Name: multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment
Uploaded: 2020-05-06T13:30:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לד"ר מיגל ספוק-קאלבר על תוכנית החיים בדמות 3 ולד"ר בגם בגום קראקובאק על הקריאה הביקורתית. מחקר זה נתמך על ידי פרויקט PATROLS, תוכנית המחקר והחדשנות של האיחוד האירופי לשנת 2020 במסגרת הסכם מענק מס' 760813, ועל ידי קרן אדולף מרקל. בי.די. מודה לקרן פיטר וטראודל אנגלהורן על התמיכה הכספית.

לסופרים אין מה לחשוף.

ייצור מתפתח של חומרים חדשניים, כולל כימיקלים ותרופות, מגביר בהדרגה את הצורך בדגמי במבחנה חזוי. כדי לציית לשלושת העקרונות של החלפה,הפחתה, ועידון של ניסויים בבעלי חיים 32, במודלים של תאים במבחנה הפכו כלים רבי עוצמה לגבי היבט החלפה וצמצום עבור מנגנונים הבהרה של פעולה של תרופה או חומר8,9,10,11. מוצג כאן פרוטוקול מפורט של הרכבת המודל הרב תאי באמצעות תאים חיסוניים כי הם גם מבודד טרי או הפשיר מונוציטים קפואים בעבר. כמו כן מתואר הטיפוח של המודל ב-ALI. לבסוף, הפרוטוקול ממחיש דוגמה של חשיפה לגירויים דלקתיים ומשווה את התגובה של שני הדגמים המכילים מונוציטים טריים או קפואים.
מחקרים שונים בוצעו כדי לאשר ולהצדיק את הערך המוסף של המורכבות המשופרת של הדגמים שגדלו ונחשפו בתנאי ALI בהשוואהלחשיפה שקועה קונבנציונלית 7,22,31. התבוננות של התגובה הדלקתית גבוהה יותר בcocultures לעומת monocultures של תאים אפיתל לאשר מחקר קודם. המחקר השתמש במודל coculture שהוצג (מגורה עם LPS) והראה תגובה גבוהה יותר ברמות ביטוי גנים של TNF ו IL1B בהשוואה למודל המקבילה מונוקולטורה A5497. מצד שני, שני הדגמים הראו וריאציות גבוהות יותר בתוך ערכי שחרור מגשרדלקתי נמדד לעומת מונוקולטורה A549. ניתן להסביר זאת על ידי שימוש בתאים חיסוניים מתורמים שונים (מעילי באפי) בתוך חזרות ביולוגיות (כלומר, חזרה אחת, תורם אחד), כפי שהוצגקודם לכן 7. אם תרצה, ניתן להתגבר על הווריאציות בין המשכפלים על-ידי 1) באמצעות PBMs מפשירים מאותו תורם או 2) אחסון PBMs מתורמים שונים לפני הקפאת התאים, ולאחר מכן שימוש עוקב של אותה בריכה בכל חזרה. כמו כן מומלץ לכלול חזרות ביולוגיות נוספות.
טכניקת הקפאת התאים יכולה להיחשב כצעד קריטי; עם זאת, זהו הליך מעבדה נפוץ לשימור תאים לניתוח פנוטיפיק ופונקציונלי. מחקרים שונים הראו כי האיכות של PBMs קפוא חיוני להישרדותם, טכניקה הקפאה מתאימה היא המפתח להצלחה של בדיקות עוקבות עם אותם תאים28,32. שינוי הפרוטוקול יכול להתבצע על ידי הקפאת PBMs, אשר מספק גמישות בהתקנה ניסיונית, כמו הזמינות של מעילי באפי מוגבלת בדרך כלל. יתרון נוסף של שימוש PBMs קפוא (בכמה בקבוקונים) על פני אלה מבודדים טריים הוא כי הם יכולים לשמש בניסויים הבאים גם לאחר 1 שנה. זה מקטין את הבעיה הפוטנציאלית של השתנות תורם לתורם אם זה פרמטר רצוי או נדרש בנסיון.
