Name: multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment
Uploaded: 2020-05-06T13:30:00
Duration: 9 min 27 s
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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Miguel Spuch-Calvar pour le programme de coculture de la figure 3 et le Dr Bedia Begum Karakocak pour la lecture critique. Cette étude a été soutenue par le projet PATROLS, le programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de l’accord de subvention no 760813 et par la Fondation Adolphe Merkle. B.D. remercie la fondation Peter und Traudl Engelhorn pour son soutien financier.

Les auteurs n’ont rien à révéler.

La production émergente de nouveaux matériaux, y compris les produits chimiques et les médicaments, augmente progressivement le besoin de modèles in vitro prédictifs. Pour se conformer aux trois principes de remplacement, de réduction et de raffinement de l’expérimentation animale32, les modèles cellulaires in vitro sont devenus des outils puissants en ce qui concerne l’aspect remplacement et réduction pour élucider les mécanismes de l’action d’un médicament ou d’un matériau8,9,10,11. Présenté ici est un protocole détaillé d’assemblage du modèle multicellulaire à l’aide de cellules immunitaires qui sont soit fraîchement isolées ou décongelées à partir de monocytes préalablement congelés. La culture du modèle chez ALI est également décrite. Enfin, le protocole illustre un exemple d’exposition aux stimuli proinflammatoires et compare la réponse des deux modèles contenant des monocytes frais ou congelés.
Diverses études ont été réalisées pour confirmer et justifier la valeur ajoutée de la complexité accrue des modèles cultivés et exposés dans des conditions ALI par rapport à l’exposition immergée conventionnelle7,22,31. L’observation de la réponse proinflammatoire plus élevée dans les cocultures comparée aux monocultures des cellules épithéliales confirme une étude précédente. L’étude a utilisé le modèle de coculture présenté (stimulé par le LPS) et a montré une réponse plus élevée aux niveaux d’expression génique de TNF et d’IL1B par rapport au modèle équivalent de monoculture A5497. D’autre part, les deux modèles ont montré des variations plus élevées dans les valeurs mesurées de libération de médiateur proinflammatoire par rapport aux monocultures A549. Cela peut s’expliquer par l’utilisation de cellules immunitaires de différents donneurs (manteaux buffy) dans les répétitions biologiques (c.-à-d. une répétition, un donneur), comme indiqué précédemment7. Si vous le souhaitez, les variations entre les répliques peuvent être surmontées par 1) à l’aide de PBM décongelés du même donneur ou 2) la mise en commun des PBM de différents donneurs avant de geler les cellules, puis l’utilisation ultérieure du même pool dans chaque répétition. Il est également recommandé d’inclure plus de répétitions biologiques.
La technique de congélation cellulaire peut être considérée comme une étape critique; cependant, il s’agit d’une procédure de laboratoire courante pour la préservation des cellules pour l’analyse phénotypique et fonctionnelle. Diverses études ont démontré que la qualité des PBM congelés est essentielle à leur survie, et une technique de congélation appropriée est la clé du succès des essais ultérieurs avec les mêmes cellules28,32. La modification du protocole peut être effectuée par le gel des PBM, ce qui offre une flexibilité dans la configuration expérimentale, car la disponibilité des manteaux buffy est généralement limitée. Un autre avantage de l’utilisation de PBM congelés (dans plusieurs flacons) par rapport à ceux fraîchement isolés est qu’ils peuvent être utilisés dans des expériences ultérieures, même après 1 an. Cela diminue la question potentielle de la variabilité entre donneurs et donneurs s’il s’agit d’un paramètre souhaité ou requis dans un domaine expérimental.
Les résultats d’une comparaison interlaboratoire effectuée après un délai allant jusqu’à 13 mois montrent que les PBM, lorsqu’ils sont correctement stockés dans un réservoir d’azote liquide, peuvent être utilisés sur une longue période sans aucun effet sur la viabilité cellulaire ou la récupération cellulaire33. Des temps de stockage plus longs (plus d’un an) peuvent être possibles après une validation minutieuse de la viabilité cellulaire et de la réactivité des cellules avant d’effectuer une expérience. En outre, la température dans le réservoir d’azote liquide doit rester stable en tout temps. Le principal facteur affectant la viabilité des PBM cryopréservés s’est avéré être la concentration de DMSO, avec une concentration optimale de 10%–20 % (v/v)28. Pour minimiser les effets potentiellement nocifs de la congélation, différentes sources de protéines, FBS ou BSA (avec une large gamme de concentration de 40% à 100 %34)sont souvent ajoutées au milieu de congélation comme composants protecteurs naturels qui peuvent augmenter la survie cellulaire.
