبيعية يمكن أن تزيد من بقاء الخلايا.
نظراً لإمكانية السمية الخلوية العالية لـ DMSO، فمن المستحسن أولاً تشتيت PBMs في FBS، ثم إضافة DMSO إلى PBMs المنتشرة بالفعل في FBS. وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من وجود تركيزات عالية من FBS (> 40%) لم تظهر أي تحسن في جدوى الخلية، في الوقت نفسه، فإنها لم تسبب ضررا للخلايا28. ومع ذلك، تجميد monocytes هو نهج ممكن للتغلب على قضايا توافر معطف بافي محدودة. ومع ذلك، إذا كان استخدام MDDCs وMM من PBMs الطازجة هو المطلوب، يمكن أن تكون متباينة الخلايا المناعية واستخدامها 5-8 أيام بعد العزل7،16،17،35،36،37. وإذا سمح التخطيط التجريبي، يوصى بتمايز 6 أيام على الأقل في كل من البلدان المتعددة الأطراف للبلدان النامية الجزرية المتعددة الأطراف وMDMs. ومع ذلك، فإن الاتساق بين التكرارات المختلفة في نفس التجربة، إلى جانب عمليات التفتيش الروتينية لتعابير علامات سطحها المحددة، أمر بالغ الأهمية. وينبغي أيضا أن يتم التحقق بانتظام من الاستجابة للحافز البروينفلوري، مثل LPS، بعد وقت التمايز.
وقد أجريت العديد من التحقيقات باستخدام خط الخلية A549 في ALI، إما باعتبارها أحادية أو جنبا إلى جنب مع أنواع الخلايا الأخرى (الضامة، الخلايا التشعبية، أو الخلايا الليفية) في نموذج 3D تربية الأحياء22،24،29،38. باستخدام هذا النموذج 3D coculture، السمية الخلوية، والأكسدة، أو آثار proinflammatory من (نانو-) وقد تم التحقيق في المواد لمدة تصل إلى 72 ح1،,17،,21،,24،,29. وقد سبق التحقيق في التشابه في نموذج في الأنسجة الجسمية استنادا إلى التصوير الضوئي بالليزر confocal من نموذج16. عند تجميع النموذج، من المهم النظر في كل من انتشار الخلايا (التي يمكن أن تؤثر على A549 في النموذج المعروض هنا) وكذلك أداء الخلايا المناعية الأولية (لا تتكاثر) (هنا، MDDCs وMDMs). ومن المهم أيضاً أن تؤخذ في الاعتبار أن الخلايا غير جميع الوحديات الموجبة CD14 تفرق إلى مراكز متعددة الأطراف للأدوية وMDMs، وأن الخلايا يمكن أن تكون موجودة في كل من النماذج المرفقة والموقفة. استناداً إلى طبيعة الجمعية لزراعة نقّال (هنا، كلا النوعين من الخلايا بحاجة إلى إرفاق الطبقة الظهارية الموجودة)، فمن المستحسن استخدام فقط أتباع السكان الفرعية من كلا النوعين من الخلايا المناعية. بالإضافة إلى ذلك، فإن التحليلات الروتينية للوحدات الأحادية و MDDC و MDM استجابة أحادية الثقافة LPS، والتعبير عن علامات سطحية محددة (CD14، CD163، CD86، CD93، أو CD206، البيانات غير مبينة) قد اقترحت أن 6 و 7 أيام من التمييز هي النقاط الزمنية المثلى.
على الرغم من أن عددا واقعيا من الخلايا الظهارية القُزُلية في الرئتين البشرية يتوافق مع ~ 160،000 الخلايا / سم2، وعدد الخلايا A549 عد في النموذج هو ~ 1،000،000 الخلايا / سم2 بعد 9 أيام مثقف على إدراج16،18. وبالتالي، يجب النظر في هذا القيد في النموذج في المختبر. أولاً، تم تأسيس كثافة الخلايا الظهارية بناء على قدرتها على تشكيل طبقة التقاء على الغشاء المتنامي. ومن المهم أيضا أن نذكر أن A549 يمثل خلية من النوع الظهاري الثاني مع شكل الظهارية، على عكس الخلايا الظهارية الأولى، والتي هي مسطحة و outspread. من ناحية أخرى ، تم تأسيس العدد المطلوب من الخلايا المناعية على أساس الأدب وعرضها في هذا البروتوكول كرقم الخلية / مساحة السطح39،40،41. كثافة الخلية من MDDCs في نطاق 400 الخلايا / ملم2 (4 خلايا / سم2)16 هو مماثل للثابتة حالة كثافة الخلايا من 500-750 خلايا / مم2 (5- 7 الخلايا / سم2)ذكرت من في دراسات vivo39. كثافة MDMs في هذا النموذج ضمن نفس النطاق من في حالة في الجسم الحي في المنطقة السنخية البشرية40.
لوحظ تلطيخ علامة الضامة الناضجة (25F9) في الجانب الزفيري (حيث توجد MDMs) وكذلك الجانب القاعدي (أي، في موقع الخلايا المتججرة). نقل الخلايا المناعية من خلال الغشاء إدراج المسام من الممكن ، وقد لوحظ أيضا باستخدام هذا النموذج16، والتي قد تفسر الاختلافات الملاحظة في كثافة تلطيخ. ومع ذلك، تفسير آخر ممكن هو أن علامة الضامة الناضجة يمكن أيضا أن أعرب عن خلايا التشعب، ولكن التعبير هو المانحة للغاية42محددة . أيضا، فإن كثافة التعبير 25F9 أعلى بكثير في MDMs (الشكل 7، الشكل 8). كل من المحفزات proinflammatory (LPS و TNF-α) أثرت على سلامة حاجز الظهارية الرئوية في كل من الثقافات(الشكل 7، الشكل 8). وكان هذا متوقعا على أساس المنشورات السابقة43،44 تبين أن السيتوكينات proinflammatory والمنتجات البكتيرية تعطيل سلامة الحواجز الظهارية.
نموذج متعدد الخلايا 3D من ظهارة السنخية البشرية، التي أنشئت وتتميز سابقا17،وقد خدم كأداة قوية ومفيدة لتقييم الاستجابات البيولوجية (أي، ردود الفعل proinflammatory الحاد، استجابة الإجهاد التأسدي، وتوزيع الجسيمات، والاتصالات الخلوية) في المختبر21،24،25،45. وتؤكد النتائج على إعادة النقية من نماذج تربية الأحياء إلى المحفزات proinflammatory (هنا، LPS و TNF-α). وزادت الاستجابة قليلا عند استخدام الخلايا المناعية من PBMs جديدة; ومع ذلك، لم يكن هناك فرق إحصائياً هاماً بين الثقافات المشتركة باستخدام PBMs العذبة مقابل المذابة. وعلاوة على ذلك، كانت ردود الفعل البروينفلورية لكلا النموذجين لزراعة تربية الظهارة أعلى من تلك التي كانت من الظهارية أحادية الخلية المزروعة في ظل نفس الظروف (ALI). وباختصار، يصف البروتوكول تجميع نموذج تربية ظهارية بشرية ثلاثية الأبعاد ثلاثية الأبعاد باستخدام برامج عمل ثنائية عذبة أو مذابة للتمايز في MDMs و MDDCs. وتبين أن كلا النموذجين يستجيبان بدرجة عالية للمحفزات البهائية. ولذلك، يمكن أن تكون بمثابة أدوات قوية لتقييمات المخاطر المحتملة والسمية.

