Name: multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment
Uploaded: 2020-05-06T13:30:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment at JoVE.com

De auteurs willen Dr. Miguel Spuch-Calvar bedanken voor de cocultuurregeling in figuur 3 en dr. Bedia Begum Karakocak voor kritische lezing. Deze studie werd ondersteund door het PATROLS-project, het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. B.D. bedankt de stichting Peter und Traudl Engelhorn voor financiële steun.

De auteurs hebben niets te onthullen.

De opkomende productie van nieuwe materialen, waaronder chemicaliën en geneesmiddelen, verhoogt geleidelijk de behoefte aan voorspellende in vitro modellen. Om te voldoen aan de drie principes van vervanging, vermindering en verfijning van dierproeven32, zijn in vitro celmodellen krachtige instrumenten geworden met betrekking tot het vervangings- en reductieaspect voor het ophelderen van mechanismen van de werking van een geneesmiddel of materiaal8,9,10,11. Hier gepresenteerd is een gedetailleerd protocol van het assembleren van de meercellige model met behulp van immuuncellen die ofwel vers geïsoleerd of ontdooid van eerder bevroren monocyten. Ook beschreven is de teelt van het model bij ALI. Ten slotte illustreert het protocol een voorbeeld van blootstelling aan pro-inflammatoire stimuli en vergelijkt het de respons van de twee modellen die verse of bevroren monocyten bevatten.
Er zijn verschillende studies uitgevoerd om de toegevoegde waarde van de verbeterde complexiteit van de onder ALI-omstandigheden geteelde en blootgestelde modellen te bevestigen en te rechtvaardigen in vergelijking met conventionele blootstelling onder water7,22,31. Observatie van de hogere proinflammatoire respons in coculturen in vergelijking met monoculturen van epitheliale cellen bevestigen een eerdere studie. De studie gebruikte het gepresenteerde cocultuurmodel (gestimuleerd met LPS) en toonde een hogere respons op genexpressieniveaus van TNF en IL1B in vergelijking met het A549 monocultuur equivalent model7. Aan de andere kant vertoonden beide modellen hogere variaties binnen de gemeten pro-inflammatorische afgiftewaarden in vergelijking met A549-monoculturen. Dit kan worden verklaard door het gebruik van immuuncellen van verschillende donoren (buffy coats) binnen biologische herhalingen (d.w.z. één herhaling, één donor), zoals eerder getoond7. Indien gewenst kunnen de variaties tussen de replica's worden overwonnen door 1) met behulp van ontdooide PBM's van dezelfde donor of 2) het bundelen van PBM's van verschillende donoren voorafgaand aan het bevriezen van de cellen, dan vervolgens het latere gebruik van dezelfde pool in elke herhaling. Het opnemen van meer biologische herhalingen wordt ook aanbevolen.
De celbevriezingstechniek kan als een kritieke stap worden beschouwd; het is echter een veel voorkomende laboratoriumprocedure voor het behoud van cellen voor fenotypische en functionele analyse. Verschillende studies hebben aangetoond dat de kwaliteit van bevroren PBM's van vitaal belang is voor hun overleving, en een passende vriestechniek is de sleutel tot het succes van latere tests met dezelfde cellen28,32. Wijziging van het protocol kan worden uitgevoerd door het bevriezen van PBM's, die flexibiliteit biedt in de experimentele setup, omdat de beschikbaarheid van buffy jassen meestal beperkt is. Een ander voordeel van het gebruik van bevroren PBM's (in verschillende flesjes) ten opzichte van vers geïsoleerde, is dat ze ook na 1 jaar in latere experimenten kunnen worden gebruikt. Dit vermindert het potentiële probleem van donor-tot-donor variabiliteit als dit een gewenste of vereiste parameter is in een experimenteel.
Resultaten van een interlaboratoriumvergelijking die na maximaal 13 maanden is uitgevoerd, tonen aan dat PBM's, wanneer ze op de juiste wijze worden opgeslagen in een vloeibare stikstoftank, gedurende een lange periode kunnen worden gebruikt zonder enig effect op de levensvatbaarheid van cellen of celterugwinning33. Langere opslagtijden (meer dan 1 jaar) kunnen mogelijk zijn na zorgvuldige validatie van de levensvatbaarheid van de cel en de reactiesnelheid van de cel voordat u een experiment uitvoert. Ook moet de temperatuur in de vloeibare stikstoftank te allen tijde stabiel blijven. De belangrijkste factor die van invloed was op de levensvatbaarheid van cryopreserved PBM's bleek de DMSO-concentratie te zijn, met een optimale concentratie van 10%-20 % (v/v)28. Om potentieel schadelijke effecten van bevriezing tot een minimum te beperken, worden vaak verschillende bronnen van eiwitten, FBS of BSA (met een breed concentratiebereik van 40% tot 100 %34)aan het vriesmedium toegevoegd als natuurlijke beschermende componenten die de celoverleving kunnen verhogen.