En raison du potentiel cytotoxique élevé de DMSO, il est recommandé d’abord de disperser les PBM dans FBS, puis d’ajouter DMSO aux PBM déjà dispersés dans FBS. Notamment, bien que des concentrations plus élevées de FBS (>40%) n’a montré aucune amélioration de la viabilité cellulaire, en même temps, ils n’ont pas causé de dommages aux cellules28. Néanmoins, la congélation des monocytes est une approche possible pour surmonter les problèmes de disponibilité limitée des couches de buffy. Toutefois, si l’utilisation de MDDCs et MDM à partir de PBM frais est souhaitée, les cellules immunitaires peuvent être différenciées et utilisées 5 à 8 jours après l’isolement7,16,17,35,36,37. Si la planification expérimentale le permet, il est recommandé d’avoir au moins 6 jours de différenciation dans les MDDC et les MDM. Cependant, la cohérence entre les différentes répétitions dans la même expérience, ainsi que les inspections de routine de leurs expressions spécifiques marqueur de surface, sont cruciales. La réactivité à un stimulus proinflammatoire, tel que le LPS, après le temps de différenciation doit également être vérifiée régulièrement.
De nombreuses études utilisant la lignée cellulaire A549 ont été réalisées à ALI, soit en monoculture, soit en combinaison avec d’autres types de cellules (macrophages, cellules dendritiques ou fibroblastes) dans le modèle de coculture 3D22,24,29,38. En utilisant ce modèle de coculture 3D, la cytotoxicité, le stress oxydatif ou les effets proinflammatoires des (nano-)matériaux ont été étudiés jusqu’à 72 h1,17,21,24,29. La ressemblance du modèle avec le tissu in vivo a déjà été étudiée sur la base de l’imagerie de balayage laser confocal du modèle16. Lors de l’assemblage du modèle, il est important de tenir compte à la fois de la prolifération cellulaire (qui peut affecter A549 dans le modèle présenté ici) ainsi que des performances des cellules immunitaires primaires (non proliférantes) (ici, les MDDCs et les MDM). Il est également important de considérer que tous les monocytes positifs CD14 ne se différencient pas en MDDCs et MDM, et que les cellules peuvent être présentes sous les formes attachées et suspendues. En fonction de la nature de l’assemblage de coculture (ici, les deux types de cellules doivent s’attacher à la couche épithéliale existante), il est recommandé d’utiliser uniquement les sous-populations adhérentes des deux types de cellules immunitaires. En outre, les analyses de routine des monocytes, de la réactivité à la monoculture du MDDC et de la MDM au SPL, et l’expression de marqueurs de surface spécifiques (CD14, CD163, CD86, CD93 ou CD206, données non montrées) ont suggéré que 6 et 7 jours de différenciation sont les délais optimaux.
Bien qu’un nombre réaliste de cellules épithéliales alvéolaires dans les poumons humains corresponde à ~160.000 cellules/cm2, le nombre de cellules A549 comptées dans le modèle est de ~1.000.000 cellules/cm2 après 9 jours cultivés sur l’insert16,18. Ainsi, les limites de ce modèle in vitro doivent être prises en considération. Tout d’abord, la densité des cellules épithéliales a été établie en fonction de leur capacité à former une couche confluente sur la membrane en croissance. Il est également important de mentionner que l’A549 représente une cellule épithéliale de type II avec une forme cuboïdale, contrairement aux cellules épithéliales de type I, qui sont plates et outspread. D’autre part, le nombre requis de cellules immunitaires a été établi sur la base de la littérature et présenté dans ce protocole comme numéro de cellule / surface39,40,41. La densité cellulaire des MDDC de l’ordre de 400 cellules/mm2 (4 cellules/cm2)16 est comparable à la densité cellulaire à état stable de 500–750 cellules/mm2 (5- 7 cellules/cm2) rapportées à partir d’études in vivo39. La densité des MDM dans ce modèle se situe dans la même gamme de situations in vivo dans la région alvéolaire humaine40.