في الثقافات في خلايا الرئة في المختبر تقدم فعالة من حيث التكلفة، قوية، ومنصات تسيطر عليها بشكل جيد لتقييم مخاطر الهباء الجوي1. كنظام الخلايا النموذجية لثنوموسيات الأمهرة السنخية البشرية، وغالبا ما يستخدم خط الخلية A549 الظهارية المعزولة من غدية رئوية2. هذه الخلايا تمثل الخلايا الظهارية من النوع الثاني الحرشفية من المنطقة القُصيبية3 وهي عبارة عن خط خلايا الرئة المستخدم على نطاق واسع لتقييم الخطر والسمية1،4،5,،6،7،8،9،10. يمتلك خط الخلية A549 ميزات ذات صلة من خلايا النوع الظهاري الثاني السنخية ، مثل وجود أجسام لميلاس مميزة تحتوي على فوسفوليبيدات معبأة بكثافة3.
وقد تبين أنه عندما يتم استزراع الخلايا في واجهة الهواء السائل (ALI)، يتم تحرير السطحي على الجانب apical من الخلايا الظهارية الهواء المكشوفة، والحد من التوترالسطحي 11،12،13. هذه الميزة هي ذات أهمية خاصة في المواد النانوية في التنفس وفحوصات السمية. مرة واحدة يتم ترسيس المواد النانوية المستنشقة / المواد السامة في منطقة السنخية، فإنها تتفاعل أولا مع السطح الرئوي ويتم تشريدها من قبل قوات التبول في hypophase مائي، حيث التفاعل مع الخلايا الرئوية يحدث14،15. على الرغم من أن الخلايا A549 تشكل أحادية الطبقة (التي يمكن أن overgrow في multilayers في وقت لاحق من النقاط الزمنية عندما تزرع في ALI) وإنتاج السطحي، والعيب هو عدم كفاية تشكيل تقاطع ضيق، مما أدى إلى انخفاض قيم المقاومة الكهربائية transepithelial، ولكن لا يزال تقديم حاجز وظيفي ضد بين الخلايا (نانو) الجسيمات نقل المواقع16،17،18.
في الرئتين، هناك مجموعة متنوعة من مجموعات الخلايا المناعية، بما في ذلك الخلايا التي تقدم المستضدات بالبلعية والمهنية (أي الضامة والخلايا التشعبية) التي تتواصل مباشرة من خلال الاتصال الخلوي أو الإشارات بين الخلايا للتحكم في التوازن والحفاظ عليه. الضامة والخلايا التشعبية هي الآثار المناعية الفطرية الحرجة والمبادرين من الاستجابة المناعية التكيفية19. يمكن للخلايا التشعبية المقيمة داخل أو تحت الظهارة أن تشكل نتوءات عبر الظهارة إلى التجويف لالتقاط المستضدات. تقع الضامة السنوية على السطح الكبي للظهارة وتعمل كخلايا خرابة ، تمثل أول دفاع خلوي ضد المواد الأجنبية وكذلك العدوى البكتيرية والفيروسية والفطرية. اللدونة phenotypic يسمح التعريفي بسرعة من ردود الفعل proinflammatory ردا على هذه المحفزات وكذلك التحول إلى اثارة مضادة للالتهابات (أي، مثبطة) ردود الفعل20.
لمحاكاة حاجز الأنسجة الظهارية السنخية البشرية، أنشأنا نموذج تربية الأحياء الثلاثية مع الخلايا A549 تكملها الضامة المشتقة من الدم البشري (MDMs) والخلايا التشعبية (MDDCs) على الجانبين apical والقاعدة، على التوالي17. وقد تم الإبلاغ سابقا عن زراعة هذا النموذج في ALI16، حتى تصل إلى 72 ساعة بعد التعرض21. وقد تعززت الاستجابات المناعية الحادة للتعرض للأنابيب النانوية الكربونية بشكل كبير في زراعة الخلايا المعرضة لـ ALI مقارنة بالظروف المغمورة22. نموذج تربية الأحياء، المستزرعة والمعرضة لمواد مختلفة في ALI، وقد استخدمت سابقا للتحقيق في السمية الخلوية، والإجهاد التأسدي والاستجابات الالتهابية على التعرض لأكسيد الزنك،23 المواد ذات الصلة الجرافين24، الذهب الجسيمات النانوية25،26، الكربون نانوتيوب21، والرماد البركاني وجزيئات العادمالديزل 27.
وعلاوة على ذلك، تم تأكيد الدور الهام لل الضامة والخلايا التشعبية كخلايا مناعية في نموذج الرئة البشري في المختبر. على وجه الخصوص، لوحظ استجابة proinflammatory زيادة في النموذج فقط في وجود الخلايا المناعية بالمقارنة مع نظم أحادية الاستزراع7. تتمثل العيوب المحتملة لاستخدام الخلايا المناعية الأولية المشتقة من أحادية الخلايا في محدودية إمكانية الوصول إلى PBMs وكذلك الاختلاف بين المانحين والمتبرعين. كحل لهذه العيوب المحتملة ، المقدمة هنا هو بروتوكول إدخال حفظ التبريد من PBMs المعزولة حديثا28 لثقافة الخلية نموذج التجميع. الهدف من هذه الدراسة هو إثبات 3D الإنسان 3D الأنسجة الظهارية الجمعية الظهارية، بما في ذلك عزل PBMs من المعاطف بافي الإنسان. وتقارن الاستجابة للمحفزات الحفزية بالنموذج المؤلف من الـ MDMs وMDDCs المتمايزة عن برامج العمل الناشئة أو المتمايزة عن PBMs المجمدة/المذابة.
