Name: multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment
Uploaded: 2020-05-06T13:30:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment at JoVE.com

Die Autoren danken Dr. Miguel Spuch-Calvar für das Cokulturprogramm in Abbildung 3 und Dr. Bedia Begum Karakocak für die kritische Lektüre. Diese Studie wurde durch das PATROLS-Projekt, das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 760813, und durch die Adolphe Merkle Foundation unterstützt. B.D. dankt der Stiftung Peter und Traudl Engelhorn für die finanzielle Unterstützung.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die aufkommende Produktion neuartiger Materialien, einschließlich Chemikalien und Medikamente, erhöht allmählich den Bedarf an prädiktiven In-vitro-Modellen. Um die drei Prinzipien des Austauschs, der Reduktion und der Verfeinerung von Tierversuchen32zu erfüllen, sind In-vitro-Zellmodelle zu leistungsstarken Werkzeugen in Bezug auf den Ersatz- und Reduktionsaspekt für die Aufklärung von Mechanismen der Wirkung eines Arzneimittels oder Materials8,9,10,11. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Zusammenstellung des mehrzelligen Modells mit Immunzellen vorgestellt, die entweder frisch isoliert oder aus zuvor eingefrorenen Monozyten aufgetaut sind. Ebenfalls beschrieben ist die Kultivierung des Modells bei ALI. Schließlich veranschaulicht das Protokoll ein Beispiel für die Exposition gegenüber entzündungshemmenden Reizen und vergleicht die Reaktion der beiden Modelle, die entweder frische oder gefrorene Monozyten enthalten.
Es wurden verschiedene Studien durchgeführt, um den Mehrwert der verbesserten Komplexität der unter ALI-Bedingungen angebauten und exponierten Modelle im Vergleich zur herkömmlichen Unterwasserexposition7,22,31zu bestätigen und zu rechtfertigen. Die Beobachtung der höheren proinflammatorischen Reaktion in Kokulturen im Vergleich zu Monokulturen von Epithelzellen bestätigt eine frühere Studie. Die Studie verwendete das vorgestellte Cokulturmodell (stimuliert mit LPS) und zeigte eine höhere Reaktion auf Genexpressionsniveaus von TNF und IL1B im Vergleich zum A549 Monokultur-Äquivalentmodell7. Andererseits zeigten beide Modelle höhere Schwankungen innerhalb der gemessenen proinflammatorischen Mediator-Freisetzungswerte im Vergleich zu A549-Monokulturen. Dies kann durch die Verwendung von Immunzellen verschiedener Spender (Buffy Coats) in biologischen Wiederholungen (d.h. eine Wiederholung, ein Spender) erklärt werden, wie zuvor gezeigt7. Auf Wunsch können die Variationen zwischen den Replikationen durch 1) mit aufgetauten PBMs desselben Spenders oder 2) Pooling PBMs von verschiedenen Spendern vor dem Einfrieren der Zellen, dann nachfolgende Verwendung des gleichen Pools in jeder Wiederholung überwunden werden. Es wird auch empfohlen, mehr biologische Wiederholungen zu verwenden.
Die Zellgefriertechnik kann als kritischer Schritt betrachtet werden; Es ist jedoch ein gängiges Laborverfahren zur Konservierung von Zellen für die phänotypische und funktionelle Analyse. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass die Qualität von gefrorenen PBMs lebenswichtig für ihr Überleben ist, und eine geeignete Gefriertechnik ist der Schlüssel zum Erfolg nachfolgender Tests mit den gleichen Zellen28,32. Die Änderung des Protokolls kann durch Einfrieren von PBMs durchgeführt werden, was Flexibilität im experimentellen Aufbau bietet, da die Verfügbarkeit von Buffy-Coats in der Regel begrenzt ist. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von gefrorenen PBMs (in mehreren Durchstechflaschen) gegenüber frisch isolierten ist, dass sie auch nach 1 Jahr in nachfolgenden Experimenten eingesetzt werden können. Dies verringert das potenzielle Problem der Variabilität von Spender zu Spender, wenn dies ein gewünschter oder erforderlicher Parameter in einem experimentellen ist.
Die Ergebnisse eines laborativen Vergleichs, der nach bis zu 13 Monaten durchgeführt wurde, zeigen, dass PBM, wenn sie ordnungsgemäß in einem flüssigen Stickstofftank gelagert werden, über einen langen Zeitraum ohne Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit oder die Zellrückgewinnung verwendet werden können33. Längere Speicherzeiten (über 1 Jahr) können bei sorgfältiger Validierung der Zelllebensfähigkeit und der Reaktionsfähigkeit der Zelle vor der Durchführung eines Experiments möglich sein. Außerdem muss die Temperatur im Flüssigstickstofftank jederzeit stabil bleiben. Der Hauptfaktor, der die Lebensfähigkeit von kryokonservierten PBM beeinflusste, war die DMSO-Konzentration mit einer optimalen Konzentration von 10 %–20 % (v/v)28. Um potenziell schädliche Auswirkungen des Einfrierens zu minimieren, werden dem Gefriermedium häufig verschiedene Proteinquellen, FBS oder BSA (mit einem breiten Konzentrationsbereich von 40 % bis 100 %34) als natürliche Schutzkomponenten zugesetzt, die das Zellüberleben erhöhen können.