Des taches de marqueurs macrophages matures (25F9) ont été observées à la fois dans le côté apical (où les MDM sont présents) ainsi que sur le côté basal (c.-à-d. à l’emplacement des cellules dendritiques). La translocation des cellules immunitaires par les pores d’insertions membranaires est possible et a également été observée à l’aide de ce modèle16, ce qui peut expliquer les différences observées dans les intensités de coloration. Cependant, une autre explication possible est que le marqueur de macrophage mature peut également être exprimé sur les cellules dendritiques, mais l’expression est fortement spécifique au donneur42. En outre, l’intensité de l’expression 25F9 est beaucoup plus élevée dans les MDM (Figure 7, Figure 8). Les deux stimuli proinflammatoires (LPS et TNF-α) ont affecté l’intégrité de la barrière épithéliale pulmonaire dans les deux cocultures (figure 7, figure 8). Cela était prévu sur la base des publications précédentes43,44 montrant que les cytokines proinflammatoires et les produits bactériens perturbent l’intégrité des barrières épithéliales.
Le modèle multicellulaire 3D de l’épithélium alvéolaire humain, établi et caractérisé précédemment17, a servi d’outil puissant et utile pour évaluer les réponses biologiques (c.-à-d. les réactions proinflammatoires aiguës, la réponse au stress oxydatif, la distribution des particules et la communication cellulaire) in vitro21,24,25,45. Les résultats confirment la responsabilité des modèles de coculture aux stimuli proinflammatoires (ici, LPS et TNF-α). La réponse a été légèrement augmentée lors de l’utilisation des cellules immunitaires des PBM frais ; cependant, il n’y avait pas de différence statistiquement significative entre les cocultures utilisant des PBM frais ou des PBM décongelés. En outre, les réactions proinflammatoires des deux modèles de coculture étaient plus élevées que celles des monocultures épithéliales cultivées dans les mêmes conditions (ALI). En résumé, le protocole décrit l’assemblage d’un modèle de coculture épithéliale alvéolaire humaine 3D utilisant des PBM frais ou décongelés pour la différenciation en MDM et MDDCs. Il est démontré que les deux modèles sont très sensibles aux stimuli proinflammatoires; par conséquent, ils peuvent servir d’outils puissants pour les évaluations potentielles des dangers et de la toxicité.

Les cultures de cellules pulmonaires in vitro offrent des plates-formes rentables, robustes et bien contrôlées pour évaluer les dangers des aérosols1. En tant que système cellulaire modèle pour les pneumocytes alvéolaires humains, la lignée épithéliale a549 isolée d’un adénocarcinome pulmonaire est souvent utilisée2. Ces cellules représentent des cellules épithéliales de type II squamous de la région alvéolaire3 et sont une lignée de cellules pulmonaires largement utilisée pour l’évaluation des risques et de la toxicité1,4,5,6,7,8,9,10. La lignée cellulaire A549 possède des caractéristiques pertinentes des cellules épithéliales alvéolaires de type II, telles que la présence de corps lamellaires caractéristiques contenant des phospholipides densément emballés3.
Il a été démontré que lorsque les cellules sont cultivées à une interface air-liquide (ALI), le surfactant est libéré sur le côté apical des cellules épithéliales exposées à l’air, réduisant la tension superficielle11,12,13. Cette caractéristique est particulièrement importante dans les enquêtes sur les risques respiratoires et la toxicité des nanomatériaux. Une fois que les nanomatériaux/substances toxiques inhalés sont déposés dans la région alvéolaire, ils interagissent d’abord avec le surfactant pulmonaire et sont déplacés par des forces mouillantes dans l’hypophase aqueuse, où l’interaction avec les cellules pulmonaires a lieu14,15. Même si les cellules A549 forment une monocouche (qui peut se superposer en multicouches à des délais ultérieurs lorsqu’elles sont cultivées à ALI) et produire du surfactant, un inconvénient est leur formation de jonction serrée insuffisante, résultant en de faibles valeurs de résistance électrique transepitheliale, mais présentant toujours une barrière fonctionnelle contre la translocation intercellulaire (nano)particules16,17,18.
Dans les poumons, il existe une variété de populations de cellules immunitaires, y compris les cellules phagocytiques et professionnelles présentant des antigènes (c.-à-d. les macrophages et les cellules dendritiques) qui communiquent directement par contact cellule-cellule ou signalisation intercellulaire pour contrôler et maintenir l’homéostasie. Les macrophages et les cellules dendritiques sont des effecteurs immunitaires innés critiques et des initiateurs de la réponse immunitaire adaptative19. Les cellules dendritiques résidant à l’intérieur ou sous l’épithélium peuvent former des protrusions à travers l’épithélium jusqu’au lumen pour attraper des antigènes. Les macrophages alvéolaires sont situés sur la surface apicale de l’épithélium et agissent comme cellules sentinelles, représentant la première défense cellulaire contre les matières étrangères ainsi que les infections bactériennes, virales et fongiques. Leur plasticité phénotypique permet l’induction rapide de réactions proinflammatoires en réponse à de tels stimuli ainsi que le déplacement dans le déclenchement des réactions anti-inflammatoires (c.-à-d. inhibiteurs)20.