ويتطلب العمل مع عينات دم بشرية لم تختبر بعد رعاية محددة لمنع انتقال الأمراض المعدية المحتملة، مثل فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد B والتهاب الكبد C. ولذلك، فإن استخدام تدابير الحماية الشخصية مثل القفازات والعباءات والأقنعة وحماية العين أمر بالغ الأهمية ويجب أن يكون وفقا لمبادئ الممارسة المختبرية الجيدة. هذه الحماية تقلل من خطر تعريض الجلد أو الأغشية المخاطية للسوائل المعدية المحتملة. بالإضافة إلى ذلك، بالنسبة لأولئك الذين يشاركون في التعامل مع المعاطف البافي وPMS، فإن التطعيم ضد فيروس التهاب الكبد B إلزامي، ومستويات تتر الدم من الأجسام المضادة لالتهاب الكبد B يجب أن تكون فوق 100 وحدة دولية /لتر (يجب معالجة المتطلبات التشريعية الخاصة بالبلد). وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن يتم تنفيذ جميع الأعمال في مختبرات السلامة الأحيائية 2 (يلزم معالجة المتطلبات التشريعية الخاصة بكل بلد). وينبغي عند إجراء البروتوكول بأكمله اعتماد احتياطات معيارية للصحة والسلامة ترتبط بالعمل في بيئة مختبرية ومناولة ثقافة خلايا الثدييات، بما في ذلك مناولة النفايات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchmark microplate reader</td>
			<td>does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Incubator</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container (for example Mr. Frosty)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>does not have to be specific, for example</td>
			<td>Zeiss LSM 710 meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatocytometer, or automatic cell counter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar bio-safety hood class II</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStand Macs (Macs Cell Separator)</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast inverted light microscope</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette boy, pipettors (different volumes)</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable small equipment/glassware</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353046 and 353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 &#956;m pore size</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapper</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass autoclaved Petri Dishes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>10040-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>A7030-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MicroBeads human - magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-097-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS, Norway</td>
			<td>1114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td>D5879_1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>E6758-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-093-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-095-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>4524-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 &#956;g/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 &#956;g/mL</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 &#956;g/mL</td>
			<td>Agrisera, Sweden</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 &#956;g/mL</td>
			<td>eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland</td>
			<td>14-0115-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 &#181;M</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab244204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment

ويرد هنا نموذج لزراعة الخلايا القُصَلية البشرية لمحاكاة حاجز الأنسجة الظهارية السنخية المكون من خلايا ظهارية من النوع الثاني واثنين من أنواع الخلايا المناعية (أي الضامة المشتقة من أحادية الخلايا البشرية [MDMs] والخلايا التكينة [MDDCs]). يتم توفير بروتوكول لتجميع النموذج متعدد الخلايا. تنمو الخلايا الظهارية السنخية (خط الخلية A549) وتتمايز في ظل ظروف مغمورة على إدراج نفاذي في آبار من غرفتين، ثم جنبا إلى جنب مع MDMs متفاوتة وDDCS. وأخيراً، تتعرض الخلايا لواجهة هوائية سائلة لعدة أيام. كما الخلايا المناعية الأولية البشرية تحتاج إلى عزل من المعاطف بافي الإنسان، يتم مقارنة الخلايا المناعية التي تم تمييزها من إما أحاديات الطازجة أو المذابة من أجل تكييف الأسلوب على أساس الاحتياجات التجريبية. تظهر النماذج ثلاثية الأبعاد ، المكونة من خلايا قُزَّرة إما معزولة حديثًا أو مذابة خلايا مناعية مشتقة من أحادية السُنَة ، زيادة كبيرة إحصائيًا في السيتوكين (إنترلوكين 6 و 8) عند التعرض للمحفزات البروتينية (liplysaccharide وعامل نخر الورم α) مقارنة بالخلايا غير المعالجة. من ناحية أخرى، لا يوجد فرق مهم إحصائيا بين الإفراج السيتوكين لوحظ في الثقافات. وهذا يدل على أن النموذج المقدم يستجيب للمحفزات البروينفلية في وجود MDMs و MDDCs التي تميّز من ذوبان أو ذوبان ونُسج الدم المحيطي الطازجة (PBMs). وبالتالي، فهو أداة قوية للتحقيق في الاستجابة البيولوجية الحادة لمختلف المواد، بما في ذلك العقاقير الهباءية أو المواد النانوية.