תוצאות של השוואה בין-עבודה שבוצעה לאחר עד 13 חודשים להראות כי PBMs, כאשר מאוחסנים כראוי במיכל חנקן נוזלי, ניתן להשתמש על פני תקופה ארוכה ללא כל השפעה על הכדאיות שלהתא או שחזור תא 33. זמני אחסון ארוכים יותר (מעל שנה) עשויים להיות אפשריים לאחר אימות קפדני של יכולת הכדאיות של התא והיענות לתא לפני ביצוע ניסוי. כמו כן, הטמפרטורה במיכל החנקן הנוזלי חייבת להישאר יציבה בכל עת. הגורם העיקרי המשפיע על הכדאיות של PBMs cryopreserved נמצא הריכוז DMSO, עם ריכוז אופטימלי של 10%-20 % (v / v)28. כדי למזער השפעות מזיקות של הקפאה, מקורות שונים של חלבונים, FBS או BSA (עם מגוון רחב של ריכוז מ 40% עד 100 %34) מתווספים לעתים קרובות למדיום ההקפאה כרכיבי הגנה טבעיים שיכולים להגדיל את הישרדות התא.
בשל הפוטנציאל ציטוקסי גבוה של DMSO, מומלץ תחילה לפזר PBMs ב FBS, לאחר מכן להוסיף DMSO PBMs כבר מפוזר FBS. במיוחד, למרות ריכוזי FBS גבוהים יותר (>40%) לא הראו כל שיפור בכדאיות התא, באותו זמן, הם לא לגרום נזק לתאים28. אף על פי כן, הקפאת מונוציטים היא גישה אפשרית להתגבר על בעיות של זמינות מוגבלת של מעיל באפי. עם זאת, אם יש צורך בשימוש ב-MDDCs וב-MDMs מ-PBMs טריים, ניתן להבדיל את תאי החיסון ולהשתמש בהם 5-8 ימיםלאחר הבידוד 7,16,17,35,36,37. אם תכנון ניסיוני מאפשר, מומלץ לפחות 6 ימים של בידול הן ב- MDDCs והן ב- MDMs. עם זאת, עקביות בין חזרות שונות באותו ניסוי, יחד עם בדיקות שגרתיות של ביטויי סמן פני השטח הספציפיים שלהם, הם קריטיים. ההיענות לגירוי דלקתי, כגון LPS, לאחר זמן ההבידול יש גם לבדוק באופן קבוע.
חקירות רבות באמצעות קו התא A549 בוצעו ב ALI, או כמונוקולטורה או בשילוב עם סוגי תאים אחרים (מקרופאגים, תאים דנדריטוניים, או פיברובלסטים) לתוך מודל 3D coculture22,24,29,38. באמצעות מודל זה coculture 3D, cytotoxicity, סטרס חמצוני, או השפעות דלקתיות של (ננו-)חומרים נחקרו עד 72 שעות1,17,,21,,24,,29. הדמיון של המודל ברקמת vivo נחקר בעבר בהתבסס על הדמיה לייזר confocal של מודל16. בעת הרכבת המודל, חשוב לשקול הן את התפשטות התאים (אשר יכול להשפיע על A549 במודל המוצג כאן) כמו גם את הביצועים של התאים החיסוניים העיקריים (לא משגשגים) (כאן, MDDCs ו- MDMs). חשוב גם לקחת בחשבון כי לא כל מונוציטים חיוביים CD14 להבדיל MDDCs ו- MDMs, כי התאים יכולים להיות נוכחים הן בטפסים מצורפים מושהים. בהתבסס על אופי ההרכבה coculture (כאן, שני סוגי התא צריך לצרף לשכבה האפיתל הקיימת), מומלץ להשתמש רק תת אוכלוסיות של שני סוגי תאים חיסוניים. בנוסף, ניתוחים שגרתיים של מונוציטים, תגובתיות מונוקולטורה MDDC ו- MDM ל- LPS, וביטוי של סמני משטח ספציפיים (CD14, CD163, CD86, CD93 או CD206, נתונים לא מוצגים) הציעו כי 6 ו 7 ימים של בידול הם נקודות הזמן האופטימליות.