Pour simuler la barrière du tissu épithélial alvéolaire humain, nous avons établi un modèle de coculture triple avec des cellules A549 complétées par des macrophages sanguins humains dérivés (MDM) et des cellules dendritiques (MDDCs) sur les côtés apical et basal, respectivement17. La culture de ce modèle à ALI a été précédemment signalé16, même jusqu’à 72 h post-exposition21. Les réponses immunitaires aiguës aux nanotubes de carbone ont été significativement améliorées dans la culture cellulaire exposée à l’ALI par rapport aux conditions submergées22. Le modèle de coculture, cultivé et exposé à différents matériaux chez ALI, a déjà été utilisé pour étudier la cytotoxicité, le stress oxydatif et les réponses inflammatoires lors des expositions à l’oxyde de zinc,23 matériaux liés au graphène24, nanoparticules d’or25,26, nanotubes de carbone21, et les cendres volcaniques et les particules d’échappement diesel27.
En outre, le rôle important des macrophages et des cellules dendritiques en tant que cellules effecteuses immunitaires dans un modèle de poumon humain in vitro a été confirmé. En particulier, une réponse proinflammatoire accrue dans le modèle n’a été observée qu’en présence de cellules immunitaires par rapport aux systèmes de monoculture7. Les inconvénients potentiels de l’utilisation des cellules immunitaires primaires dérivées des monocytes sont l’accessibilité limitée des PBM ainsi que la variation de donneur à donneur. Comme solution à ces inconvénients potentiels, présenté ici est un protocole introduisant la cryoconservation des PBMs28 fraîchement isolés pour l’assemblage du modèle de culture cellulaire. Le but de cette étude est de démontrer l’assemblage du modèle de tissu épithélial alvéolaire humain 3D, y compris l’isolement des PBM des manteaux buffy humains. La réactivité aux stimuli proinflammatoires est comparée au modèle composé de MMD et de MDDC différenciés des PBM frais ou différenciés des PBM congelés/décongelés.
Travailler avec des échantillons de sang humain non testés implique des soins spécifiques pour prévenir la transmission potentielle de maladies infectieuses, telles que le VIH (virus de l’immunodéficience humaine), l’hépatite B et l’hépatite C. Par conséquent, l’utilisation de mesures de protection individuelle telles que des gants, des robes, des masques et une protection oculaire sont cruciales et doivent être conformes aux principes de bonnes pratiques de laboratoire. Ces protections réduisent le risque d’exposer la peau ou les muqueuses à des liquides potentiellement infectieux. En outre, pour ceux qui s’occupent des manteaux et des PBM, la vaccination contre le virus de l’hépatite B est obligatoire, et les taux d’anticorps anti-hépatite B doivent être supérieurs à 100 UI/L (les exigences législatives spécifiques à chaque pays doivent être prises en compte). En outre, tous les travaux doivent être effectués dans les laboratoires de niveau 2 de biosécurité (les exigences législatives propres à chaque pays doivent être prises en compte). Des précautions standard s’visant à travailler en laboratoire et à manipuler la culture des cellules de mammifères, y compris la manipulation des déchets, devraient être adoptées lors de la conduite de l’ensemble du protocole.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchmark microplate reader</td>
			<td>does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Incubator</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container (for example Mr. Frosty)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>does not have to be specific, for example</td>
			<td>Zeiss LSM 710 meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatocytometer, or automatic cell counter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar bio-safety hood class II</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStand Macs (Macs Cell Separator)</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast inverted light microscope</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette boy, pipettors (different volumes)</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable small equipment/glassware</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353046 and 353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 &#956;m pore size</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapper</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass autoclaved Petri Dishes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>10040-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>A7030-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MicroBeads human - magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-097-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS, Norway</td>
			<td>1114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td>D5879_1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>E6758-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-093-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-095-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>4524-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 &#956;g/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 &#956;g/mL</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 &#956;g/mL</td>