تم تجميع نماذج تربية الرئة البشرية، التي تتكون من الخلايا الظهارية السنخية والخلايا المناعية، إما من MDDCs الطازجة أو المجمدة وMDMs السلف (هنا، أحاديات مشتقة من الدم المحيطي البشري). كما هو معروض في الشكل 1، تم زرع الخلايا A549 بعد 3 أيام من القسم الأول الذي ينطوي على عزل أحادية / ذوبان. وبعد ستة أيام من التمايز، ظهرت هذه الآليات المتمايزة على شكل دائري، في حين شكلت البلدان متعددة الأطراف شكلاً أكثر إمتدها مع نتوءات يمكن ملاحظتها. كما ظهرت كـ أجُلمرتات، خاصة عندما تُميز عن الوحديات الطازجة(الشكل 2، الشكل 3). شكلت الخلايا الظهارية طبقة الخلايا الكثيفة من الخلايا بعد 3 أيام من النمو على إدراج الغشاء (الشكل 4)، عندما تم تجميع الثقافات. بعد 24 ساعة من تجميع و 24 ساعة إضافية من التعرض لشروط ALI، تم إعداد الثقافات المشتركة للتعرض.
تم التحقيق في الاستجابة لنماذج ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد عند التعرض للمحفزات البروفلورية المعروفة باستخدام نهج pseudo-ALI ، كما هو موضح سابقًا29. تمت إضافة المحفزات البروينفلاmmatory، LPS و TNF-α، بكميات منخفضة (100 ميكرولتر) على السطح السطحي لنموذج الخلية المكشوفة للهواء. في موازاة ذلك، تم تقييم عدم وجود تمزق الغشاء كمقياس للسمية الخلوية عن طريق فحص LDH. وقد لوحظت زيادة كبيرة في إطلاق LDH في CCM من المقصورة القاعدية عند التعرض للرقابة الإيجابية لتمزق الغشاء، وهو منظف Triton-X 100(الشكل 5). أثبتت هذه النتائج استجابة النموذج لمادة سمية للخلايا، في حين لم تلاحظ أي زيادة في إطلاق LDH على التحفيز apical مع TNF-α أو LPS.
ويمكن أن يعزى سبب محتمل للقيم المختلفة المقاسة للـ LDH في العينات المجمعة إما بـ PBMs الطازجة أو المجمدة سابقًا إلى تخزين العينات. تم تخزين عينات من PBMs الطازجة لفترة أطول في -80 درجة مئوية؛ لذلك، قد ينخفض نشاط إنزيم LDH. وتجدر الإشارة إلى أن رابطة LDH مستقرة لمدة تصل إلى 4 أيام فقط في CCM؛ وهكذا، فمن المستحسن لأداء المقايسة آخر 2 أيام بعد جمع سراويل. بدلا من ذلك، فمن الممكن لتجميد أسفل supernatants مباشرة بعد جمع. ومع ذلك، من المهم أن تنظر إلى أن تجميد يمكن أن تقلل من النشاط الأنزيمي للLDH.
تم تحديد كمية إفراز وسطاء proinflammatory (هنا، TNF-α وinterleukins 6 [IL-6] و 8 [IL-8]) في CCM القاعدية عن طريق ELISA. ولوحظت الزيادات ذات الأهمية الإحصائية (p < 0.05, ANOVA) في اتجاه واحد) في الانبعاثات من IL-6 و IL-8 في كل من العينات المعالجة LPS-و TNF-α مقارنة بالخلايا غير المعالجة، وكذلك في نماذج ثقافة الخلية التي تم تجميعها من مصدر PBMs(الشكل 6). على الرغم من تركيزات (pg/mL) من جميع السيتوكينات المختبرة في CCM القاعدية كانت أعلى في الثقافات المشتركة المكونة من PBMs الطازجة ، فإن الاختلافات بين الثقافات المشتركة وزراعة أحادية لم تكن ذات أهمية إحصائية (p > 0.05) (الشكل 6). لتأكيد القيمة المضافة لنماذج الزراعة التكانية فيما يتعلق بثقافة الخلايا الظهارية 2D، تم أيضاً تعرض الثقافات أحادية A549 إلى LPS أو TNF-α. وكما هو متوقع، كان الإفراج عن جميع الوسطاء الذين تم التحقيق معهم من الثقافات الأحادية A549 أقل مقارنة بكلا النموذجين اللذين اُجرىهما في مجال الزراعة المشتركة؛ على الرغم من أن الفرق بينهما لم يكن مهمًا إحصائيًا (p > 0.05، ANOVA في اتجاه واحد).
تم تقييم التشكل الخلوي لحواجز الأنسجة الظهارية السنخية البشرية ثلاثية الأبعاد عبر المجهر المسح الضوئي بالليزر (LSM) . لتصور تكوين كل نموذج، كانت الضامة داخل نماذج الثقافة المشتركة (MDMs) ملطخة بعلامة الضامة الناضجة 25F9. كانت ملوّناة MDDCs مع CD83، وهو علامة هامة لالخلايا التشعبية المنشط30. وفيما يتعلق بالمرفرف الخلوي، لم يلاحظ أي اختلاف بين نماذج الزراعة التكتهية التي تستخدم هذه المقاييس والبلدان ذات ال MDDCs من مركبات PBMs الطازجة مقارنة بالنماذج التي تستخدم PBMs المذابة. في LPS- و TNF-α-exposed الثقافات، وكلاهما يتكون من الخلايا المناعية الطازجة والمجمدة، لوحظ وجود طبقة ظهارية معطلة في صور LSM، وهو ما لم