Vanwege het hoge cytotoxische potentieel van DMSO wordt het aanbevolen om eerst PBM's in FBS te verspreiden en vervolgens DMSO toe te voegen aan PBM's die al in FBS zijn verspreid. Met name hoewel hogere FBS-concentraties (>40%) geen verbetering van de levensvatbaarheid van de cel, op hetzelfde moment, ze hebben geen schade toebrengen aan de cellen28. Niettemin, bevriezing monocyten is een mogelijke aanpak voor het overwinnen van kwesties van beperkte buffy jas beschikbaarheid. Als echter het gebruik van MDDC's en MDM's uit verse PBM's gewenst is, kunnen de immuuncellen 5-8 dagen na isolatie5-8 dagenna isolatie7,16,17,35,,36,37worden gedifferentieerdengebruikt . Als experimentele planning dit toelaat, wordt ten minste 6 dagen differentiatie in zowel MDDC's als MDM's aanbevolen. Echter, consistentie tussen de verschillende herhalingen in hetzelfde experiment, samen met routine-inspecties van hun specifieke oppervlak marker uitdrukkingen, zijn van cruciaal belang. Het reactievermogen op een pro-inflammatorische stimulus, zoals LPS, na de differentiatietijd moet ook regelmatig worden gecontroleerd.
Veel onderzoeken met behulp van de A549 cellijn zijn uitgevoerd op ALI, hetzij als een monocultuur of in combinatie met andere celtypes (macrofagen, dendritische cellen, of fibroblasten) in 3D cocultuur model22,24,29,38. Met behulp van dit 3D-cocultuurmodel zijn de cytotoxiciteit, oxidatieve stress of pro-ontstekingseffecten van (nano)materialen onderzocht tot 72 uur 1,1717,21,24,29. De gelijkenis van het model met in vivo weefsel is eerder onderzocht op basis van confocale laserscanning van het model16. Bij het samenstellen van het model is het belangrijk om zowel celproliferatie (die A549 in het hier gepresenteerde model kan beïnvloeden) als de prestaties van de primaire (niet zich vermenigvuldigende) immuuncellen (hier, MDDC's en MDMs) te overwegen. Het is ook belangrijk om te bedenken dat niet alle cd14 positieve monocyten zich onderscheiden in MDDC's en MDM's, en dat de cellen aanwezig kunnen zijn in zowel bijgevoegde als zwevende vormen. Op basis van de aard van de cocultuurassemblage (hier moeten beide celtypen zich hechten aan de bestaande epitheellaag), wordt het aanbevolen om alleen de aanhangende subpopulaties van beide immuunceltypen te gebruiken. Bovendien hebben routinematige analyses van monocyten, MDDC en MDM monocultuur responsiviteit op LPS en expressie van specifieke oppervlaktemarkers (CD14, CD163, CD86, CD93 of CD206, niet getoonde gegevens) gesuggereerd dat 6 en 7 dagen differentiatie de optimale tijdpunten zijn.
Hoewel een realistisch aantal alveolaire epitheelcellen in menselijke longen overeenkomt met ~ 160.000 cellen/cm2,is het aantal A549-cellen dat in het model wordt geteld ~ 1.000.000 cellen/cm2 na 9 dagen gekweekt op de wisselplaat16,18. De beperkingen van dit in vitromodel moeten dus in overweging worden genomen. Ten eerste werd de dichtheid van epitheelcellen vastgesteld op basis van hun vermogen om een samenvloeiende laag op het groeiende membraan te vormen. Het is ook belangrijk om te vermelden dat de A549 een epitheliale type II-cel vertegenwoordigt met een kuboïdale vorm, in tegenstelling tot epitheliale type I-cellen, die plat en verspreid zijn. Anderzijds werd op basis van de literatuur het vereiste aantal immuuncellen vastgesteld en in dit protocol gepresenteerd als celnummer/oppervlakte39,40,41. De celdichtheid van MDCDC's in het bereik van 400 cellen/mm2 (4 cellen/cm2)16 is vergelijkbaar met de steady-state celdichtheid van 500-750 cellen/mm2 (5- 7 cellen/cm2) gerapporteerd uit in vivo studies39. De dichtheid van MDM's in dit model is binnen hetzelfde bereik van in vivo situatie in de menselijke alveolator regio40.
Volwassen macrofaagmarkering (25F9) werd waargenomen zowel in de apicale kant (waar MDM's aanwezig zijn) als basale zijde (d.w.z. op de plaats van dendritische cellen). Translocatie van immuuncellen via het membraan wisselt poriën is mogelijk en is ook waargenomen met behulp van dit model16, die de waargenomen verschillen in kleuringsintensiteiten kan verklaren. Een andere mogelijke verklaring is echter dat de volwassen macrofaagmarker ook kan worden uitgedrukt op dendritische cellen, maar de uitdrukking is zeer donorspecifiek42. Ook is de intensiteit van de 25F9-expressie veel hoger in MDM's(figuur 7, figuur 8). Beide pro-epitlamerende stimuli (LPS en TNF-α) beïnvloedden de integriteit van de longepitheelbarrière in beide coculturen (figuur 7, figuur 8). Dit werd verwacht op basis van eerdere publicaties43,44 waaruit blijkt dat proinflammatory cytokines en bacteriële producten verstoren de integriteit van epitheelbarrières.
Het 3D meercellig model van het humane alveolaire epitheel, opgericht en eerder gekenmerkt17, heeft gediend als een krachtig en nuttig instrument voor de beoordeling van biologische reacties (d.w.z. acute proinflammatorische reacties, oxidatieve stressrespons, deeltjesdistributie en cellulaire communicatie) in vitro21,24,25,45. De resultaten bevestigen de verantwoordelijkheid van cocultuurmodellen op pro-inflammatorische stimuli (hier, LPS en TNF-α). De respons werd iets verhoogd bij het gebruik van immuuncellen van verse PBM's; Er was echter geen statistisch significant verschil tussen coculturen die verse vs. ontdooide PBM's gebruikten. Bovendien waren de proinflammatoire reacties van beide cocultuurmodellen hoger dan die van epitheliale celmonoculturen die onder dezelfde (ALI)-omstandigheden werden gekweekt. Samengevat beschrijft het protocol de assemblage van een 3D-epitheelweefselcocultuurmodel met verse of ontdooide PBM's voor differentiatie in MDMs en MDDC's. Het is aangetoond dat beide modellen zeer responsief zijn op pro-inflammatoire stimuli; daarom kunnen ze dienen als krachtige instrumenten voor mogelijke risico- en toxiciteitsbeoordelingen.