			<td>Agrisera, Sweden</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 &#956;g/mL</td>
			<td>eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland</td>
			<td>14-0115-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 &#181;M</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab244204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment

Un modèle de coculture de cellules alvéolaires humaines est décrit ici pour la simulation de la barrière épithéliale alvéolaire composée de cellules épithéliales alvéolaires de type II et de deux types de cellules immunitaires (c.-à-d. les macrophages humains dérivés des monocytes [MDM] et les cellules dendritiques [MDDC]). Un protocole d’assemblage du modèle multicellulaire est fourni. Les cellules épithéliales alvéolaires (lignée cellulaire A549) sont cultivées et différenciées dans des conditions submergées sur des inserts perméables dans des puits à deux chambres, puis combinées avec des MDM et des MDDC différenciés. Enfin, les cellules sont exposées à une interface air-liquide pendant plusieurs jours. Comme les cellules immunitaires primaires humaines doivent être isolées des couches de buffy humaines, les cellules immunitaires différenciées des monocytes frais ou décongelés sont comparées afin d’adapter la méthode en fonction des besoins expérimentaux. Les modèles tridimensionnels, composés de cellules alvéolaires avec des cellules immunitaires nouvellement isolées ou décongelées dérivées des monocytes, montrent une augmentation statistiquement significative de la libération de cytokine (interleukines 6 et 8) lors de l’exposition à des stimuli proinflammatoires (lipopolysaccharide et facteur de nécrose tumorale α) par rapport aux cellules non traitées. D’autre part, il n’y a pas de différence statistiquement significative entre la libération de cytokine observée dans les cocultures. Cela montre que le modèle présenté est sensible aux stimuli proinflammatoires en présence de MDM et de MDDC différenciés des monocytes sanguins périphériques frais ou décongelés (PBM). Il s’agit donc d’un outil puissant pour l’étude de la réponse biologique aiguë à différentes substances, y compris les médicaments aérosols ou les nanomatériaux.

Les modèles de coculture pulmonaire humaine, composés de cellules épithéliales alvéolaires et de cellules immunitaires, ont été assemblés soit à partir de MDDCs frais ou congelés et de progéniteurs de MDM (ici, monocytes dérivés du sang périphérique humain). Comme il est présenté à la figure 1, les cellules A549 ont été ensemencées 3 jours après la première section impliquant l’isolement/dégel des monocytes. Après 6 jours de différenciation, les MDM différenciés sont apparus en forme de rond, tandis que les MDDC formaient une forme plus allongée avec des saillies observables. Ils sont également apparus comme des agglomères, surtout lorsqu’ils sont différenciés des monocytes frais (figure 2, figure 3). Les cellules épithéliales ont formé une couche cellulaire dense de cellules après 3 jours de croissance sur les inserts membranaires (figure 4), lorsque les cocultures ont été assemblées. Après 24 h d’assemblage et 24 h supplémentaires d’être soumis à des conditions d’ALI, les cocultures ont été préparées pour les expositions.
La réactivité des modèles de culture cellulaire 3D a été étudiée lors de l’exposition à des stimuli proinflammatoires connus à l’aide d’une approche pseudo-ALI, comme décrit précédemment29. Les stimuli proinflammatoires, LPS et TNF-α, ont été ajoutés en faibles volumes (100 μL) sur la surface apicale du modèle cellulaire exposé à l’air. En parallèle, l’absence de rupture de membrane comme mesure de cytotoxicité a été évaluée par l’essai de LDH. Une augmentation significative de la libération de LDH dans le CCM du compartiment basal a été observée lors de l’exposition au contrôle positif pour la rupture de membrane, un détergent Triton-X 100 (Figure 5). Ces résultats ont prouvé la réactivité du modèle à une substance cytotoxique, alors qu’aucune augmentation de la libération de LDH n’a été observée sur la stimulation aticale avec TNF-α ou LPS.
Une raison possible des différentes valeurs mesurées de la LDH dans les échantillons assemblés avec des PBM frais ou préalablement congelés peut être attribuée au stockage de l’échantillon. Les échantillons provenant de PBM frais ont été stockés plus longtemps à -80 °C; par conséquent, l’activité de l’enzyme LDH peut diminuer. Notamment, la LDH n’est stable que jusqu’à 4 jours en CCM; ainsi, il est recommandé d’effectuer l’essai les 2 derniers jours après la collecte des supernatants. Alternativement, il est possible de geler les supernatants directement après la collecte. Toutefois, il est important de considérer que le gel peut diminuer l’activité enzymatique de la LDH.