يكن الحال في الخلايا غير المعالجة(الشكل 7، الشكل 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig01.jpg"> الشكل 1: المخطط الزمني المخطط للبروتوكول. عرض نموذج تربية 3D، والتجمع، والتطبيق (التعرض لمادة اختبار). ALI = واجهة الهواء السائل، MDDCs = الخلايا المتجانسة المشتقة من أحادية الخلايا، MDMs = الضامة المشتقة من أحادية الولي، PBMs = أحاديات الدم المحيطية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig02.jpg"> الشكل 2: برامج MDM وMDDCs التي تم تمييزها عن برامج إدارة الميزات الناشئة. صورة المجهر على النقيض من الطور من متباينة (A) MDMs و (B) MDDCs من PBMs جديدة (6 أيام بعد عزل الخلية). تكون هذه الأجهزة مستديرة الشكل، بينما كثيراً ما تُلاحظ البلدان MDDCs كتكتلات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig03.jpg"> الشكل 3: نظم إدارة الانبعاثات وال MDDCs التي تم تمييزها عن برامج إدارة الانبعاثات المجمدة. صورة المجهر على النقيض من الطور من متباينة (A) MDMs و (B) MDDCs من PBMs المذاب (6 أيام بعد ذوبان). تكون هذه الخلايا مستديرة الشكل، ولكن يمكن ملاحظة بعض الخلايا الممدودة. كما تظهر MDDCs مستديرة الشكل مع نتوءات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig04.jpg"> الشكل 4: نمو الخلايا الظهارية على إدراج الأغشية. صورة المجهر على النقيض من المرحلة من التقاء A549 المتزايد على إدراج غشاء 4 أيام بعد البذر، وتشكيل طبقة كثيفة من الخلايا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig05.jpg"> الشكل 5: نتائج السمية الخلوية التي تم التحقيق فيها عن طريق الغشاء القائم على تمزق (LDH) مقايسة. يتم تقديم البيانات على أنها زيادة أضعاف على الخلايا غير المعالجة (متوسط ± SD، ن = 3، تشير النجمة إلى زيادة ذات دلالة إحصائية مقارنة بالخلايا غير المعالجة، **p < 0.01، ****p < 0.0001). في النماذج الخضراء يتم تمثيل MDMs و MDDCs من PBMs جديدة، وفي نماذج الأرجواني تجميعها من PBMs المذابة يتم تمثيل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig05large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig06.jpg"> الشكل 6: ردود الفعل الProinflammatory في الثقافات وزراعة أحادية. الوسطاء proinflammatory (TNF-α, IL-6, و IL-8) الإفراج في الثقافات المشتركة على 24 ح التحدي مع LPS أو TNF-α. يتم عرض البيانات على أنها نسبة إلى الخلايا غير المعالجة (متوسط ± SD، ن = 3، ** p < 0.01، ***p < 0.001، ****p < 0.0001). في النماذج الخضراء يتم تمثيل MDMs و MDDCs من PBMs جديدة، وفي نماذج الأرجواني تجميعها من PBMs المذابة يتم تمثيل. الرمادي يمثل A549 الثقافات الأحادية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig06large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig07.jpg"> الشكل 7: مورفولوجيا الثقافات المكونة من خلايا مناعية جديدة. LSM صور من الجوانب apical والضموية من نموذج تربية الأحياء مع إسقاطات XZ من الجوانب apical من النموذج باستخدام MDMs و MDDCs من PBMs الطازجة. السماوي يمثل النوى (DAPI), يمثل الأرجواني cytoskeleton (رودامين-phalloidin), الأبيض يمثل MDM (25F9), والأخضر يمثل MDDCs (CD 83). يشير السهم الأبيض إلى MDM، بينما يشير السهم الأخضر إلى MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig07large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig08.jpg"> الشكل 8: مورفولوجيا الثقافات المكونة من الخلايا المناعية المجمدة. LSM الصور من الجانب apical من نموذج الزراعة المشتركة مع الإسقاطات XZ المقابلة، والجانب القاعدي للنموذج باستخدام MDMs و MDDCs من PBMs المذابة. السماوي يمثل نوات (DAPI)، يمثل اللون الأرجواني cytoskeleton (رودامين-phalloidin)، يمثل الأبيض MDMs (25F9)، والأخضر يمثل MDDCs (CD 83). يشير السهم الأبيض إلى MDM، بينما يشير السهم الأخضر إلى MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig08large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment at JoVE.com