In vitro longcelculturen bieden kosteneffectieve, robuuste en goed gecontroleerde platforms om de gevaren van aerosolen te beoordelen1. Als modelcelsysteem voor menselijke alveolaire pneumocyten wordt de epitheel A549-cellijn geïsoleerd van een longadenocarcinoom vaak gebruikt2. Deze cellen vertegenwoordigen plaveiselcellen van type II uit alveolaire regio3 en zijn een veelgebruikte longcellijn voor de beoordeling van gevaar en toxiciteit1,4,5,6,7,8,9,10. De A549-cellijn beschikt over relevante kenmerken van epitheel type II-cellen van alveolaire stoffen, zoals de aanwezigheid van karakteristieke lamellenlichamen die dicht verpakte fosfolipidenbevatten 3.
Het is aangetoond dat wanneer de cellen worden gekweekt op een lucht-vloeibare interface (ALI), oppervlakteactieve agent wordt vrijgegeven aan de apicale kant van lucht-blootgestelde epitheelcellen, het verminderen van oppervlaktespanning11,12,13. Deze functie is met name belangrijk bij onderzoeken naar het gevaar en de toxiciteit van nanomaterialen. Zodra ingeademde nanomaterialen/toxicanten in het alveolaire gebied worden gedeponeerd, werken ze eerst samen met longentegenwerkzaam en worden ze door bevochtigingskrachten verplaatst in de waterige hypophase, waar de interactie met longcellen plaatsvindt14,15. Hoewel A549-cellen een monolaag vormen (die op latere termijnen kunnen overgroeien tot meerlaags wanneer ze bij ALI worden gekweekt) en oppervlakteactieve stoffen produceren, is een nadeel hun onvoldoende strakke verbindingsvorming, wat resulteert in lage transepitheliale elektrische weerstandswaarden, maar nog steeds een functionele barrière vormt tegen intercellulaire (nano)deeltjestranslocatie 16,17,18.
In de longen is er een verscheidenheid aan immuuncelpopulaties, waaronder fagocytische en professionele antigeen-presenterende cellen (d.w.z. macrofagen en dendritische cellen) die rechtstreeks communiceren via celcelcontact of intercellulaire signalering om homeostase te controleren en te behouden. Macrofagen en dendritische cellen zijn kritische aangeboren immuuneffectors en initiatiefnemers van de adaptieve immuunrespons19. Dendritische cellen die zich binnen of onder het epitheel bevinden, kunnen uitsteeksels vormen over het epitheel naar het lumen om antigenen te vangen. Alveolaire macrofagen bevinden zich op het apicale oppervlak van het epitheel en fungeren als schildwachtcellen, die de eerste cellulaire verdediging tegen vreemd materiaal en bacteriële, virale en schimmelinfecties vertegenwoordigen. Hun fenotypische plasticiteit maakt het mogelijk om snel pro-inflammatoire reacties in reactie op dergelijke stimuli te krijgen en te verschuiven naar ontstekingsremmende (d.w.z. remmende) reacties20.
Om de epitheelweefselbarrière van de menselijke alveolaire te simuleren, hebben we een drievoudig cocultuurmodel opgezet met A549-cellen aangevuld met menselijke bloedmonocyten-afgeleide macrofagen (MDM's) en dendritische cellen (MDDC's) aan de apicale en basale zijden, respectievelijk17. Teelt van dit model bij ALI is eerder gemeld16, zelfs tot 72 uur na blootstelling21. Acute immuunresponsen op blootstelling aan koolstofnanobuisjes werd aanzienlijk verbeterd in de celcultuur die aan de ALI werd blootgesteld in vergelijking met ondergedompelde omstandigheden22. Het cocultuurmodel, gekweekt en blootgesteld aan verschillende materialen bij ALI, is eerder gebruikt om cytotoxiciteit, oxidatieve stress en ontstekingsreacties te onderzoeken op blootstelling aan zinkoxide,23 grafeengerelateerde materialen24, gouden nanodeeltjes25,26, koolstofnanobuisjes21en vulkanische as- en dieseluitlaten27.
Bovendien is de belangrijke rol van macrofagen en dendritische cellen als immuuneffectorcellen in een in vitro menselijk longmodel bevestigd. In het bijzonder werd een verhoogde proinflammatorische respons in het model alleen waargenomen in aanwezigheid van immuuncellen in vergelijking met monocultuursystemen7. Mogelijke nadelen van het gebruik van primaire monocyten-afgeleide immuuncellen zijn de beperkte toegankelijkheid van PBM's en donor-tot-donor variatie. Als een oplossing voor deze potentiële nadelen, hier gepresenteerd is een protocol de invoering van cryopreservatie van vers geïsoleerde PBMs28 voor de cel cultuur model assemblage. Het doel van deze studie is om de 3D menselijke alveolaire epitheelweefsel model assemblage aan te tonen, met inbegrip van de isolatie van PBM's van menselijke buffy jassen. Het reactievermogen op pro-inflammatorische stimuli wordt vergeleken met het model dat bestaat uit MDM's en MDDC's die zich onderscheiden van verse PBM's of onderscheiden van bevroren/ontdooide PBM's.
Werken met ongeteste menselijke bloedmonsters omvat specifieke zorg om de mogelijke overdracht van infectieziekten te voorkomen, zoals HIV (human immunodeficiency virus), hepatitis B en hepatitis C. Daarom is het gebruik van persoonlijke beschermende maatregelen zoals handschoenen, toga's, maskers en oogbescherming van cruciaal belang en moet het in overeenstemming zijn met goede laboratoriumpraktijken. Deze bescherming vermindert het risico van het blootstellen van de huid of slijmvliezen aan potentieel besmettelijke vloeistoffen. Bovendien is vaccinatie tegen het hepatitis B-virus verplicht voor degenen die betrokken zijn bij de behandeling van buffycoats en PBM's en bloedtiterniveaus van antilichamen tegen hepatitis B (landspecifieke wettelijke vereisten moeten worden aangepakt). Bovendien moeten alle werkzaamheden worden uitgevoerd in laboratoria op bioveiligheidsniveau 2 (landspecifieke wettelijke vereisten moeten worden aangepakt). Bij het uitvoeren van het gehele protocol moeten standaard gezondheids- en veiligheidsmaatregelen worden vastgesteld die verband houden met het werken in een laboratoriumomgeving en de behandeling van de celkweek van zoogdieren, met inbegrip van de verwerking van afval.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchmark microplate reader</td>
			<td>does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Incubator</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container (for example Mr. Frosty)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>does not have to be specific, for example</td>
			<td>Zeiss LSM 710 meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatocytometer, or automatic cell counter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar bio-safety hood class II</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStand Macs (Macs Cell Separator)</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast inverted light microscope</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette boy, pipettors (different volumes)</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable small equipment/glassware</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353046 and 353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 &#956;m pore size</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapper</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass autoclaved Petri Dishes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>10040-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>A7030-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MicroBeads human - magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-097-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS, Norway</td>
			<td>1114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td>D5879_1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>E6758-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-093-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-095-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>4524-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 &#956;g/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 &#956;g/mL</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 &#956;g/mL</td>
			<td>Agrisera, Sweden</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 &#956;g/mL</td>
			<td>eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland</td>
			<td>14-0115-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 &#181;M</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab244204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment

Een menselijke alveolaire cel cocultuur model wordt hier beschreven voor simulatie van de alveolaire epitheelweefsel barrière bestaat uit alveolaire epitheel type II cellen en twee soorten immuuncellen (dat wil zeggen, menselijke monocyten afgeleide macrofagen [MDMs] en dendritische cellen [MDDC's]). Er is een protocol voor het samenstellen van het meercellige model aanwezig. Alveolaire epitheelcellen (A549-cellijn) worden gekweekt en gedifferentieerd onder ondergedompelde omstandigheden op doorlaatbare wisselplaten in tweekamerputten, vervolgens gecombineerd met gedifferentieerde MDM's en MDDC's. Ten slotte worden de cellen gedurende enkele dagen blootgesteld aan een lucht-vloeistofinterface. Aangezien menselijke primaire immuuncellen moeten worden geïsoleerd van menselijke buffy jassen, worden immuuncellen die zich onderscheiden van verse of ontdooide monocyten vergeleken om de methode op basis van experimentele behoeften op maat te maken. De driedimensionale modellen, samengesteld uit alveololische cellen met vers geïsoleerde of ontdooide monocyten-afgeleide immuuncellen, tonen een statistisch significante toename van cytokine (interleukineën 6 en 8) vrijkomen bij blootstelling aan proinflammatorische stimuli (lipopolysaccharide en tumor necrose factor α) in vergelijking met onbehandelde cellen. Aan de andere kant is er geen statistisch significant verschil tussen de cytokine-afgifte die in de coculturen wordt waargenomen. Hieruit blijkt dat het gepresenteerde model reageert op pro-inflammatoire stimuli in aanwezigheid van MDM's en MDDC's die zich onderscheiden van verse of ontdooide perifere bloedmonocyten (PBM's). Het is dus een krachtig instrument voor onderzoeken naar acute biologische respons op verschillende stoffen, waaronder aërosolen of nanomaterialen.

