Name: multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment
Uploaded: 2020-05-06T13:30:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Dr. Miguel Spuch-Golgata for coculture ordningen i figur 3 og til Dr. Bedia Begum Karakocak for kritisk læsning. Denne undersøgelse blev støttet af PATROLS-projektet, DEN Europæiske Unions Horisont 2020-forsknings- og innovationsprogram i henhold til tilskudsaftale nr. B.D. takker Peter und Traudl Engelhorn-fonden for økonomisk støtte.

Forfatterne har intet at afsløre.

Ny produktion af nye materialer, herunder kemikalier og narkotika, øger gradvist behovet for prædiktive in vitro-modeller. For at overholde de tre principper for udskiftning, reduktion og raffinering afdyreforsøg 32er in vitro-cellemodeller blevet effektive værktøjer til udskiftning og reduktion af mekanismer til belysning af mekanismerne i et lægemiddels eller materialesindsats 8,9,10,11. Præsenteret her er en detaljeret protokol for at samle den flercellede model ved hjælp af immunceller, der enten er frisk isoleret eller optøet fra tidligere frosne monocytter. Også beskrevet er dyrkning af modellen på ALI. Endelig illustrerer protokollen et eksempel på eksponering for proinflammatoriske stimuli og sammenligner reaktionen fra de to modeller, der indeholder enten friske eller frosne monocytter.
Der er udført forskellige undersøgelser for at bekræfte og begrunde merværdien af den øgede kompleksitet af de modeller , der dyrkes og eksponeres under ALI-forhold , sammenlignet med konventionel neddykketeksponering 7,22,31. Observation af den højere proinflammatoriske respons i cocultures sammenlignet med monokulturer af epitelceller bekræfter en tidligere undersøgelse. Undersøgelsen anvendte den præsenterede cokulturmodel (stimuleret med LPS) og viste en højere respons ved genekspressionsniveauerne for TNF og IL1B sammenlignet med A549 monokulturækvivalent model7. På den anden side viste begge modeller større variationer inden for målte proinflammatoriske mediator frigivelsesværdier sammenlignet med A549 monokulturer. Dette kan forklares ved brug af immunceller fra forskellige donorer (buffy coats) i biologiske gentagelser (dvs. en gentagelse, en donor), som tidligere vist7. Hvis det ønskes, kan variationerne mellem replikaterne overvindes ved 1) ved hjælp af optøede PbMs fra samme donor eller 2) pooling PbMs fra forskellige donorer før indefrysning af cellerne, derefter efterfølgende brug af den samme pulje i hver gentagelse. Det anbefales også at inkludere flere biologiske gentagelser.
Cellefrysningsteknikken kan betragtes som et kritisk skridt; Det er dog en fælles laboratorieprocedure til konservering af celler til fænotopypisk og funktionel analyse. Forskellige undersøgelser har vist, at kvaliteten af frosne PbMs er afgørende for deres overlevelse, og en passende frysning teknik er nøglen til succes for efterfølgende analyser med de samme celler28,32. Ændring af protokollen kan udføres ved at fryse PbMs, hvilket giver fleksibilitet i den eksperimentelle opsætning, da tilgængeligheden af buffy frakker er normalt begrænset. En anden fordel ved at bruge frosne PbMs (i flere hætteglas) over frisk isolerede dem er, at de kan bruges i efterfølgende eksperimenter, selv efter 1 år. Dette mindsker det potentielle problem med afvigelser fra donor til donor, hvis dette er en ønsket eller påkrævet parameter i et forsøg.
Resultaterne af en sammenligning mellem laboratoriet, der er foretaget efter op til 13 måneder, viser, at PbM'er, når de opbevares korrekt i en flydende nitrogentank, kan anvendes over en lang periode uden nogen indvirkning på cellernes levedygtighed eller cellegenvinding33. Længere opbevaringstider (over 1 år) kan være mulige ved omhyggelig validering af cellernes levedygtighed og cellerespons, før du udfører et eksperiment. Desuden skal temperaturen i den flydende nitrogentank altid være stabil. Den vigtigste faktor, der påvirkede levedygtigheden af kryobevarede PbM'er, blev anset for at være DMSO-koncentration med en optimal koncentration på 10-20 % (v/v)28. For at minimere de potentielt skadelige virkninger af frysning tilsættes forskellige kilder til proteiner, FBS eller BSA (med en bred vifte af koncentration fra 40% op til 100 %34)ofte til frysemediet som naturlige beskyttende komponenter, der kan øge celleres overlevelsen.
På grund af DMSO's høje cytotoksiske potentiale anbefales det først at dispergere PBM'er i FBS og derefter tilføje DMSO til PbM'er, der allerede er spredt i FBS. Især selv om højere FBS-koncentrationer (>40%) viste ingen forbedring af cellernes levedygtighed, men de forvolde ikke skade på cellerne28. Ikke desto mindre, frysning monocytter er en mulig tilgang til at overvinde spørgsmål af begrænset buffy pels tilgængelighed. Men hvis brugen af MDDCs og MDM'er fra friske PBM'er ønskes, kan immuncellerne differentieres og anvendes 5-8 dage efter isolation7,,16,,17,,35,36,37. Hvis eksperimentel planlægning tillader det, anbefales det at skelne mindst 6 dage i både MDDC'er og MDM'er. Men konsistens mellem forskellige gentagelser i det samme eksperiment, sammen med rutinemæssige inspektioner af deres specifikke overflade markør udtryk, er afgørende. Reaktionsevnen over for en proinflammatorisk stimulus, såsom LPS, efter differentieringstiden bør også kontrolleres regelmæssigt.