Aufgrund des hohen zytotoxischen Potenzials von DMSO wird empfohlen, zunächst PBMs in FBS zu dispergieren und dann DMSO zu PBMs hinzuzufügen, die bereits in FBS verteilt sind. Bemerkenswert ist, dass höhere FBS-Konzentrationen (>40%) keine Verbesserung der Zelllebensfähigkeit zeigte, gleichzeitig verursachten sie keinen Schaden für die Zellen28. Nichtsdestotrotz ist das Einfrieren von Monozyten ein möglicher Ansatz, um Probleme mit begrenzter Verfügbarkeit von Buffy-Coatzulösen zu überwinden. Wenn jedoch die Verwendung von MDDCs und MDMs von frischen PBMs gewünscht wird, können die Immunzellen unterschieden und 5–8 Tage nach der Isolierung7,,16,17,35,36,37verwendet werden., Wenn die experimentelle Planung dies zulässt, wird eine Differenzierung von mindestens 6 Tagen sowohl in MDDCs als auch in MDMs empfohlen. Die Konsistenz zwischen verschiedenen Wiederholungen im selben Experiment sowie routinemäßige Inspektionen ihrer spezifischen Oberflächenmarkerausdrücke sind jedoch von entscheidender Bedeutung. Auch die Reaktionsfähigkeit auf einen proinflammatorischen Reiz wie LPS nach der Differenzierungszeit sollte regelmäßig überprüft werden.
Viele Untersuchungen mit der A549-Zelllinie wurden bei ALI durchgeführt, entweder als Monokultur oder in Kombination mit anderen Zelltypen (Makrophagen, dendritische Zellen oder Fibroblasten) in 3D-Kokulturmodell22,24,29,38. Mit diesem 3D-Kokulturmodell wurden die Zytotoxizität, oxidativer Stress oder die proinflammatorische Wirkung von (Nano-)Materialien für bis zu 72 h1,17,21,24,29untersucht. Die Ähnlichkeit des Modells mit In-vivo-Gewebe wurde zuvor anhand einer konfokalen Laserscanning-Bildgebung des Modells16untersucht. Bei der Montage des Modells ist es wichtig, sowohl die Zellproliferation (die A549 im hier vorgestellten Modell beeinflussen kann) als auch die Leistung der primären (nicht vermehrenden) Immunzellen (hier MDDCs und MDMs) zu berücksichtigen. Es ist auch wichtig zu berücksichtigen, dass nicht alle CD14-positiven Monozyten sich in MDDCs und MDMs unterscheiden und dass die Zellen sowohl in angehängter als auch in hängender Form vorhanden sein können. Basierend auf der Art der Cokultur-Assembly (hier müssen beide Zelltypen an die vorhandene Epithelschicht anhängen), wird empfohlen, nur die anhaftenden Subpopulationen beider Immunzelltypen zu verwenden. Darüber hinaus haben routinemäßige Analysen von Monozyten, MDDC und MDM-Monokulturreaktionsfähigkeit auf LPS und die Expression spezifischer Oberflächenmarker (CD14, CD163, CD86, CD93 oder CD206, nicht gezeigte Daten) ergeben, dass 6 und 7 Tage Differenzierung die optimalen Zeitpunkte sind.
Obwohl eine realistische Anzahl von Alveolaren-Epithelzellen in der menschlichen Lunge 160.000 Zellen/cm2entspricht, beträgt die Anzahl der im Modell gezählten A549-Zellen nach 9 Tagen, die auf dem Einsatz16,18kultiviert sind, 1.000.000 Zellen/cm2 . Daher müssen die Einschränkungen dieses In-vitro-Modells berücksichtigt werden. Zunächst wurde die Dichte der Epithelzellen auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, eine Konfluentschicht auf der wachsenden Membran zu bilden, festgestellt. Es ist auch wichtig zu erwähnen, dass die A549 eine epitheliale Typ-II-Zelle mit einer quaderförmigen Form darstellt, im Gegensatz zu epitheliaalen Typ-I-Zellen, die flach und überbreitsind sind. Andererseits wurde die erforderliche Anzahl von Immunzellen auf der Grundlage der Literatur festgelegt und in diesem Protokoll als Zellzahl/Oberfläche39,40,41dargestellt. Die Zelldichte von MDDCs im Bereich von 400 Zellen/mm2 (4 Zellen/cm2)16 ist vergleichbar mit der stationären Zelldichte von 500–750 Zellen/mm2 (5- 7 Zellen/cm2) aus in vivo Studien39berichtet. Die Dichte der MDMs in diesem Modell liegt innerhalb des gleichen Bereichs der In-vivo-Situation in der menschlichen Alveolarregion40.