Menselijke longcocultuur modellen, samengesteld uit alveolaire epitheelcellen en immuuncellen, werden samengesteld uit verse of bevroren MDDC's en MDMs voorlopers (hier, menselijke perifere bloed-afgeleide monocyten). Zoals voorgesteld in figuur 1, werden A549 cellen 3 dagen na het eerste deel met monocytenisolatie/ontdooien gezaaid. Na 6 dagen van differentiatie verschenen de gedifferentieerde MDM's rondevormig, terwijl MDDC's een meer langwerpige vorm vorm vorm vormden met waarneembare uitsteeksels. Ze verschenen ook als agglomeraten, vooral wanneer ze werden onderscheiden van verse monocyten (figuur 2, figuur 3). Epitheelcellen vormden een dichte cellaag van cellen na 3 dagen groei op membraaninsert(figuur 4), toen de coculturen werden geassembleerd. Na 24 uur van de montage en een extra 24 uur van wordt onderworpen aan ALI voorwaarden, de coculturen werden voorbereid op blootstellingen.
Responsiviteit van de 3D-celkweekmodellen werd onderzocht bij blootstelling aan bekende proinflammatorische stimuli met behulp van een pseudo-ALI-benadering, zoals eerder beschreven29. De proinflammatorische stimuli, LPS en TNF-α, werden in lage volumes (100 μL) toegevoegd aan het apicale oppervlak van het luchtbelichte celmodel. Tegelijkertijd werd de afwezigheid van membraanbreuk als maatstaf voor cytotoxiciteit beoordeeld via LDH-test. Een aanzienlijke toename van de LDH-afgifte in CCM van het basale compartiment werd waargenomen bij blootstelling aan de positieve controle voor membraanbreuk, een wasmiddel Triton-X 100 (figuur 5). Deze resultaten bleken responsiviteit van het model op een cytotoxische stof, terwijl er geen toename van LDH-afgifte werd waargenomen bij apicale stimulatie met TNF-α of LPS.
Een mogelijke reden voor de verschillende gemeten waarden van LDH in de monsters die met verse of eerder bevroren PBM's zijn samengesteld, kan aan de monsteropslag worden toegeschreven. Monsters van verse PBM's werden langer opgeslagen bij -80 °C; daarom kan de activiteit van LDH-enzym dalen. Met name is LDH slechts 4 dagen stabiel in CCM; daarom wordt aanbevolen om de test uit te voeren de laatste 2 dagen na het verzamelen van de supernatants. Als alternatief is het mogelijk om de supernatants direct na het verzamelen te bevriezen. Het is echter belangrijk om te overwegen dat bevriezing de enzymatische activiteit van LDH kan verminderen.
De afscheiding van proinflammatorische bemiddelaars (hier, TNF-α en interleukins 6 [IL-6] en 8 [IL-8]) in de basale CCM werd gekwantificeerd via ELISA. Statistisch significante (p < 0,05, one-way ANOVA) stijgingen in de release van IL-6 en IL-8 werden waargenomen in zowel LPS- en TNF-α- behandelde monsters in vergelijking met de respectieve onbehandelde cellen, evenals in de celcultuur modellen samengesteld uit beide PBMs bron (figuur 6). Hoewel de concentraties (pg/mL) van alle geteste cytokinen in het basale CCM hoger waren in de coculturen die uit verse PBM's bestonden, waren de verschillen tussen de twee coculturen en monoculturen niet statistisch significant (p > 0,05) (figuur 6). Om de toegevoegde waarde van cocultuurmodellen met betrekking tot een 2D-epitheelcelcultuur te bevestigen, werden a549 monoculturen ook blootgesteld aan LPS of TNF-α. Zoals verwacht was de introductie van alle onderzochte bemiddelaars uit A549 monoculturen lager in vergelijking met beide coculture modellen; hoewel, het verschil tussen hen was niet statistisch significant (p > 0,05, one-way ANOVA).