Mange undersøgelser ved hjælp af A549 celle linje er blevet udført på ALI, enten som en monokultur eller kombineret med andre celletyper (makrofager, dendritiske celler, eller fibroblaster) i 3D coculture model22,24,29,38. Ved hjælp af denne 3D-samkulturmodel er cytotoksicitet, oxidativ stress eller proinflammatoriske virkninger af (nano)materialer blevet undersøgt i op til 72 h1,17,21,24,29. Modellens lighed med in vivo væv er tidligere blevet undersøgt baseret på konfokale laserscanning imaging af model16. Ved samling af modellen, er det vigtigt at overveje både celleprolifeion (som kan påvirke A549 i den model, der præsenteres her) samt udførelsen af de primære (ikke prolifererende) immunceller (her, MDDCs og MDM'er). Det er også vigtigt at overveje, at ikke alle CD14 positive monocytter differentierer sig i MDDC'er og MDM'er, og at cellerne kan være til stede i både vedlagte og suspenderede former. Baseret på karakteren af coculture forsamling (her, begge celletyper nødt til at knytte til den eksisterende epitellag), anbefales det kun at bruge den klæbende sub-populationer af begge immuncelletyper. Derudover har rutinemæssige analyser af monocytter, MDDC og MDM monokultur lydhørhed over for LPS, og udtryk for specifikke overflade markører (CD14, CD163, CD86, CD93, eller CD206, data ikke vist) tyder på, at 6 og 7 dages differentiering er de optimale tidspunkter.
Selv om et realistisk antal alveolær epitelceller i humane lunger svarer til ~ 160.000 celler / cm2, er antallet af A549celler,der tælles i modellen ~ 1.000.000 celler /cm2 efter 9 dage dyrket på indsatsen16,18. Således skal denne in vitro-model begrænsninger overvejes. For det første blev tætheden af epitelceller etableret baseret på deres evne til at danne et sammenløbslag på den voksende membran. Det er også vigtigt at nævne, at A549 repræsenterer en epiteltype II-celle med en kuboid form, i modsætning til epiteltype I-celler, som er flade og udspread. På den anden side blev det krævede antal immunceller etableret på grundlag af litteraturen og præsenteret i denne protokol som cellenummer/overfladeområde39,,40,41. Celletætheden af MDDC'er i området 400 celler/mm2 (4 celler/cm2)16 kan sammenlignes med den stabile celletæthed på 500-750 celler/mm2 (5- 7 celler/cm2) rapporteret fra in vivo-studie39. Tætheden af MDM'er i denne model ligger inden for samme område af in vivo-situationen i den menneskelige alveolær region40.
Ældre makrofag markør farvning (25F9) blev observeret både i den apikale side (hvor MDMs er til stede) samt basal side (dvs. på det sted, hvor dendritiske celler). Translokation af immunceller gennem membranen skær porer er muligt og er også blevet observeret ved hjælp af denne model16, som kan forklare de observerede forskelle i farvning intensiteter. En anden mulig forklaring er dog, at den modne makrofagmarkør også kan udtrykkes på dendritiske celler, men udtrykket er meget donorspecifik42. Desuden er intensiteten af 25F9-udtrykket meget højere i MDMs (Figur 7, Figur 8). Begge proinflammatoriske stimuli (LPS og TNF-α) påvirkede integriteten af lungeepitelbarrieren i begge kokulturer (figur 7, figur 8). Dette var forventet baseret på tidligerepublikationer 43,44 viser,at proinflammatoriske cytokiner og bakterielle produkter forstyrre integriteten af epitelbarrierer.
Den 3D multicellulære model af den menneskelige alveolær epitel, etableret og karakteriserettidligere 17, har fungeret som et kraftfuldt og nyttigt redskab til vurdering af biologiske reaktioner (dvs. akutte proinflammatoriske reaktioner, oxidativstressrespons, partikelfordeling og cellulær kommunikation) in vitro21,24,25,45. Resultaterne bekræfter coculture modellers ansvar for at proinflammatoriske stimuli (her, LPS og TNF-α). Responsen blev lidt øget ved brug af immunceller fra friske PbMs; Der var imidlertid ingen statistisk signifikant forskel mellem cocultures ved hjælp af friske kontra optøede PbMs. Desuden var de proinflammatoriske reaktioner fra begge cokulturmodeller højere end dem, der blev dyrket i epitelcellemonokulturer under de samme (ALI) forhold. Kort sagt beskriver protokollen samlingen af en 3D human alveolær epitelvævskokulturmodel ved hjælp af enten friske eller optøede PbM'er til differentiering i MDMs og MDDCs. Det er vist, at begge modeller er meget lydhøre over for proinflammatoriske stimuli; De kan derfor fungere som effektive redskaber til potentielle risikovurderinger og toksicitetsvurderinger.