Die reife Makrophagen-Markerfärbung (25F9) wurde sowohl auf der apikalen Seite (wo MDMs vorhanden sind) als auch auf der Basalseite (d. h. an der Stelle der dendritischen Zellen) beobachtet. Die Translokation von Immunzellen durch die Membran setzt Poren ein und wurde auch mit diesem Modell16beobachtet, was die beobachteten Unterschiede in den Färbeintensitäten erklären kann. Eine andere mögliche Erklärung ist jedoch, dass der reife Makrophagenmarker auch auf dendritischen Zellen ausgedrückt werden kann, aber der Ausdruck ist hochspenderspezifisch42. Außerdem ist die Intensität des 25F9-Ausdrucks in MDMs viel höher (Abbildung 7, Abbildung 8). Beide proinflammatorischen Reize (LPS und TNF-A) beeinträchtigten die Integrität der lungenepithelischen Barriere in beiden Kokulturen (Abbildung 7, Abbildung 8). Dies wurde auf der Grundlage früherer Veröffentlichungen43,44 erwartet, die zeigten, dass proinflammatorische Zytokine und bakterielle Produkte die Integrität von Epithelbarrieren stören.
Das mehrzellige 3D-Modell des menschlichen Alveolarenepithels, das zuvor17etabliert und charakterisiert wurde, diente als leistungsfähiges und nützliches Werkzeug zur Beurteilung biologischer Reaktionen (d. h. akute proinflammatorische Reaktionen, oxidative Stressreaktion, Partikelverteilung und zelluläre Kommunikation) in vitro21,24,25,45. Die Ergebnisse bestätigen die Reaktion von Cokulturmodellen auf proinflammatorische Reize (hier LPS und TNF-A). Die Reaktion wurde leicht erhöht, wenn Immunzellen aus frischen PBMs verwendet wurden; es gab jedoch keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen Kokulturen, die frische und aufgetaute PBM verwenden. Darüber hinaus waren die proflammatorischen Reaktionen beider Kokulturmodelle höher als die von Epithelzellmonokulturen, die unter den gleichen (ALI) Bedingungen kultiviert wurden. Zusammenfassend beschreibt das Protokoll die Zusammenstellung eines 3D-Human-Alveolar-Epithel-Gewebe-Cokulturmodells unter Verwendung von frischen oder aufgetauten PBMs zur Differenzierung in MDMs und MDDCs. Es wird gezeigt, dass beide Modelle sehr ansprechbar sind auf proinflammatorische Reize; daher können sie als leistungsfähige Instrumente für potenzielle Gefahren- und Toxizitätsbewertungen dienen.

In-vitro-Lungenzellkulturen bieten kostengünstige, robuste und gut kontrollierte Plattformen zur Beurteilung der Gefahren von Aerosolen1. Als Modellzellsystem für humane Alveolarpneumozyten wird häufig die epitheliale A549-Zelllinie verwendet, die aus einem pulmonalen Adenokarzinom isoliert ist2. Diese Zellen stellen Plattenepitheltyp II Epithelzellen aus dem Alveolarbereich3 dar und sind eine weit verbreitete Lungenzelllinie für die Gefahren- und Toxizitätsbewertung1,4,5,6,7,8,9,10. Die A549-Zelllinie besitzt relevante Merkmale von Alveolarepithel-Typ-II-Zellen, wie das Vorhandensein charakteristischer Lamellarenkörper, die dicht gepackte Phospholipideenthalten 3.
Es hat sich gezeigt, dass, wenn die Zellen an einer luft-flüssigen Schnittstelle (ALI) kultiviert werden, Tensid auf der apikalen Seite von luftexponierten Epithelzellen freigesetzt wird, wodurch die Oberflächenspannung11,12,13reduziert wird. Diese Eigenschaft ist besonders wichtig bei Untersuchungen von Atemwegsgefahren und Toxizitätdurchforschungen im Nanomaterial. Sobald inhalierte Nanomaterialien/Toxische Stoffe in der Alveolarregion abgelagert sind, interagieren sie zunächst mit pulmonalen Tensidunden und werden durch Benetzungskräfte in die wässrige Hypophase verdrängt, wo die Wechselwirkung mit Lungenzellen stattfindet14,15. Obwohl A549-Zellen eine Monoschicht bilden (die zu späteren Zeitpunkten in Mehrschichten überwuchern kann, wenn sie bei ALI kultiviert werden) und Tensid produzieren, ist ein Nachteil ihre unzureichende enge Knotenbildung, was zu niedrigen transepitheliaalen elektrischen Widerstandswerten führt, aber dennoch eine funktionelle Barriere gegen interzelluläre (Nano-)Partikeltranslokation16,17,18darstellt.
In der Lunge gibt es eine Vielzahl von Immunzellpopulationen, einschließlich phagozytärer und professioneller Antigen-präsentierender Zellen (d. h. Makrophagen und dendritische Zellen), die direkt durch Zell-Zell-Kontakt oder interzelluläre Signalisierung kommunizieren, um Homöostase zu kontrollieren und aufrechtzuerhalten. Makrophagen und dendritische Zellen sind kritische angeborene Immuneffektoren und Initiatoren der adaptiven Immunantwort19. Dendritische Zellen, die sich innerhalb oder unter dem Epithel befinden, können Vorsprünge über das Epithel zum Lumen bilden, um Antigene zu fangen. Alveolar-Makrophagen befinden sich auf der apikalen Oberfläche des Epithels und fungieren als Sentinelzellen, die die erste zelluläre Abwehr gegen Fremdmaterial sowie bakterielle, virale und Pilzinfektionen darstellen. Ihre phätotypische Plastizität ermöglicht eine schnelle Induktion von proflammatorischen Reaktionen als Reaktion auf solche Reize sowie die Verschiebung in auslösende entzündungshemmende (d.h. hemmende) Reaktionen20.