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

قدم هنا هو بروتوكول لعزلة أحادية الدم الإنسان الأولية وكذلك تمايزها في الضامة والخلايا التشعبية والتجميع مع الخلايا الظهارية في نموذج الرئة البشرية متعددة الخلايا. وتقارن الاستجابات البيولوجية لثقافات النقوش المكونة من خلايا مناعية متمايزة عن الخلايا الأحادية المعزولة حديثا أو المذابة، عند التعرض للمحفزات البهوية.

نموذج القُزلة السنخية البشرية متعددة الخلايا يتكون من الخلايا الظهارية والخلايا المناعية الأولية لتقييم المخاطر

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

يستخدم هذا النموذج الصوتي البشري الفردي الخلايا المناعية ذات الصلة كأداة قوية للتنبؤ بالاستجابة المناعية الحادة للمواد بما في ذلك المواد النانوية وعقاقير المعرفة. هذه الطبية يجمع بين الخلايا الظهارية البشرية والخلايا المناعية الأولية الإنسان لتقييم تلك التفاعلات المحددة. يوفر استخدام أحاديات الخلايا المتجمدة الطازجة والمجمدة مرونة لخطة التجربة.وقد أظهرت العديد من الدراسات أن هذا النموذج يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في الاتصال بين النجوم بين حس السلوك والحس المناعي. كما يتضمن هذا العرض كل التفاصيل الهامة ل studing نموذج سمة شخصية في ثقافة الخلية، والتعليمات البصرية لتكرار التجارب. تعد عدة خطوات في بروتوكول المثانة معقدة وتتطلب معالجة خاصة.لذلك يتم إظهارها مع جميع التفاصيل المطلوبة التي يمكن متابعتها بسهولة. لعزل أحاديات الدم الطرفية من المعاطف بافي الإنسان، وتقسيم حصاة الخبز معطف محتويات حقيبة، بالتساوي بين 250 ملليلتر أنابيب المخروطية. جلب بعناية الحجم الكلي في كل أنبوب 250 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني وخلط الأنابيب مع ثلاثة انقلابات لطيف.ثم تقسيم حل برنامج تلفزيوني معطف بافي بالتساوي بين أربعة أنابيب 50 ملليلتر جديدة، ثم إضافة 10 ميكرولتر من CD 14 حبات مغناطيسية إيجابية الخلايا الإجمالية السابعة إلى الأنبوب وخلط جيدا عن طريق الأنابيب. عند الملء، قم بفصل الماصات عن ttertter وقم على الفور بتوصيل الفتحة العليا للميصة بإبهام ثم وضع الماصات المملوءة في الجزء السفلي من أنبوب واحد وافصل فتحة الماصات للسماح للتدرج المتوسط الكثافة للتدفق ببطء تحت خليط PBS معطف بافي، حتى يتم ترك ملليلتر واحد من متوسطة الانحدار الكثافة داخل الماصة. عندما تم إضافة متوسط التدرج الكثافة إلى كل أنبوب في نفس الطريقة فصل الخلايا بواسطة الطرد المركزي التدرج الكثافة واستخدام ماصة المصلية لجمع أبيض سميكة من اثنين إلى ثلاثة ملليمترات طبقة خلية أحادية النوية الدموية الطرفية من بين البلازما والطبقات المتوسطة التدرج الكثافة.أفضل طريقة لتوصيل الطبقة هي إزالة البلازما أولاً ثم تقوم بقمع ماصاتنا المنطقية لجمع الخلايا. سحب خلايا أحادية النوى الدم الطرفية من كل مجموعة من أنبوبين في أنبوب واحد جديد 50 ملليلتر وغسل الخلايا مرتين مع حجم إجمالي 50 ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد في غسل. ثم تجاهل supernatant و resuspend الماص في كل في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد وتجمع تعليق الخلية في أنبوب واحد للعد.بعد عد, الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى وإعادة تعليق بيليت إلى 80 ملليلتر من العازلة الفاصل المغناطيسي لكل حضور الخلايا السابعة. ثم إضافة 10 ميكروليترس من CD 14 حبات مغناطيسية إيجابية في حضور الخلايا الإجمالية السابعة إلى الأنبوب وخلط جيدا عن طريق pipetting. بعد حضانة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية شطف عمود مغناطيسي مع ثلاثة ملليلتر من العازلة الفاصل المغناطيسي وإضافة الخلايا إلى العمود.اغسل العمود ثلاث مرات مع ثلاثة ملليلتر من وحدات التخزين المؤقت لكل غسل ونقل العمود إلى أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من عازلة فصل مغناطيسية جديدة. ثم استخدام المكبس وخمسة ملليلتر من العازلة لطرد CD 14 الخلايا الإيجابية في أنبوب. لا تحث على التمايز من حبة المغناطيسي المعزولة CD 14 الخلايا الإيجابية.أولاً، إعادة تعليق الخلايا في مرة واحدة حضور إلى الخلايا الستة لكل ملليلتر تركيز في خلية ثقافة المتوسطة. أو MDDC التمايز، إضافة 10 نانوغرام لكل ملليلتر من ومن حبيبات الموقع عامل تحفيز مستعمرة الضامة إلى الأنبوب وإضافة ثلاثة ملليلتر من الخلايا إلى كل بئر من ستة صحن خلية جيدة لوحة، أو التمايز MDM إضافة 10 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل تحفيز مستعمرة الضامة إلى الخلايا وطبق الخلايا كما أظهرت للتو. لإعداد خلية ظهارية بشرية السنخية الخلية ثلاثية الخلية نموذج الثقافة المشتركة، نقل أول 1.5 ملليلتر من قبل الدافئة خلية ثقافة المتوسطة في العدد المناسب من الآبار من لوحة 12 جيدا ووضع ثقافة الخلية إدراج في كل بئر.