La sécrétion de médiateurs proinflammatoires (ici, TNF-α et interleukins 6 [IL-6] et 8 [IL-8]) dans le CCM basal a été quantifiée par l’intermédiaire d’ELISA. Des augmentations statistiquement significatives (p < 0,05, à sens unique ANOVA) dans la libération d’IL-6 et d’IL-8 ont été observées dans les échantillons traités par LPS et TNF-α par rapport aux cellules non traitées respectives, ainsi que dans les modèles de culture cellulaire assemblés à partir de l’une ou l’autre source de PBMs (figure 6). Bien que les concentrations (pg/mL) de toutes les cytokines testées dans le CCM basal aient été plus élevées dans les cocultures composées de PBM frais, les différences entre les deux cocultures et les monocultures n’étaient pas statistiquement significatives (p > 0,05) (figure 6). Pour confirmer la valeur ajoutée des modèles de coculture par rapport à une culture cellulaire épithéliale 2D, les monocultures A549 ont également été exposées au LPS ou au TNF-α. Comme prévu, la libération de tous les médiateurs étudiés des monocultures A549 était plus faible par rapport aux deux modèles de coculture; bien que la différence entre eux n’était pas statistiquement significative (p > 0,05, à sens unique ANOVA).
La morphologie cellulaire de la barrière épithéliale alvéolaire humaine 3D a été évaluée par microscopie de balayage de laser confocal (LSM). Pour visualiser la composition de chaque modèle, les macrophages dans les modèles de coculture (MDM) ont été tachés de marqueur de macrophage mature 25F9. Les MDDC ont été tachés de CD83, qui est un marqueur important pour les cellules dendritiques activées30. En ce qui concerne la morphologie cellulaire, aucune différence n’a été observée entre les modèles de coculture utilisant les MDM et les MDDC des PBM frais par rapport à ceux utilisant des PBM décongelés. Dans les cocultures exposées au LPS et au TNF-α, toutes deux composées de cellules immunitaires fraîches et congelées, on a observé une couche épithéliale perturbée dans les images de LSM, ce qui n’était pas le cas dans les cellules non traitées (Figure 7, Figure 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig01.jpg"> Figure 1 : Chronologie schématique du protocole. Présentation de la préparation, de l’assemblage et de l’application du modèle de coculture 3D (exposition à une substance testée). ALI = interface air-liquide, MDDCs = cellules dendritiques dérivées des monocytes, MDM = macrophages dérivés de monocytes, PBMs = monocytes sanguins périphériques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig02.jpg"> Figure 2 : MDM et MDDC se différencient des PBM frais. Image de microscopie de phase-contraste des MDM différenciés (A) et (B) MDDCs des PBM frais (6 jours après l’isolement cellulaire). Les MDM sont en forme de rond, tandis que les MDDC sont souvent observés comme des agglomères. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig03.jpg"> Figure 3 : MDM et MDDC se différencient des PBM congelés. Image de microscopie de phase-contraste des MDM différenciés (A) et (B) MDDCs des PBM décongelés (6 jours après la décongélation). Les MDM sont en forme de rond, mais certaines cellules allongées peuvent être observées. Les MDDC apparaissent également en forme de rond avec des protubérances. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig04.jpg"> Figure 4 : Croissance des cellules épithéliales sur inserts membranaires. Image de microscopie de phase-contraste de confluent A549 se développant sur un insert de membrane 4 jours après l’ensemencement, formant une couche dense de cellules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig05.jpg"> Figure 5 : Résultats de cytotoxicité étudiés par l’essai basé sur la rupture de membrane (LDH). Les données sont présentées sous forme d’augmentation du pli par rapport aux cellules non traitées (moyenne ± SD, n = 3, astérisque indique une augmentation statistiquement significative par rapport aux cellules non traitées, **p < 0,01, ****p < 0,0001). Dans les modèles verts, les MDM et les MDDC provenant de PBM frais sont représentés, et dans les modèles violets assemblés à partir de PBM décongelés sont représentés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig06.jpg"> Figure 6 : Réactions proinflammatoires dans les cocultures et les monocultures. Les médiateurs proinflammatoires (TNF-α, IL-6 et IL-8) libèrent dans les cocultures sur 24 h défi avec LPS ou TNF-α. Les données sont présentées comme relatives aux cellules non traitées (moyenne ± SD, n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). Dans les modèles verts, les MDM et les MDDC provenant de PBM frais sont représentés, et dans les modèles violets assemblés à partir de PBM décongelés sont représentés. Le gris représente les monocultures de l’A549. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig07.jpg"> Figure 7 : Morphologie des cocultures composées de cellules immunitaires fraîches. Images LSM des côtés apical et basaux du modèle de coculture avec xz projections des côtés apiques du modèle à l’aide de MDM et de MDM frais. Cyan représente des noyaux (DAPI), magenta représente le cytosquelette (rhodamine-phalloïdine), le blanc représente les MDM (25F9), et le vert représente les MDDC (CD 83). La flèche blanche désigne MDM, tandis que la flèche verte dénote MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig08.jpg"> Figure 8 : Morphologie des cocultures composées de cellules immunitaires congelées. Images LSM du côté apical du modèle de coculture avec les projections xz correspondantes, et côté basal du modèle utilisant MDMs et MDDC des PBMs décongelés. Cyan représente les noyaux (DAPI), le magenta représente le cytosquelette (rhodamine-phalloïdin), le blanc représente les MDM (25F9), et le vert représente les MDDC (CD 83). La flèche blanche désigne MDM, tandis que la flèche verte dénote MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Présenté ici est un protocole pour l’isolement primaire de monocyte de sang humain aussi bien que leur différenciation dans les macrophages et les cellules dendritiques et l’assemblage avec des cellules épithéliales dans un modèle humain multicellulaire de poumon. Les réponses biologiques des cocultures composées de cellules immunitaires différenciées des monocytes fraîchement isolés ou décongelés, lors de l’exposition à des stimuli proinflammatoires, sont comparées.