Um die menschliche Alveolaren-Epithel-Gewebebarriere zu simulieren, haben wir ein dreifaches Kokulturmodell mit A549-Zellen etabliert, die mit humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDMs) und dendritischen Zellen (MDDCs) auf den apikalen bzw. basalen Seitenergänztwurden. Der Anbau dieses Modells bei ALI wurde bereits gemeldet16, sogar bis zu 72 h nach der Exposition21. Akute Immunantworten auf Kohlenstoff-Nanoröhren-Expositionen wurden in der Zellkultur, die dem ALI ausgesetzt war, im Vergleich zu den untergetauchten Bedingungen signifikant verbessert22. Das Cokulturmodell, das bei ALI kultiviert und verschiedenen Materialien ausgesetzt wurde, wurde zuvor zur Untersuchung von Zytotoxizität, oxidativem Stress und Entzündungsreaktionen bei Exposition gegenüber Zinkoxid,23 Graphen-bezogenen Materialien24, Gold-Nanopartikel25,26, Kohlenstoff-Nanoröhren21und Vulkanasche- und Dieselabgaspartikeln27verwendet.
Darüber hinaus wurde die wichtige Rolle von Makrophagen und dendritischen Zellen als Immuneffektorzellen in einem in vitro menschlichen Lungenmodell bestätigt. Insbesondere wurde eine erhöhte entzündungshemmende Reaktion im Modell nur in Gegenwart von Immunzellen im Vergleich zu Monokultursystemen beobachtet7. Mögliche Nachteile der Verwendung primärer Monozyten-abgeleiteter Immunzellen sind die begrenzte Zugänglichkeit von PBM sowie die Variation von Spender zu Spender. Als Lösung für diese potenziellen Nachteile wird hier ein Protokoll vorgestellt, das die Kryokonservierung frisch isolierter PBMs28 für die Zellkulturmodellbaugruppe einführt. Ziel dieser Studie ist es, die 3D-Epithelgewebemodellbaugruppe des menschlichen Alveolar-Alveolens zu demonstrieren, einschließlich der Isolierung von PBM von menschlichen Buffy-Coats. Die Reaktionsfähigkeit auf proinflammatorische Reize wird mit dem Modell verglichen, das aus MDMs und MDDCs besteht, die sich von frischen PBMs oder von eingefrorenen/aufgetauten PBMs unterscheiden.
Die Arbeit mit nicht getesteten menschlichen Blutproben erfordert eine spezifische Sorgfalt, um die mögliche Übertragung von Infektionskrankheiten wie HIV (menschliches Immundefizienzvirus), Hepatitis B und Hepatitis C zu verhindern. Daher ist die Verwendung persönlicher Schutzmaßnahmen wie Handschuhe, Kleider, Masken und Augenschutz von entscheidender Bedeutung und muss den Grundsätzen der guten Laborpraxis entsprechen. Diese Schutzmaßnahmen reduzieren das Risiko, die Haut oder Schleimhäute potenziell infektiösen Flüssigkeiten auszusetzen. Darüber hinaus ist für diejenigen, die mit buffy Mänteln und PBMs zu tun haben, eine Impfung gegen das Hepatitis-B-Virus obligatorisch, und der Bluttiterspiegel von Antikörpern gegen Hepatitis B muss über 100 I.E./L liegen (länderspezifische gesetzliche Anforderungen müssen berücksichtigt werden). Darüber hinaus müssen alle Arbeiten in Laboratorien der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt werden (länderspezifische gesetzliche Anforderungen müssen berücksichtigt werden). Bei der Durchführung des gesamten Protokolls sollten Standardvorkehrungen im Zusammenhang mit der Arbeit in einer Laborumgebung und dem Umgang mit Säugetierzellen, einschließlich des Umgangs mit Abfällen, getroffen werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchmark microplate reader</td>
			<td>does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Incubator</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container (for example Mr. Frosty)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>does not have to be specific, for example</td>
			<td>Zeiss LSM 710 meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatocytometer, or automatic cell counter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar bio-safety hood class II</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStand Macs (Macs Cell Separator)</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast inverted light microscope</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette boy, pipettors (different volumes)</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable small equipment/glassware</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353046 and 353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 &#956;m pore size</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapper</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass autoclaved Petri Dishes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>10040-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>A7030-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MicroBeads human - magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-097-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS, Norway</td>
			<td>1114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td>D5879_1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>E6758-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-093-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-095-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>4524-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 &#956;g/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 &#956;g/mL</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 &#956;g/mL</td>
			<td>Agrisera, Sweden</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 &#956;g/mL</td>
			<td>eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland</td>