أضف التالي 500 ميكرولترات من تعليق الخلايا الظهارية بكثافة خمس مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر في الجانب apical من كل إدراج وتغطية لوحة لاحتضان لمدة أربعة أيام في حاضنة ثقافة الخلية. أو بذر MDDC يستبدل supernatant من الآبار من ستة لوحات الآبار المستخدمة لتمايز MDDC، مع ملليلتر واحد من خلية جديدة متوسطة ثقافة دافئة واستخدام مكشطة الخلية لفصل الخلايا الالتزام من كل بئر. غسل كل بئر ثلاث مرات مع supernate وفي كل بئر والجمع بين كل من حلول الخلية في أنبوب واحد الطرد المركزي.وMDDC حصادها عن طريق الطرد المركزي والملاقط المعقمة لوضع إدراج من 12 لوحات البئر رأسا على عقب في طبق بيتري العقيمة. كشط أي خلايا ظهارية من الجانب القاعدي من إدراج وإعادة تعليق MDDCs في متوسطة زراعة الخلايا الطازجة القيام تركيز 4.2 مرات 10 من هذه الخلايا لكل ملليلتر. ثم إضافة 150 ميكرولترات من الخلايا على كل إدراج بحيث يتم تغطية كامل سطح القاعدية من إدراج بالتساوي مع السائل دون فقاعات.بالنسبة لبذر MDDM بعد حصاد MDDMs المتمايزة كما هو موضح لـ MDDCs ، قم بتخفيف الخلايا إلى 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الأربع لكل ملليلتر من تركيز متوسط لثقافة الخلايا الطازجة وإضافة 500 ميكرولترات من الخلايا أسفل جدار كل خلية ظهارية وMDDC تحتوي على إدراج ثقافة الخلية ، ثم ضع الغطاء على اللوحة ووضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلايا لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي الطامح من كل من المناطق apical وbaal كل خلية ثقافة إدراج وآبار. ثم تقوم بتعقيم الملاقط لرفع إدراج من الآبار وإضافة 600 ميكرولترات من ما قبل الوارزم الطازجة إلى خلية ثقافة المتوسطة لكل بئر.بعد ستة أيام من التمايز، تظهر MDMs مستديرة الشكل بينما تشكل MDDCs مجموعات تتكون من خلايا ذات شكل أكثر ممدودًا ونتوءات قابلة للملاحظة. بعد ثلاثة أيام من النمو على إدراج الغشاء، والخلايا الظهارية تشكل زيادة كبيرة في إطلاق لاكتات ديهيدروجيناز ويلاحظ في المتوسطة ثقافة الخلية من المقصورة القاعدية عند التعرض لمراقبة إيجابية لتمزق الغشاء، مما يثبت استجابة النموذج لمادة السامة للخلايا. لا زيادة في الافراج عن dehydrogenase اللاكتات كما يقاس على التحفيز apical مع TNF ألفا أو LPS.ولوحظت زيادات هامة إحصائيا في إطلاق IL6 و IL8 في كل من LPS و TNF ألفا العينات المعالجة مقارنة مع السيطرة على الخلايا غير المعالجة. لا توجد اختلافات في مورفولوجيا الخلية لوحظت بين نماذج الثقافة المشتركة باستخدام MDDMs و MDDCs من أحاديات الدم المحيطية الطازجة مقارنة بتلك التي تستخدم الخلايا المذابة في LPS و TNF ألفا تتعرض الثقافة المشتركة ، لوحظت طبقة ظهارية معطلة. فمن الممكن استخدام أنواع أخرى من الخلايا البشرية مثل مجرى الهواء أو الخلايا القصبية، ويمكن أيضا أن يتم تحليل نقاط نهاية أخرى.وقد استلهم الباحثون أساسا من هذه التقنية باستخدام مماثلة لإعداد ولكن مع أنواع مختلفة من الخلايا.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

Tissues of the Human Body

SCIENTISTS IN ACTION

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

الإنسان الشعبي الأساسي الخلايا الظهارية نمت من Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

الثقافة السابقين فيفو من خلايا الإنسان الأولية قناة فالوب طلائي

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

عزل الخلايا المناعية من الأورام الأولية

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

السذاجة الكبار الخلايا الجذعية عزل من المرحلة الابتدائية الثقافات الخلايا الليفية الإنسان

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

الأمثل الفيروسة البطيئة إنتاج وزراعة الخلايا الشروط الضرورية لبنجاح خلايا تنبيغ الإنسان الشعبي الأساسي طلائي

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

الرصد في الموقع للجمعيات النكّيّازة الجزيئية المشكلة بشكل عابر في البكتيريا والخميرة والخلايا البشرية

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

عزل وإثراء الخلايا السلفية الظهارية للرئة البشرية للزراعة العضوية

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...