Modèle alvéolaire humain multicellulaire composé de cellules épithéliales et de cellules immunitaires primaires pour l’évaluation des risques

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Ces modèles audio humains individuels utilisent les cellules immunitaires pertinentes comme un outil puissant pour prédire la réponse immunitaire aiguë des substances, y compris les nanomatériaux et les médicaments de connaissance. Ces cellules médicales combinent les cellules épithéliales humaines et les cellules immunitaires primaires humaines pour évaluer ces réactions spécifiques. L’utilisation de monocytes frais et congelés offre une flexibilité pour le plan d’expérimentation.De nombreuses études ont montré que ce modèle peut fournir un aperçu de la communication interstellaire entre un sens du comportement et le sens immunitaire. Comme cette démonstration comprend tous les détails importants pour studing le modèle un trait personnel dans la culture cellulaire, des instructions visuelles pour reproduire des expériences. Plusieurs étapes du protocole de la vessie sont complexes et nécessitent une manipulation spéciale.Par conséquent, ils sont démontrés avec tous les détails requis qu’ils peuvent être facilement suivis. Pour l’isolement des monocytes sanguins périphériques des manteaux buffy humains, diviser la récolte Buffy contenu sac manteau, uniformément entre 250 millilitres tubes coniques. Apportez soigneusement le volume total dans chaque tube de 250 millilitres avec PBS et mélangez les tubes avec trois inversions douces.Ensuite, divisez la solution PBS manteau Buffy également entre quatre nouveaux tubes de 50 millilitres, puis ajouter 10 microlitres de CD 14 perles magnétiques positives les septièmes cellules totales au tube et bien mélanger par pipetting. Au moment du remplissage, détachez la pipette du pipetter et branchez immédiatement l’ouverture supérieure de la pipette avec un pouce, puis placez la pipette remplie au bas d’un tube et débranchez l’ouverture de la pipette pour permettre au gradient de densité moyen de circuler lentement sous le mélange de PBS de manteau bouffi, jusqu’à ce qu’un millilitre du milieu de gradient de densité soit laissé à l’intérieur de la pipette. Lorsque le milieu de gradient de densité a été ajouté à chaque tube de la même manière séparer les cellules par centrifugation gradient de densité et utiliser une pipette sérologique pour recueillir le blanc de deux à trois millimètres d’épaisseur couche cellulaire mononucléaire périphérique de sang entre le plasma et le gradient de densité couches moyennes.La meilleure façon de connecter la couche est d’enlever le plasma d’abord, puis vous supprimez nos pipettes logiques pour recueillir les cellules. Tirez les cellules mononucléaires périphériques de sang de chaque ensemble de deux tubes dans un nouveau tube de 50 millilitres et lavez les cellules deux fois avec un volume total de 50 millilitres de PBS frais par lavage. Puis jeter supernatant et resuspendre la pipette dans chacun en cinq millilitres de PBS frais et mettre en commun les suspensions cellulaires dans un seul tube pour le comptage.Après comptage, centrifugez les cellules à nouveau et résuspendez la pelette à 80 millilitres de tampon de séparation magnétique par s’occuper des septièmes cellules. Ajoutez ensuite 10 microlitres de perles magnétiques positives CD 14 par présence des septièmes cellules totales au tube et mélangez bien par pipetting. Après une incubation de 15 minutes à quatre degrés Celsius rincer une colonne magnétique avec trois millilitres de tampon de séparation magnétique et ajouter les cellules à la colonne.Lavez la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon par lavage et transférez la colonne dans un tube de 15 millilitres contenant un millilitre de tampon de séparation magnétique frais. Ensuite, utilisez le piston et cinq millilitres de tampon pour rincer les cellules CD 14 positives dans le tube. Induisez la différenciation de la perle magnétique isolée CD 14 cellules positives.Tout d’abord, resuspendre les cellules à une fois assister à la concentration de six cellules par millilitre dans le milieu de culture cellulaire. Ou la différenciation mddc, ajouter 10 nanogrammes