			<td>14-0115-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 &#181;M</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab244204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment

Ein menschliches Alveolar-Zell-Kokulturmodell wird hier für die Simulation der alveolären Epithelgewebebarriere beschrieben, die aus alveolaren Epithel-Typ-II-Zellen und zwei Arten von Immunzellen besteht (d. h. menschliche Monozyten-abgeleitete Makrophagen [MDMs] und dendritische Zellen [MDDCs]). Ein Protokoll zur Zusammenstellung des mehrzelligen Modells wird bereitgestellt. Alveolare Epithelzellen (A549-Zelllinie) werden unter getauchten Bedingungen auf durchlässigen Inserts in Zweikammerbrunnen angebaut und differenziert und dann mit differenzierten MDMs und MDDCs kombiniert. Schließlich werden die Zellen für mehrere Tage einer luft-flüssigen Schnittstelle ausgesetzt. Da menschliche primäre Immunzellen von menschlichen Buffy-Schichten isoliert werden müssen, werden Immunzellen, die sich von frischen oder aufgetauten Monozyten unterscheiden, verglichen, um die Methode auf der Grundlage experimenteller Bedürfnisse anzupassen. Die dreidimensionalen Modelle, die aus alveolären Zellen mit entweder frisch isolierten oder aufgetauten Monozyten-abgeleiteten Immunzellen bestehen, zeigen eine statistisch signifikante Zunahme der Zytokin-Freisetzung (Interleukins 6 und 8) bei Exposition gegenüber proinflammatorischen Reizen (Lipopolysaccharid und Tumornekrosefaktor) im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Andererseits gibt es keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen der zytokinen Freisetzung, die in den Kokulturen beobachtet wird. Dies zeigt, dass das vorgestellte Modell auf proinflammatorische Reize in Gegenwart von MDMs und MDDCs reagiert, die sich von frischen oder aufgetauten peripheren Blutmonozyten (PBMs) unterscheiden. Somit ist es ein leistungsfähiges Werkzeug für Untersuchungen der akuten biologischen Reaktion auf verschiedene Substanzen, einschließlich aerosolisierter Medikamente oder Nanomaterialien.

Menschliche Lungenkokulturmodelle, die aus alveolären Epithelzellen und Immunzellen bestehen, wurden entweder aus frischen oder gefrorenen MDDCs und MDMs-Vorläufern (hier menschliche periphere blutabgeleitete Monozyten) zusammengesetzt. Wie in Abbildung 1dargestellt, wurden A549-Zellen 3 Tage nach dem ersten Abschnitt mit Monozytenisolation/Auftauen ausgesät. Nach 6 Tagen Differenzierung erschienen die differenzierten MDB rund, während MDDCs eine längere Form mit beobachtbaren Vorsprüngen bildeten. Sie erschienen auch als Agglomerate, vor allem, wenn sie von frischen Monozyten unterschieden wurden (Abbildung 2, Abbildung 3). Epithelzellen bildeten nach 3 Tagen Wachstum auf Membraneinsätzen (Abbildung 4), als die Kokulturen zusammengesetzt wurden, eine dichte Zellschicht von Zellen. Nach 24 h Montage und weiteren 24 h ALI-Bedingungen wurden die Kokulturen für Expositionen vorbereitet.
Die Reaktionsfähigkeit der 3D-Zellkulturmodelle wurde bei Exposition gegenüber bekannten proinflammatorischen Reizen mit einem Pseudo-ALI-Ansatz untersucht, wie zuvorbeschrieben 29. Die proinflammatorischen Reize, LPS und TNF-A, wurden in geringen Volumina (100 l) auf die apikale Oberfläche des luftexponierten Zellmodells gesetzt. Parallel dazu wurde das Fehlen eines Membranbruchs als Maß für die Zytotoxizität mittels LDH-Assay beurteilt. Bei Exposition gegenüber der Positivkontrolle für Membranbruch, einem Waschmittel Triton-X 100 (Abbildung 5), wurde eine signifikante Zunahme der LDH-Freisetzung in CCM des Basalfachs beobachtet. Diese Ergebnisse erwiesen sich als Reaktionsfähigkeit des Modells auf eine zytotoxische Substanz, während bei der apikalen Stimulation mit TNF-A oder LPS keine Erhöhung der LDH-Freisetzung beobachtet wurde.
Ein möglicher Grund für die unterschiedlichen Messwerte von LDH in den Proben, die mit frischen oder zuvor gefrorenen PBMs montiert wurden, kann der Probenlagerung zugeschrieben werden. Proben von frischen PBMs wurden länger bei -80 °C gelagert; daher kann die Aktivität des LDH-Enzyms sinken. Insbesondere ist LDH nur für bis zu 4 Tage in CCM stabil; Daher wird empfohlen, den Test spätestens 2 Tage nach dem Sammeln der Überstande durchzuführen. Alternativ ist es möglich, die Überräube direkt nach der Abholung einzufrieren. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass das Einfrieren die enzymatische Aktivität von LDH verringern kann.
Die Sekretion von proinflammatorischen Mediatoren (hier TNF-A und Interleukins 6 [IL-6] und 8 [IL-8]) in das basale CCM wurde über ELISA quantifiziert. Statistisch signifikante (p < 0,05, einwegige ANOVA) Erhöhungen der Freisetzung von IL-6 und IL-8 wurden sowohl in LPS- und TNF---behandelten Proben im Vergleich zu den jeweiligen unbehandelten Zellen als auch in den Zellkulturmodellen beobachtet, die aus beiden PBM-Quellen zusammengesetzt wurden (Abbildung 6). Obwohl die Konzentrationen (pg/ml) aller getesteten Zytokine im Basal-CCM in den Kokulturen aus frischen PBM höher waren, waren die Unterschiede zwischen den beiden Kokulturen und Monokulturen statistisch nicht signifikant (p > 0,05) (Abbildung 6). Um den Mehrwert von Cokulturmodellen in Bezug auf eine 2D-Epithelzellkultur zu bestätigen, wurden a549-Monokulturen auch LPS oder TNF-A ausgesetzt. Wie erwartet war die Freisetzung aller untersuchten Mediatoren aus A549-Monokulturen im Vergleich zu beiden Cokulturmodellen geringer; obwohl der Unterschied zwischen ihnen statistisch nicht signifikant war (p > 0,05, einwegige ANOVA).