Cellulaire morfologie van de 3D-epitheliale weefselbarrière van de mens werd beoordeeld via confocale laserscanny (LSM). Om de samenstelling van elk model te visualiseren, werden macrofagen binnen de cocultuurmodellen (MDM's) bevlekt met volwassen macrofaagmarkering 25F9. MDDC's werden gekleurd met CD83, wat een belangrijke marker is voor geactiveerde dendritische cellen30. Wat de cellulaire morfologie betreft, werd geen verschil waargenomen tussen de cocultuurmodellen die MDM's en MDDC's van verse PBM's gebruiken in vergelijking met die met ontdooide PBM's. In lps- en TNF-α-blootgestelde coculturen, beide samengesteld uit verse en bevroren immuuncellen, werd een verstoorde epitheliale laag in LSM-beelden waargenomen, wat niet het geval was in onbehandelde cellen(figuur 7, figuur 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische tijdlijn van het protocol. Presentatie van het 3D cocultuurmodel preparatuur, montage en toepassing (blootstelling aan een geteste stof). ALI = lucht-vloeibare interface, MDDC's = monocyten-afgeleide dendritische cellen, MDM's = monocyten-afgeleide macrofagen, PBM's = perifere bloedmonocyten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig02.jpg"> Figuur 2: MDM's en MDDC's onderscheiden zich van verse PBM's. Fasecontrastmicroscopiebeeld van gedifferentieerde (A) MDMs en (B)MDDC's uit verse PBM's (6 dagen na celisolatie). MDM's zijn ronde vormig, terwijl MDDC's vaak worden waargenomen als agglomeraten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig03.jpg"> Figuur 3: MDM's en MDDC's onderscheiden zich van bevroren PBM's. Fasecontrastmicroscopiebeeld van gedifferentieerde (A) MDMs en (B) MDDC's uit ontdooide PBM's (6 dagen na ontdooiing). MDMs zijn rondvormig, maar sommige langwerpige cellen kunnen worden waargenomen. MDC's verschijnen ook ronde vormig met uitsteeksels. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig04.jpg"> Figuur 4: Epitheelcellen groei op membraan inserts. Fase-contrast microscopie beeld van confluent A549 groeien op een membraan insert 4 dagen na het zaaien, de vorming van een dichte laag cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig05.jpg"> Figuur 5: Cytotoxiciteitsresultaten onderzocht via membraanbreukgebaseerde (LDH) test. De gegevens worden gepresenteerd als een vouwtoename ten opzichte van onbehandelde cellen (gemiddelde ± SD, n = 3, sterretje duidt statistisch significante toename ten opzichte van onbehandelde cellen, **p < 0,01, ****p < 0,0001). In groene modellen zijn MDM's en MDDC's van verse PBM's vertegenwoordigd en in paarse modellen die zijn samengesteld uit ontdooide PBM's worden vertegenwoordigd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig06.jpg"> Figuur 6: Proinflammatorische reacties in de coculturen en monoculturen. De proinflammatoroire bemiddelaars (TNF-α, IL-6 en IL-8) brengen in de cocultures uit na een 24-uurs uitdaging met LPS of TNF-α. De gegevens worden gepresenteerd ten opzichte van onbehandelde cellen (gemiddelde ± SD, n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). In groene modellen zijn MDM's en MDDC's van verse PBM's vertegenwoordigd en in paarse modellen die zijn samengesteld uit ontdooide PBM's worden vertegenwoordigd. Grijs vertegenwoordigt A549 monoculturen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig07.jpg"> Figuur 7: Morfologie van coculturen bestaande uit verse immuuncellen. LSM-afbeeldingen van apicale en basale zijden van het cocultuurmodel met xz-projecties van apicale zijden van het model met behulp van MDMs en MDDC's van verse PBM's. Cyan vertegenwoordigt nuclei (DAPI), magenta vertegenwoordigt cytoskelet (rhodamine-phalloidin), wit vertegenwoordigt MDMs (25F9), en groen vertegenwoordigt MDDC's (CD 83). De witte pijl geeft MDM aan, terwijl de groene pijl MDDC aangeeft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig08.jpg"> Figuur 8: Morfologie van coculturen bestaande uit bevroren immuuncellen. LSM-afbeeldingen van de apicale kant van het cocultuurmodel met overeenkomstige xz-projecties, en basale zijde van het model met MDMs en MDDCs van ontdooide PBM's. Cyan vertegenwoordigt kernen (DAPI), magenta vertegenwoordigt cytoskelet (rhodamine-phalloidin), wit vertegenwoordigt MDMs (25F9), en groen vertegenwoordigt MDDC's (CD 83). De witte pijl geeft MDM aan, terwijl de groene pijl MDDC aangeeft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment at JoVE.com