par millilitre de et de granula site macrophage colonie facteur stimulant au tube et ajouter trois millilitres de cellules à chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de six puits, ou différenciation MDM ajouter 10 nanogrammes par millilitre de macrophage colonie facteur stimulant pour les cellules et plaquer les cellules comme vient de le démontrer. Pour mettre en place un modèle de co-culture de cellules épithéliales alvéoles humaines, transférez d’abord 1,5 millilitres de milieu de culture cellulaire préchauffée dans le nombre approprié de puits d’une plaque de puits de 12 puits et placez un insert de culture cellulaire dans chaque puits.Ajouter ensuite 500 microlitres de suspension cellulaire épithéliale à une densité de cinq fois 10 à la cinquième cellule par millilitre dans le côté apical de chaque insert et couvrir la plaque pour une incubation de quatre jours dans l’incubateur de culture cellulaire. Ou l’ensemencement MDDC remplace le supernatant des puits de six plaques de puits utilisées pour la différenciation mddc, par un millilitre de milieu de culture cellulaire chaude fraîche et utiliser un grattoir cellulaire pour détacher les cellules d’adhérence de chaque puits. Lavez chaque puits trois fois avec le superné et dans chaque puits et combinez toutes les solutions cellulaires en un seul tube de centrifugeuse.Le MDDC récolté par centrifugation et pinces stériles pour placer les inserts des 12 plaques de puits à l’envers dans une boîte de Pétri stérile. Gratter les cellules épithéliales du côté basal de l’insert et résuspendre les MDDC dans le milieu de culture cellulaire fraîche faire une concentration de 4,2 fois 10 de ces cellules par millilitre. Ajouter ensuite 150 microlitres de cellules sur chaque insert afin que toute la surface basale de l’insert soit également recouverte du liquide sans bulles.Pour l’ensemencement mddm après la récolte des MDDM différenciés comme démontré pour les MDDC, diluer les cellules à un 2,5 fois 10 aux quatre cellules par millilitre de concentration moyenne de culture cellulaire fraîche et ajouter 500 microlitres de cellules sur la paroi de chaque cellule épithéliale et MDDC contenant insert culture cellulaire, puis placer le couvercle sur la plaque et placer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures. Le lendemain aspirer le surnatant à la fois des zones apical et basales de chaque insert de culture cellulaire et Wells. Ensuite, vous stérilisez les pinces à épiler pour soulever les inserts des puits et ajouter 600 microlitres d’avant-guerre frais à la culture cellulaire moyenne à chaque puits.Après six jours de différenciation, les MDM apparaissent de forme ronde tandis que les MDDC forment des grappes composées de cellules à forme plus allongée et de saillies observables. Après trois jours de croissance sur les inserts membranaires, les cellules épithéliales forment une augmentation dense Une augmentation significative de la libération de déshydrogénase lactate est observée dans le milieu de culture cellulaire du compartiment basal lors de l’exposition à un contrôle positif de la rupture de la membrane, prouvant la réactivité du modèle à une substance cytotoxique. Aucune augmentation de la libération de déshydrogénase de lactate comme mesurée sur la stimulation apical avec TNF alpha ou LPS.Des augmentations statistiquement significatives de la libération d’IL6 et d’IL8 sont observées dans les échantillons traités par alpha LPS et TNF par rapport aux cellules non traitées témoins. Aucune différence dans la morphologie cellulaire n’est observée entre les modèles de co-culture utilisant des MDDM et des MDDC des monocytes sanguins périphériques frais comparés à ceux utilisant des cellules décongelées dans la co-culture exposée alpha de LPS et de TNF, une couche épithéliale perturbée a été observée. Il est possible d’utiliser d’autres types de cellules humaines telles que les voies respiratoires ou les cellules bronchiolar, d’autres points finaux peuvent également être analysés.Principalement les chercheurs ont été inspirés par cette technique en utilisant un similaire à mettre en place, mais avec différents types de cellules.

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