In vitro lungecellekulturer tilbyder omkostningseffektive, robuste og velkontrollerede platforme til at vurdere farerne ved aerosoler1. Som en model celle system for humane alveolær pneumocytter, epitel A549 celle linje isoleret fra en pulmonal adenocarcinom bruges ofte2. Disse celler repræsenterer planocellulær type II-epitelceller fra alveolær region3 og er en meget anvendt lungecellelinje til vurdering af farer ogtoksicitet 1,4,5,6,7,8,9,10. A549-cellelinjen har relevante træk ved alveolær epiteltype II-celler, såsom tilstedeværelsen af karakteristiske lamellarstoffer, der indeholder tætpakkede fosfolipider3.
Det er blevet påvist, at når cellerne dyrkes ved en luft-væske interface (ALI), overfladeaktivt stof frigives på den apikale side af luft-eksponerede epitelceller, reducere overfladespænding11,,12,13. Denne funktion er særlig vigtig i nanomateriale luftvejsrisiko og toksicitet undersøgelser. Når inhaleret nanomaterialer / toksikanter er deponeret i alveolær regionen, de først interagerer med lunge overfladeaktive og er fordrevet ved befugtning kræfter i den vandige hypofase, hvor samspillet med lungeceller finder sted14,15. Selv om A549 celler danner et monolag (som kan overgrow i flerlags på senere tidspunktpunkter, når de dyrkes på ALI) og producere overfladeaktive, en ulempe er deres utilstrækkelige stramme samling dannelse, hvilket resulterer i lav transepithelial elektrisk modstand værdier, men stadig udgør en funktionel barriere mod intercellulære (nano)partikler omplantning16,17,18.
I lungerne er der en række immuncellepopulationer, herunder fagocytiske og professionelle antigen-præsenterende celler (dvs. makrofager og dendritiske celler), der kommunikerer direkte gennem cellecellekontakt eller intercellulær signalering for at kontrollere og vedligeholde homøostase. Makrofager og dendritiske celler er kritiske medfødte immuneffektorer og initiativtagere til det adaptive immunrespons19. Dendritiske celler, der bor i eller under epitel, kan danne fremspring på tværs af epitel til lumen for at fange antigener. Alveolær makrofager er placeret på den apikale overflade af epitel og fungere som sentinel celler, der repræsenterer den første cellulære forsvar mod fremmed materiale samt bakterielle, virale og svampeinfektioner. Deres fænotopypiske plasticitet giver mulighed for hurtigt induktion af proinflammatoriske reaktioner som reaktion på sådanne stimuli samt at flytte til udløsende anti-inflammatoriske (dvs. hæmmende) reaktioner20.
For at simulere den humane alveolær epitelvævsbarriere etablerede vi en tredobbelt cokulturmodel med A549-celler suppleret med humane blodmoncytafledte makrofager (MDMs) og dendritiske celler (MDDCs) på de apiske basale og basale sider,henholdsvis 17. Dyrkning af denne model hos ALI er tidligere blevetrapporteret 16, endda op til 72 timer efter eksponering21. Akut immunrespons på kulstofnanorør eksponeringer blev væsentligt forbedret i cellekultur udsat for ALI i forhold til neddykkede betingelser22. Coculture model, dyrket og udsat for forskellige materialer på ALI, har tidligere været brugt til at undersøge cytotoksicitet, oxidativstress og inflammatoriske reaktioner på eksponering for zinkoxid,23 grafen-relateredematerialer 24, guldpartikler25,26, kulstof nanorør21, og vulkansk aske og diesel udstødning partikler27.
Endvidere er den vigtige rolle, som makrofager og dendritiske celler spiller som immuneffektorceller i en in vitro-lungemodel, blevet bekræftet. Især blev der kun observeret en øget proinflammatorisk respons i modellen ved tilstedeværelse af immunceller sammenlignet med monokultursystemer7. Potentielle ulemper ved at anvende primære monocytafledte immunceller er den begrænsede adgang til PbM'er samt donor-til-donor-variation. Som en løsning på disse potentielle ulemper, præsenteret her er en protokol, der indfører kryopræservering af frisk isolerede PBMs28 for cellekultur model forsamling. Formålet med denne undersøgelse er at demonstrere 3D human alveolær epitelvæv model samling, herunder isolering af PbMs fra menneskelige buffy frakker. Reaktionsevnen over for proinflammatoriske stimuli sammenlignes med modellen, der består af MDM'er og MDDC'er, der er differentieret fra friske PBM'er eller differentieret fra frosne/optøede PbM'er.
Arbejde med uprøvede humane blodprøver indebærer særlig pleje for at forhindre potentiel overførsel af smitsomme sygdomme, såsom HIV (human immundefekt virus), hepatitis B, og hepatitis C. Derfor er brugen af personlige beskyttelsesforanstaltninger såsom handsker, kjoler, masker og øjenbeskyttelse afgørende og skal være i overensstemmelse med principperne for god laboratoriepraksis. Disse beskyttelser reducerer risikoen for at udsætte huden eller slimhinderne for potentielt infektiøse væsker. For dem, der er involveret i håndtering af buffy coats og PbMs, vaccination mod hepatitis B-virus er obligatorisk, og blod titer niveauer af antistoffer anti-hepatitis B skal være over 100 IE / L (landespecifikke lovgivningsmæssige krav skal behandles). Desuden skal alt arbejde udføres i laboratorier på biosikkerhedsniveau 2 (landespecifikke lovkrav skal behandles). Der bør vedtages standardforanstaltninger for sundhed og sikkerhed i forbindelse med arbejde i et laboratoriemiljø og håndtering af cellekulturen for pattedyr, herunder håndtering af affald, når hele protokollen gennemføres.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchmark microplate reader</td>
			<td>does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Incubator</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container (for example Mr. Frosty)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>does not have to be specific, for example</td>
			<td>Zeiss LSM 710 meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatocytometer, or automatic cell counter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar bio-safety hood class II</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStand Macs (Macs Cell Separator)</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast inverted light microscope</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette boy, pipettors (different volumes)</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable small equipment/glassware</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353046 and 353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 &#956;m pore size</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapper</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass autoclaved Petri Dishes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>10040-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>A7030-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MicroBeads human - magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-097-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS, Norway</td>
			<td>1114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td>D5879_1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>E6758-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-093-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-095-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>4524-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 &#956;g/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 &#956;g/mL</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 &#956;g/mL</td>
			<td>Agrisera, Sweden</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 &#956;g/mL</td>
			<td>eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland</td>
			<td>14-0115-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 &#181;M</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab244204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment

En human alveolær celle coculture model er beskrevet her for simulering af alveolær epitelvæv barriere bestående af alveolær epitel type II celler og to typer af immunceller (dvs. humant monocyt-afledte makrofager [MDMs] og dendritiske celler [MDDCs]). Der findes en protokol til samling af den flercellede model. Alveolær epitelceller (A549 celle linje) dyrkes og differentieres under neddykkede forhold på gennemtrængelige skær i to-kammer brønde, derefter kombineret med differentierede MDMs og MDDCs. Endelig er cellerne udsat for en luft-væske interface i flere dage. Da humane primære immunceller skal isoleres fra menneskelige buffycoats, sammenlignes immunceller, der adskiller sig fra enten friske eller optøede monocytter, for at skræddersy metoden baseret på eksperimentelle behov. De tredimensionale modeller, der består af alveolær celler med enten nyisolerede eller optøede monocyt-afledte immunceller, viser en statistisk signifikant stigning i cytokin (interleukins 6 og 8) frigivelse ved eksponering for proinflammatoriske stimuli (lipopolysaccharid og tumornekrose faktor α) sammenlignet med ubehandlede celler. På den anden side er der ingen statistisk signifikant forskel mellem cytokin frigivelse observeret i cocultures. Dette viser, at den præsenterede model er lydhør over for proinflammatoriske stimuli i overværelse af MDMs og MDDCs differentieret fra friske eller optøede perifere blod monocytter (PbMs). Det er således et effektivt redskab til undersøgelser af akut biologisk reaktion på forskellige stoffer, herunder aerosoliserede lægemidler eller nanomaterialer.