Die zelluläre Morphologie der 3D-Epithelgewebebarriere des menschlichen Alveolaren wurde mittels konfokaler Laserscanmikroskopie (LSM) untersucht. Um die Zusammensetzung der einzelnen Modelle zu visualisieren, wurden Makrophagen innerhalb der Cokulturmodelle (MDMs) mit dem ausgereiften Makrophagenmarker 25F9 befleckt. MDDCs wurden mit CD83 gefärbt, was ein wichtiger Marker für aktivierte dendritische Zellen30ist. In Bezug auf die zelluläre Morphologie wurde kein Unterschied zwischen den Cokulturmodellen mit MDMs und MDDCs von frischen PBMs im Vergleich zu denen beobachtet, die aufgetaute PBMs verwenden. In LPS- und TNF-exponierten Kokulturen, die beide aus frischen und gefrorenen Immunzellen bestehen, wurde eine gestörte Epithelschicht in LSM-Bildern beobachtet, was bei unbehandelten Zellen nicht der Fall war (Abbildung 7, Abbildung 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Zeitachse des Protokolls. Präsentation der Vorbereitung, Montage und Anwendung des 3D-Cokulturmodells (Exposition gegenüber einem geprüften Stoff). ALI = Luft-Flüssig-Schnittstelle, MDDCs = monozytenabgeleitete dendritische Zellen, MDMs = monozytenabgeleitete Makrophagen, PBMs = periphere Blutmonozyten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig02.jpg"> Abbildung 2: MDMs und MDDCs unterscheiden sich von frischen PBMs. Phasenkontrastmikroskopische Abbild von differenzierten (A) MDMs und (B) MDDCs von frischen PBMs (6 Tage nach Zellisolation). MDMs sind rundförmig, während MDDCs häufig als Agglomerate beobachtet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig03.jpg"> Abbildung 3: MDMs und MDDCs unterscheiden sich von eingefrorenen PBMs. Phasenkontrastmikroskopiebild von differenzierten (A) MDMs und (B) MDDCs von aufgetauten PBMs (6 Tage nach dem Auftauen). MDMs sind rundförmig, aber einige längliche Zellen können beobachtet werden. MDDCs erscheinen auch rundförmig mit Vorsprüngen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig04.jpg"> Abbildung 4: Epithelzellenwachstum auf Membraneinsätzen. Phasenkontrastmikroskopiebild des konfluenten A549, das 4 Tage nach der Aussaat auf einem Membraneinsatz wächst und eine dichte Zellschicht bildet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig05.jpg"> Abbildung 5: Cytotoxizitätsergebnisse, die mittels LDH-Assay (Membranrupturen) untersucht wurden. Die Daten werden als Faltenzunahme gegenüber unbehandelten Zellen dargestellt (Mittelwert sD, n = 3, Sternchen bezeichnen statistisch signifikanten Anstieg im Vergleich zu unbehandelten Zellen, **p < 0,01, ****p < 0,0001). In grünen Modellen werden MDMs und MDDCs von frischen PBMs dargestellt, und in violetten Modellen, die aus aufgetauten PBMs zusammengesetzt sind, werden mdMs und MDDCs von frischen PBMs dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig06.jpg"> Abbildung 6: Entzündungsreaktionen in den Kokulturen und Monokulturen. Die proinflammatorischen Mediatoren (TNF-, IL-6 und IL-8) geben in den Kokulturen bei 24 h Herausforderung mit LPS oder TNF-A frei. Die Daten werden relativ zu unbehandelten Zellen dargestellt (Mittelwert sD, n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). In grünen Modellen werden MDMs und MDDCs von frischen PBMs dargestellt, und in violetten Modellen, die aus aufgetauten PBMs zusammengesetzt sind, werden mdMs und MDDCs von frischen PBMs dargestellt. Grau steht für A549-Monokulturen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig07.jpg"> Abbildung 7: Morphologie von Kokulturen, die aus frischen Immunzellen bestehen. LSM-Bilder von apikalen und basalen Seiten des Cokulturmodells mit xz-Projektionen von apikalen Seiten des Modells mit MDMs und MDDCs von frischen PBMs. Cyan repräsentiert Kerne (DAPI), Magenta steht für Zytoskelett (Rhodamine-Phalloidin), weiß für MDMs (25F9) und grün für MDDCs (CD 83). Der weiße Pfeil bezeichnet MDM, während der grüne Pfeil MDDC bezeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig08.jpg"> Abbildung 8: Morphologie von Kokulturen, die aus gefrorenen Immunzellen bestehen. LSM-Bilder der apikalen Seite des Cokulturmodells mit entsprechenden xz-Projektionen und Basalseite des Modells mit MDMs und MDDCs von aufgetauten PBMs. Cyan repräsentiert Kerne (DAPI), Magenta steht für Zytoskelett (Rhodamine-Phalloidin), weiß für MDMs (25F9) und Grün für MDDCs (CD 83). Der weiße Pfeil bezeichnet MDM, während der grüne Pfeil MDDC bezeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Präsentiert wird hier ein Protokoll zur primären monozyten Isolation des menschlichen Blutes sowie deren Differenzierung in Makrophagen und dendritische Zellen und die Zusammenstellung mit Epithelzellen zu einem mehrzelligen menschlichen Lungenmodell. Biologische Reaktionen von Kokulturen, die sich aus Immunzellen zusammensetzen, die sich entweder von frisch isolierten oder aufgetauten Monozyten unterscheiden, werden bei Exposition gegenüber proinflammatorischen Reizen verglichen.