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Hier gepresenteerd is een protocol voor primaire menselijke bloed monocyten isolatie evenals hun differentiatie in macrofagen en dendritische cellen en assemblage met epitheliale cellen in een meercellige menselijke long model. Biologische reacties van coculturen bestaande uit immuuncellen onderscheiden van vers geïsoleerde of ontdooide monocyten, bij blootstelling aan pro-inflammatoire stimuli, worden vergeleken.

Meercellige human alveolaire model samengesteld uit epitheelcellen en primaire immuuncellen voor hazard assessment

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Deze individuele menselijke audio model maakt gebruik van relevante immuuncellen als een krachtig instrument om acute immuunrespons van stoffen, waaronder nanomaterialen en kennismedicijnen te voorspellen. Deze medische combineert menselijke epitheelcellen en menselijke primaire immuuncellen om die specifieke reacties te beoordelen. Het gebruik van verse en bevroren monocyten biedt flexibiliteit voor het experimentplan.Tal van studies hebben aangetoond dat dit model inzicht kan geven in de interstellaire communicatie tussen een gedragsgevoel en immuunzin. Aangezien deze demonstratie bevat alle belangrijke details voor studing het model een persoonlijke eigenschap in de celcultuur, visuele instructies om experimenten te repliceren. Verschillende stappen in het protocol van de blaas zijn complex en vereisen een speciale behandeling.Daarom worden ze gedemonstreerd met alle vereiste details dat ze gemakkelijk kunnen worden gevolgd. Voor de isolatie van perifere bloedmonocyten van menselijke Buffy lagen, splits de oogst Buffy jas zak inhoud, gelijkmatig tussen 250 milliliter conische buizen. Breng voorzichtig het totale volume in elke buis 250 milliliter met PBS en meng de buizen met drie zachte inversies.Splits vervolgens de Buffy coat PBS oplossing gelijkmatig over vier nieuwe 50 milliliter buizen, voeg dan 10 microliter cd 14 positieve magnetische kralen de zevende totale cellen aan de buis en meng goed door pipetting. Los bij het vullen de pipet los van de pipetter en stopte onmiddellijk de bovenste opening van de pipet met een duim en plaatste vervolgens de gevulde pipet aan de onderkant van één buis en haal de pipetopening los om het dichtheidsgradiënt medium langzaam onder het buffy coat PBS-mengsel te laten stromen, totdat er een milliliter van het dichtheidsgradiëntmedium in de pipet blijft. Wanneer het dichtheidsgradiëntmedium op dezelfde manier aan elke buis is toegevoegd, scheidt u de cellen per dichtheidsgradiëntcentrifugatie en gebruikt u een serologische pipet voor het verzamelen van de witte twee tot drie millimeter dikke perifere bloedmonopoliecellaag tussen het plasma en de gemiddelde lagen van het dichtheidsgradiënt.De beste manier om de laag aan te sluiten is om eerst het plasma te verwijderen en dan onderdrukt u onze logische pipetten om de cellen te verzamelen. Trek de perifere bloedmononucleaire cellen uit elke set van twee buizen in een nieuwe 50 milliliter buis en was de cellen twee keer met een totaal volume van 50 milliliter verse PBS per wasbeurt. Gooi vervolgens supernatant weg en zet de pipet in elk in vijf milliliter verse PBS weg en pool de celsuspensies in een enkele buis om te tellen.Na het tellen, centrifugeren de cellen opnieuw en resuspend de pelette tot 80 milliliter magnetische scheiding buffer per wonen aan de zevende cellen. Voeg vervolgens 10 microliters cd 14 positieve magnetische kralen per wonen de zevende totale cellen aan de buis en meng goed door pipetting. Na een incubatie van 15 minuten bij vier graden Celsius spoel een magnetische kolom met drie milliliters magnetische scheidingsbuffer en voeg de cellen toe aan de kolom.Was de kolom drie keer met drie milliliter buffervolumes per wasbeurt en breng de kolom over in een buis van 15 milliliter met een milliliter verse magnetische scheidingsbuffer. Gebruik vervolgens de zuiger en vijf milliliter buffer om de CD 14 positieve cellen in de buis te spoelen. Induceer differentiatie van de magnetische kraal geïsoleerde CD 14 positieve cellen.Ten eerste, resuspend de cellen op een keer wonen aan de zes cellen per milliliter concentratie in celcultuur medium. Of MDDC differentiatie, voeg 10 nanogram per milliliter van en van granula site macrofaag kolonie stimulerende factor aan de buis en voeg drie milliliter cellen aan elke put van een zes goed cel cultuur plaat, of MDM differentiatie toe te voegen 10 nanogram per milliliter van macrofaag kolonie stimulerende factor om de cellen en