Human lunge coculture modeller, der består af alveolær epitelceller og immunceller, blev samlet enten fra friske eller frosne MDDCs og MDMs progenitorer (her, menneskelige perifere blod-afledte monocytter). Som præsenteret i figur 1blev A549-celleret sået 3 dage efter det første afsnit med monocytisolering/optøning. Efter 6 dages differentiering, syntes de differentierede MDMs rundformet, mens MDDCs dannede en mere aflang form med observerbare fremspring. De optrådte også som agglomerater, især når de adskiller sig fra friske monocytter (Figur 2, Figur 3). Epitelceller dannede et tæt cellelag af celler efter 3 dages vækst på membranindsatser (Figur 4), da cokulturerne blev samlet. Efter 24 timers samling og yderligere 24 timer for at være udsat for ALI-betingelser blev cocultures forberedt til eksponeringer.
Reaktionsevne af 3D-celle kultur modeller blev undersøgt ved eksponering for kendte proinflammatoriske stimuli ved hjælp af en pseudo-ALI tilgang, som beskrevet tidligere29. De proinflammatoriske stimuli, LPS og TNF-α, blev tilsat i små mængder (100 μL) på den apikale overflade af den luftudsatte cellemodel. Sideløbende hermed blev fraværet af membranbrud som et mål for cytotoksicitet vurderet via LDH-analysen. En betydelig stigning i LDH frigivelse i CCM af de basale rum blev observeret ved udsættelse for den positive kontrol for membran brud, et vaskemiddel Triton-X 100 (Figur 5). Disse resultater viste, at modellen var lydhør over for et cytotoksisk stof, mens der ikke blev observeret nogen stigning i LDH-frigivelsen ved apikerstimulering med TNF-α eller LPS.
En mulig årsag til de forskellige målte værdier af LDH i de prøver, der er samlet med enten friske eller tidligere frosne PBM'er, kan tilskrives prøvelageret. Prøver fra friske PBM'er blev opbevaret i længere tid ved -80 °C; derfor kan aktiviteten af LDH-enzym falde. Især er LDH stabil i kun op til 4 dage i CCM; Således anbefales det at udføre analysen de seneste 2 dage efter indsamling af supernatanter. Alternativt er det muligt at fryse supernatanterne ned direkte efter afhentning. Det er dog vigtigt at overveje, at frysning kan nedsætte LDH's enzymatiske aktivitet.
Udskillelsen af proinflammatoriske mæglere (her, TNF-α og interleukins 6 [IL-6] og 8 [IL-8]) i den basale CCM blev kvantificeret via ELISA. Statistisk signifikante (p < 0,05, envejs ANOVA) blev der observeret stigninger i frigivelsen af IL-6 og IL-8 i både LPS- og TNF-α- behandlede prøver sammenlignet med respektive ubehandlede celler samt i de cellekulturmodeller, der er samlet fra enten PBM-kilde (Figur 6). Selv om koncentrationerne (pg/ml) af alle de testede cytokiner i det basale CCM var højere i kokulturerne bestående af friske PBM'er, var forskellene mellem de to kokulturer og monokulturer ikke statistisk signifikante (p > 0,05) (figur 6). For at bekræfte cokulturmodellernes merværdi med hensyn til en 2D-epitelcellekultur blev A549-monokulturer også udsat for LPS eller TNF-α. Som forventet var frigivelsen af alle undersøgte mæglere fra A549 monokulturer lavere sammenlignet med begge cokulturmodeller; selv om forskellen mellem dem ikke var statistisk signifikant (p > 0,05, envejs ANOVA).