Multizelluläres humanes Alveolarmodell bestehend aus Epithelzellen und primären Immunzellen zur Gefahrenbeurteilung

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Dieses individuelle menschliche Audiomodell nutzt relevante Immunzellen als leistungsfähiges Werkzeug, um die akute Immunantwort von Substanzen wie Nanomaterialien und Wissensmedikamenten vorherzusagen. Diese Mediziner kombinieren menschliche Epithelzellen und menschliche primäre Immunzellen, um diese spezifischen Reaktionen zu bewerten. Die Verwendung von frischen und gefrorenen Monozyten bietet Flexibilität für den Experimentierplan.Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass dieses Modell einen Einblick in die interstellare Kommunikation zwischen Verhaltenssinn und Immunsinn geben kann. Da diese Demo alle wichtigen Details zum Anstollen des Modells als persönlicheEigenschaft in der Zellkultur enthält, werden visuelle Anweisungen zum Replizieren von Experimenten angezeigt. Mehrere Schritte im Blasenprotokoll sind komplex und erfordern eine besondere Handhabung.Daher werden sie mit allen erforderlichen Details demonstriert, dass sie leicht befolgt werden können. Zur Isolierung von peripheren Blutmonozyten von menschlichen Buffy-Schichten, teilen Sie die Ernte Buffy Mantel Beutel Inhalt, gleichmäßig zwischen 250 Milliliter konische Röhren. Bringen Sie vorsichtig das Gesamtvolumen in jede Röhre 250 Milliliter mit PBS und mischen Sie die Rohre mit drei sanften Inversionen.Dann teilen Sie die Buffy-Beschichtung PBS-Lösung gleichmäßig zwischen vier neuen 50-Milliliter-Röhren auf, fügen Sie dann 10 Mikroliter CD 14 positive magnetische Perlen die siebten Gesamtzellen in das Rohr und mischen Sie gut durch Pipettieren. Nach dem Befüllen die Pipette vom Pipetter lösen und sofort die obere Öffnung der Pipette mit einem Daumen stecken, dann die gefüllte Pipette an der Unterseite eines Rohres platziert und die Pipettenöffnung abziehen, damit dichtegradient mittel langsam unter die buffy Schicht PBS-Mischung fließen kann, bis ein Milliliter des Dichtegradientenmediums in der Pipette verbleibt. Wenn jedem Rohr ein Dichtegradientenmedium auf die gleiche Weise hinzugefügt wurde, trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation und verwenden Sie eine serologische Pipette, um die weiße zwei bis drei Millimeter dicke periphere mononukleäre Blutzellschicht zwischen dem Plasma und den mittleren Schichten des Dichtegradienten zu sammeln.Der beste Weg, die Schicht zu verbinden, ist, zuerst das Plasma zu entfernen und dann unsere logischen Pipetten zu unterdrücken, um die Zellen zu sammeln. Ziehen Sie die peripheren mononukleären Blutzellen aus jedem Satz von zwei Röhren in eine neue 50-Milliliter-Röhre und waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Gesamtvolumen von 50 Millilitern frischer PBS pro Wäsche. Dann überstand und die Pipette in jeweils fünf Millilitern frischer PBS wieder aufhängen und die Zellsuspensionen zum Zählen in ein einziges Rohr bündeln.Zentrifugieren Sie die Zellen nach dem Zählen wieder und setzen Sie die Pelette auf 80 Milliliter magnetischen Trennpuffer pro Uhr auf die siebten Zellen aus. Dann fügen Sie 10 Mikroliter CD 14 positive magnetische Perlen pro Besuchen Sie die siebte Gesamtzellen in das Rohr und mischen sie gut durch Pipettieren. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei vier Grad Celsius spülen Sie eine magnetische Säule mit drei Millilitern magnetischen Trennpuffer und fügen Sie die Zellen zur Säule hinzu.Waschen Sie die Säule dreimal mit drei Milliliter Puffervolumen pro Waschgang und übertragen Sie die Säule in ein 15-Milliliter-Rohr, das einen Milliliter frischen magnetischen Trennpuffer enthält. Verwenden Sie dann den Kolben und fünf Milliliter Puffer, um die CD 14-positiven Zellen in die Röhre zu spülen. Induzieren Sie eine Differenzierung der magnetischen, magnetisch isolierten CD 14-positiven Zellen.Erstens, resuspendieren die Zellen zu einem Mal kümmern sich um die sechs Zellen pro Milliliter Konzentration in Zellkultur Medium. Oder MDDC-Differenzierung, fügen Sie 10 Nanogramm pro Milliliter und von Granula-Site Makrophagen-Kolonie stimulierenden Faktor in die Röhre und fügen Sie drei Milliliter Zellen zu jedem Brunnen einer sechs Brunnen-Zell-Kulturplatte, oder