de plaat van de cellen zoals net aangetoond. Het opzetten van een menselijke alveolaire epitheelcelweefsel triple cel co-cultuur model, eerst overdracht 1,5 milliliter van pre-warme cel cultuur medium in het juiste aantal Putten van een 12 put plaat en plaats een cel cultuur invoegen in elke put.Voeg vervolgens 500 microliter epitheliale celsuspensie toe bij een dichtheid van vijf keer 10 aan de vijfde cellen per milliliter in de apicale kant van elke insert en bedek de plaat voor een vierdaagse incubatie in de celkweek incubator. Of MDDC zaaien vervangt supernatant van de Putten van zes goed platen gebruikt voor MDDC differentiatie, met een milliliter van verse warme cel cultuur medium en gebruik een cel schraper om de hechting cellen los te maken van elke put. Was elke put drie keer met de supernaat en in elke put en combineer alle celoplossingen in een enkele centrifugebuis.De geoogste MDDC door centrifugatie en steriele pincet om de inzetstukken van de 12 putplaten ondersteboven in een steriele petrischaal te plaatsen. Schraap alle epitheelcellen van de basale kant van de wisselplaat en resuspend de MDDC's in verse celcultuur medium doen een concentratie van 4,2 keer 10 van deze cellen per milliliter. Voeg vervolgens 150 microliter cellen toe aan elke wisselplaat, zodat het gehele basale oppervlak van de wisselplaat gelijk bedekt is met de vloeistof zonder bubbels.Voor MDDM-zaaiwerk na het oogsten van de gedifferentieerde MDDM's zoals aangetoond voor de MDDC's, verdun de cellen tot een 2,5 keer 10 tot de vier cellen per milliliter van verse celcultuur medium concentratie en voeg 500 microliter cellen langs de wand van elke epitheelcel en MDDC met celkweek insert, plaats dan het deksel op de plaat en plaats de plaat in een cel cultuur incubator voor 24 uur. De volgende dag aspirate de supernatant van zowel de apicale en basale gebieden van elke cel cultuur insert en Putten. Dan steriliseer je pincet om de wisselplaten uit de Putten te tillen en voeg 600 microliters van verse prewarm aan celcultuur medium om elke goed.Na zes dagen van differentiatie verschijnen de MDM's rond van vorm, terwijl MDDC's clusters vormen die bestaan uit cellen met een meer langwerpige vorm en waarneembare uitsteeksels. Na drie dagen van groei op membraaninsert, vormen de epitheelcellen een dichte A significante toename van lactaatdehydrogenaseafgifte wordt waargenomen in het celkweekmedium van het basale compartiment bij blootstelling aan een positieve controle voor membraanbreuk, waaruit blijkt dat het model reageert op een cytotoxische stof. Geen toename van lactaatdehydrogenase afgifte zoals gemeten bij apicale stimulatie met TNF alpha of LPS.Statistisch significante toenames in het vrijkomen van IL6 en IL8 worden waargenomen in zowel LPS- als TNF-alfabehandelde monsters in vergelijking met de controle onbehandelde cellen. Er worden geen verschillen in celmorfologie waargenomen tussen de co-cultuurmodellen die MDDM's en MDDC's van verse perifere bloedmonocyten gebruiken in vergelijking met die met ontdooide cellen in LPS en TNF alpha blootgestelde co-cultuur, een verstoorde epitheliale laag werd waargenomen. Het is mogelijk om andere soorten menselijke cellen te gebruiken, zoals luchtweg- of bronchiolarcellen, andere eindpunten kunnen ook worden geanalyseerd.Voornamelijk onderzoekers zijn geïnspireerd door deze techniek met behulp van een vergelijkbaar op te zetten, maar met verschillende celtypes.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

Tissues of the Human Body

SCIENTISTS IN ACTION

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primaire menselijke bronchiale epitheelcellen gegroeid van Explantaten

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Cultuur van primaire menselijke eileider epitheelcellen

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolatie van immuuncellen van primaire tumoren

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Volwassen stamcellen Isolatie van primaire humane fibroblastkweken

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Optimale Lentivirus Productie en Cultuur van de Cel voorwaarden die nodig zijn om succesvol te transduceren primaire humane bronchiale epitheelcellen

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

In situ monitoring van transitieve gevormde moleculaire Chaperone-assemblages in bacteriën, gist en menselijke cellen

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Isolatie en verrijking van menselijke longepitheelvoorlopercellen voor organoïde cultuur

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...