Cellulær morfologi af 3D human alveolær epitelvævsbarriere blev vurderet via konfokal laserscanningmikroskopi (LSM). For at visualisere sammensætningen af hver model blev makrofager i cokulturmodellerne (MDMs) plettet med moden makrofagmærke 25F9. MDDCs blev plettet med CD83, som er en vigtig markør for aktiverede dendritiske celler30. Med hensyn til cellulær morfologi blev der ikke observeret nogen forskel mellem cokulturmodellerne ved hjælp af MDMs og MDDCs fra friske PBM'er sammenlignet med dem, der brugte optøede PbMs. I LPS- og TNF-α-eksponerede cokulturer, der begge består af friske og frosne immunceller, blev der observeret et forstyrret epitellag i LSM-billeder, hvilket ikke var tilfældet i ubehandlede celler (Figur 7, Figur 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig01.jpg"> Figur 1: Protokollens skematiske tidslinje. Præsentation af 3D-cokulturmodellens præparat, samling og anvendelse (eksponering for et testet stof). ALI = luft-væske interface, MDDCs = monocyt-afledte dendritiske celler, MDMs = monocyt-afledte makrofager, PBM = perifere blod monocytter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig02.jpg"> Figur 2: MdMs og MDDCs differentieret fra friske PBM'er. Fasekontrastmikroskopibillede af differentierede (A)MDD'er og(B)MDD'er fra friske PB'er (6 dage efter celleisolation). MDM'er er rundformede, mens MDDCs ofte observeres som agglomerater. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig03.jpg"> Figur 3: MDM'er og MDDCs adskiller sig fra frosne PB'er. Fasekontrastmikroskopibillede af differentierede (A)MDD'er og(B)MDDC'er fra optøede PB'er (6 dage efter optøning). MDM'er er rundformede, men nogle aflange celler kan observeres. MDDCs vises også rundformet med fremspring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig04.jpg"> Figur 4: Epitelceller vækst på membran skær. Fase-kontrast mikroskopi billede af sammenløbet A549 vokser på en membran indsætte 4 dage efter såning, danner et tæt lag af celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig05.jpg"> Figur 5: Cytotoksicitetsresultater undersøgt via membranbrudsbaseret (LDH)-analyse. Dataene præsenteres som en fold stigning i forhold til ubehandlede celler (gennemsnitlig ± SD, n = 3, stjerne betegner statistisk signifikant stigning i forhold til ubehandlede celler, ** p < 0,01, ****p < 0,0001). I grønne modeller er MDM'er og MDDCs fra friske PBM'er repræsenteret, og i lilla modeller, der er samlet fra optøede PbM'er, er de repræsenteret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig06.jpg"> Figur 6: Proinflammatoriske reaktioner i cocultures og monokulturer. De proinflammatoriske mæglere (TNF-α, IL-6 og IL-8) frigiver i cocultures efter 24 timers udfordring med LPS eller TNF-α. Dataene præsenteres som relative til ubehandlede celler (gennemsnitlig ± SD, n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). I grønne modeller er MDM'er og MDDCs fra friske PBM'er repræsenteret, og i lilla modeller, der er samlet fra optøede PbM'er, er de repræsenteret. Grå repræsenterer A549 monokulturer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig07.jpg"> Figur 7: Kosmorologi bestående af friske immunceller. LSM-billeder af apikale og basale sider af coculture-modellen med xz-projektioner af apikale sider af modellen ved hjælp af MDMs og MDDCs fra friske PBMs. Cyan repræsenterer nuclei (DAPI), magenta repræsenterer cytoskeleton (rhodamin-phalloidin), hvid repræsenterer MDMs (25F9), og grøn repræsenterer MDDCs (CD 83). Den hvide pil betegner MDM, mens den grønne pil betegner MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig08.jpg"> Figur 8: Kosmorologi bestående af frosne immunceller. LSM-billeder af den apikale side af coculture model med tilsvarende xz fremskrivninger, og basal side af modellen ved hjælp af MDMs og MDDCs fra optøede PBMs. Cyan repræsenterer nuclei (DAPI), magenta repræsenterer cytoskeleton (rhodamine-phalloidin), hvid repræsenterer MDMs (25F9), og grøn repræsenterer MDDCs (CD 83). Den hvide pil betegner MDM, mens den grønne pil betegner MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig08large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment at JoVE.com