MDM-Differenzierung fügen 10 Nanogramm pro Milliliter Makrophagen Kolonie stimulierenden Faktor zu den Zellen und Platte die Zellen, wie gerade gezeigt. Um ein menschliches Alveolar-Epithelzellgewebe-Dreizell-Kokulturmodell einzurichten, übertragen Sie zunächst 1,5 Milliliter vorwarmer Zellkulturmedium in die entsprechende Anzahl von Wells einer 12-Well-Platte und legen Sie einen Zellkultureinsatz in jeden Brunnen.Als nächstes 500 Mikroliter Epithelzellsuspension mit einer Dichte von fünf mal 10 zu den fünften Zellen pro Milliliter in die apikale Seite jedes Einsatzes geben und die Platte für eine viertägige Inkubation im Zellkultur-Inkubator bedecken. Oder MDDC-Saat ersetzt Überstand aus den Brunnen von sechs Brunnenplatten, die für die MDDC-Differenzierung verwendet werden, durch ein Milliliter frisches warmes Zellkulturmedium und verwendet einen Zellschaber, um die Haftzellen von jedem Brunnen zu lösen. Waschen Sie jeden Brunnen dreimal mit dem Supernate und in jedem Brunnen und kombinieren Sie alle Zelllösungen zu einem einzigen Zentrifugenrohr.Die geerntete MDDC durch Zentrifugation und sterile Pinzette, um die Einsätze aus den 12 Brunnenplatten kopfüber in einer sterilen Petrischale zu platzieren. Kratzen Sie alle Epithelzellen von der Basalseite des Inserts und suspendieren Sie die MDDCs im Frischzellkulturmedium und machen Sie eine Konzentration von 4,2 mal 10 dieser Zellen pro Milliliter. Dann fügen Sie 150 Mikroliter Zellen auf jeden Einsatz, so dass die gesamte Basaloberfläche des Einsatzes ist gleichermaßen mit der Flüssigkeit ohne Blasen bedeckt.Für die MDDM-Saat nach der Ernte der differenzierten MDDMs, wie für die MDDCs demonstriert, verdünnen Sie die Zellen auf 2,5 mal 10 auf die vier Zellen pro Milliliter Frischzellkultur mittlerer Konzentration und fügen Sie 500 Mikroliter Zellen an der Wand jeder Epithelzelle und MDDC mit Zellkultureinsatz hinzu, dann legen Sie den Deckel auf die Platte und legen Sie die Platte 24 Stunden lang in einen Zellkultur-Inkubator. Am nächsten Tag aspirieren Sie den Überstand sowohl aus den apikalen als auch aus den Basalbereichen jeder Zellkultureinfügung und Wells. Dann sterilisieren Sie Pinzette, um die Einsätze aus den Brunnen zu heben und fügen Sie 600 Mikroliter frische Vorwärme zu Zellkultur Medium zu jedem Brunnen.Nach sechs Tagen Differenzierung erscheinen die MDMs rund in Form, während MDDCs Cluster bilden, die aus Zellen mit einer längeren Form und beobachtbaren Vorsprüngen bestehen. Nach drei Tagen Wachstum auf Membraneinsätzen bilden die Epithelzellen eine dichte signifikante Erhöhung der Laktatdehydrogenasefreisetzung wird im Zellkulturmedium des Basalkomdes bei Exposition gegenüber einer positiven Kontrolle für Membranbruch beobachtet, was die Reaktionsfähigkeit des Modells auf eine zytotoxische Substanz beweist. Keine Erhöhung der Laktatdehydrogenase-Freisetzung, gemessen bei apikaler Stimulation mit TNF alpha oder LPS.Statistisch signifikante Zunahmen der Freisetzung von IL6 und IL8 werden sowohl in LPS- als auch in TNF-Alpha-behandelten Proben beobachtet, verglichen mit der Kontrolle unbehandelter Zellen. Es werden keine Unterschiede in der Zellmorphologie zwischen den Co-Kultur-Modellen mit MDDMs und MDDCs aus frischen peripheren Blutmonozyten beobachtet, verglichen mit denen, die aufgetaute Zellen in LPS und TNF alpha-exponierte Kokultur verwenden, eine gestörte Epithelschicht wurde beobachtet. Es ist möglich, andere Arten von menschlichen Zellen wie Atemwege oder Bronchiolarzellen zu verwenden, andere Endpunkte können auch analysiert werden.Hauptsächlich Forscher wurden von dieser Technik mit einem ähnlichen wie eingerichtet, aber mit verschiedenen Zelltypen inspiriert.

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Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primären humanen bronchialen Epithelzellen aus Explantaten Grown

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Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

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Ex vivo-Kultur von primären humanen Eileiter Epithelzellen

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NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

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