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Præsenteret her er en protokol for primær human blod monocyt isolation samt deres differentiering i makrofager og dendritiske celler og samling med epitelceller i en multicellulær menneskelige lunge model. Biologiske reaktioner af cocultures bestående af immunceller differentieret fra enten frisk isolerede eller optøede monocytter, ved udsættelse for proinflammatoriske stimuli, sammenlignes.

Multicellulær human alveolær model sammensat af epitelceller og primære immunceller til farevurdering

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Disse individuelle menneskelige lydmodel bruger relevante immunceller som et effektivt redskab til at forudsige akut immunrespons af stoffer, herunder nanomaterialer og viden narkotika. Disse medicinske kombinerer menneskelige epitelceller og menneskelige primære immunceller til at vurdere disse specifikke reaktioner. Brugen af friske og frosne monocytter giver fleksibilitet til eksperimentplanen.Talrige undersøgelser har vist, at denne model kan give et indblik i den interstellare kommunikation mellem en adfærdssans og immunsans. Da denne demonstration indeholder alle de vigtige detaljer for studing modellen et personligt træk i cellekultur, visuelle instruktioner til at kopiere eksperimenter. Flere trin i blærens protokol er komplekse og kræver særlig håndtering.Derfor er de demonstreret med alle de nødvendige detaljer, at de let kan følges. For isolering af perifere blod monocytter fra menneskelige Buffy frakker, opdele høsten Buffy pelspose indhold, jævnt mellem 250 milliliter koniske rør. Medbring forsigtigt det samlede volumen i hvert rør 250 milliliter med PBS og bland rørene med tre blide inversioner.Derefter opdeles Buffy coat PBS-opløsningen ligeligt mellem fire nye 50 milliliterrør, og tilsæt derefter 10 mikroliter CD 14 positive magnetiske perler de syvende totalceller til røret og bland godt ved pipettering. Ved påfyldning løsnes pipetten fra pipetteren og tilsættes straks den øverste åbning af pipetten med en tommelfinger og derefter placeret den fyldte pipette i bunden af et rør og tag pipettens åbning ud for at tillade, at tæthedsgradientmed langsomt flyder under den buffy coat PBS-blanding, indtil en milliliter af tæthedens gradientmedium efterlades inde i pipetten. Når densitet gradient medium er blevet tilføjet til hvert rør på samme måde adskille cellerne ved densitet gradient centrifugering og bruge en serologisk pipette til opsamling af de hvide to til tre millimeter tykke perifere blodmonuklear cellelag fra mellem plasma og densitet gradient medium lag.Den bedste måde at forbinde laget på er at fjerne plasmaet først, og derefter undertrykker du vores logiske pipetter for at indsamle cellerne. Træk de perifere blodmonnuklede celler fra hvert sæt af to rør i et nyt 50 milliliterrør og vask cellerne to gange med et samlet volumen på 50 milliliter frisk PBS pr. vask. Derefter kasseres supernatant og opspnøre pipetten i hver i fem milliliter frisk PBS og pool cellesuspensionerne i et enkelt rør til optælling.Efter optælling centrifuge cellerne igen og resuspend den pelette til 80 milliliter magnetisk adskillelse buffer pr deltage i de syvende celler. Derefter tilsættes 10 mikroliter cd 14 positive magnetiske perler pr deltage i den syvende samlede celler til røret og bland godt ved pipettering. Efter en 15 minutters inkubation ved fire grader Celsius skylles en magnetisk søjle med tre milliliter magnetisk separationsbuffer og tilsæt cellerne til kolonnen.Kolonnen vaskes tre gange med tre milliliterbvolumen af buffer pr. vask, og kolonnen overføres til et 15 milliliterrør, der indeholder en milliliter frisk magnetisk separationsbuffer. Brug derefter stemplet og fem milliliter buffer til at skylle CD 14 positive celler ind i røret. Må fremkalde differentiering af den magnetiske perle isolerede CD 14 positive celler.Først skal cellerne resuspenderes på et enkelt tidspunkt, hvor de ler de seks celler pr. milliliterkoncentration i cellekulturmedium. Eller MDDC differentiering, tilsæt 10 nanogram pr. milliliter og af granulastedets makrofagkolonistimulerende faktor til røret og tilsæt tre milliliter celler til hver brønd af en seks brøndcellekulturplade, eller MDM-differentiering tilsættes 10 nanogram pr. milliliter makrofagkolonistilende faktor til cellerne og pladecellerne som netop påvist. For at oprette en human alveolær epitelcellevæv tredobbelt celle co-kultur model, først overføre 1,5 milliliter af præ-varm celle kultur medium i det passende antal Wells af en 12 brønd plade og placere en celle kultur indsætte i hver brønd.Dernæst tilsættes 500 mikroliter af epitelcellesuspension ved en tæthed på fem gange 10 til de femte celler pr. milliliter i den apikale side af hver indsats og dæk pladen til en fire dages inkubation i cellekulturkubvøsen. Eller MDDC såning erstatter supernatant fra Brøndene af seks brøndplader, der anvendes til MDDC differentiering, med en milliliter frisk varm celle kultur medium og bruge en celle skraber til at frigøre klæbende celler fra hver brønd. Vask hver brønd tre gange med superfæstet og i hver brønd og kombiner alle celleopløsningerne i et enkelt centrifugerør.Den høstede MDDC ved centrifugering og steril pincet til at placere skær fra de 12 brøndplader på hovedet i en steril petriskål. Skrab alle epitelceller fra indsætts basalside og opslæm mddc'erne i frisk cellekulturmedium, og en koncentration på 4,2 gange 10 af disse celler pr. milliliter. Derefter tilsættes 150 mikroliter celler på hver indsats, så hele indsatsens basale overflade er lige dækket med væsken uden bobler.For MDDM-såning efter høst af de differentierede MDDM'er som påvist for MDDC'erne fortyndes cellerne til en 2,5 gange 10 til de fire celler pr. milliliter frisk cellekulturmediumkoncentration, og der tilsættes 500 mikroliter celler ned ad væggen i hver epitelcelle og MDDC, der indeholder cellekulturindsats, og læg derefter låget på pladen og læg pladen i en cellekulturinkubator i 24 timer. Den næste dag aspirere supernatant fra både apical og basal områder af hver celle kultur indsætte og Wells. Så steriliserer du pincet til at løfte skær fra Brøndene og tilføje 600 mikroliter af frisk prewarm til cellekultur medium til hver brønd.Efter seks dages differentiering vises MDM'erne rundt i form, mens MDDCs danner klynger, der består af celler med en mere langstrakt form og observerbare fremspring. Efter tre dages vækst på membranskær danner epitelcellerne en tæt En betydelig stigning i laktatdehydrogenaseudgivelse i cellekulturmediet i det basale rum ved udsættelse for en positiv kontrol for membranbrud, hvilket beviser modellens reaktionsevne over for et cytotoksisk stof. Ingen stigning i laktatdehydrogenasefrigivelse målt ved apikande stimulation med TNF alpha eller LPS.Statistisk signifikante stigninger i frigivelsen af IL6 og IL8 observeres i både LPS og TNF alfabehandlede prøver sammenlignet med kontrol af ubehandlede celler. Der observeres ingen forskelle i cellemorfologi mellem de samkulturmodeller, der anvender MDDMs og MDDCs fra friske perifere blodmoncytter sammenlignet med dem, der anvender optøede celler i LPS og TNF alpha eksponeret co-kultur, blev der observeret et forstyrret epitellag. Det er muligt at bruge andre typer af menneskelige celler såsom luftveje eller bronchiolar celler, andre endepunkter kan også analyseres.Hovedsageligt forskere er blevet inspireret af denne teknik ved hjælp af en lignende til oprettet, men med forskellige celletyper.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

Tissues of the Human Body

SCIENTISTS IN ACTION

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naive voksne stamceller Isolering fra primære humane fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induktion og analyse af Epithelial til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Optimal lentivirus Produktion og Cell Culture nødvendige betingelser for at Succesfuld transducere Primary humane bronchieepithelceller

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Mikroinjektion i zebrafisk til model akut nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Et grafisk brugergrænseflade til softwareassisteret sporing af proteinkoncentration i dynamiske cellulære protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

In situ-monitorering af transitivt dannede molekylære Chaperone-samlinger i bakterier, gær og humane celler

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Isolering og berigelse af humane lungeepitelceller til organoidkultur

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...