למרות מספר ריאליסטי של תאי אפיתל alveolar בריאות אנושיות מתאים ~ 160,000 תאים / ס"מ2, מספר תאי A549 שנספרו במודל הוא ~ 1,000,000 תאים / ס"מ2 לאחר 9 ימים תרבותיעל להוסיף 16,18. לכן, זה במגבלות מודל המבחנה צריך להיחשב. ראשית, הצפיפות של תאי אפיתל הוקמה בהתבסס על יכולתם ליצור שכבה confluent על קרום גדל. חשוב גם לציין כי A549 מייצג תא אפיתל סוג II עם צורה cuboidal, בניגוד לתאי אפיתל סוג I, שהם שטוחים והחוצה. מצד שני, המספר הנדרש של תאים חיסוניים נקבע בהתבסס על הספרות והוצג בפרוטוקול זה כמספר תא/ שטח פנים39,40,41. צפיפות התא של MDDCs בטווח של 400 תאים/מ"מ2 (4 תאים/ס"מ2)16 דומה לצפיפות התא במצב יציב של 500-750 תאים למ"מ2 (5- 7 תאים/ס"מ2) שדווחו במחקריvivo39. הצפיפות של MDMs במודל זה היא באותו טווח של מצב vivo באזור alveolar האנושי40.
כתמים סמן מקרופאג בוגר (25F9) נצפתה הן בצד apical (שבו MDMs נוכחים) כמו גם בצד בסיס (כלומר, באתר של תאים דנדריטיים). טרנסלוקציה של תאים חיסוניים דרך הממברנה מכניסה נקבוביות אפשרית, נצפתה גם באמצעות מודלזה 16, מה שעשוי להסביר את ההבדלים שנצפו בעוצמות הכתמים. עם זאת, הסבר אפשרי נוסף הוא כי סמן מקרופאג בוגר יכול לבוא לידי ביטוי גם על תאים דנדריטיים, אבל הביטוי הוא מאוד תורם ספציפי42. כמו כן, עוצמת הביטוי 25F9 גבוהה בהרבה ב- MDMs(איור 7, איור 8). שני הגירויים הדלקתיים (LPS ו- TNF-α) השפיעו על שלמות מחסום האפיתל הריאתי בשתי התותבות(איור 7, איור 8). זה היה צפוי בהתבסס עלפרסומים קודמים 43,44 מראה כי ציטוקינות דלקתית ומוצרים חיידקיים לשבש את שלמות של מחסומים אפיתל.
המודל הרב-תאי תלת-מימדי של האפיתל האנושי, שהוקם ומאופייןבעבר 17, שימש ככלי רב עוצמה ושימושי להערכת תגובות ביולוגיות (כלומר, תגובות דלקתיות חריפות, תגובת סטרס חמצוני, חלוקת חלקיקים ותקשורתסלולרית) במבחנה 21,24,,25,,45. התוצאות מאשרות את האחריות של מודלים coculture לגירויים proinflammatory (כאן, LPS ו TNF-α). התגובה הוגדלה מעט בעת שימוש בתאים חיסוניים PBMs טריים; עם זאת, לא היה הבדל משמעותי סטטיסטית בין cocultures באמצעות PBMs טרי לעומת הפשיר. יתר על כן, התגובות הדלקתיות של שני מודלים coculture היו גבוהים יותר מאלה של מונוקולטורה של תאים אפיתל מעובד תחת אותם (עלי) תנאים. לסיכום, הפרוטוקול מתאר את ההרכבה של מודל coculture רקמות אפיתל אנושי 3D באמצעות PBMs טרי או הפשיר עבור בידול לתוך MDMs ו MDDCs. הוא מוצג כי שני הדגמים מגיבים מאוד לגירוייםדלקתיים; לכן, הם יכולים לשמש ככלים רבי עוצמה עבור הערכות סיכון ורעילות פוטנציאליות.

במבחנה תרביות תא ריאות מציעות פלטפורמות חסכוניות, חזקות ומבוקרים היטב כדי להעריך את הסכנות של תרסיסים1. כמערכת תא מודל עבור פנאומוקיטים alveolar אנושי, קו התא אפיתל A549 מבודד אדנוקרצינומה ריאתית משמש לעתים קרובות2. תאים אלה מייצגים תאי אפיתל מסוג II מסוגווה מאזור alveolar 3 והם קו תא ריאות בשימוש נרחב עבור הערכתסיכון ורעילות 1,4,5,,6,,7,,8,,9,,10. קו התא A549 בעל תכונות רלוונטיות של תאי אפיתל מסוג II alveolar, כגון הנוכחות של גופים lamellar אופייני המכיל פוספוליפידיםארוזים בצפיפות 3.
זה כבר הראה כי כאשר התאים הם תרבותיים בממשק אוויר נוזלי (ALI), פעילי שטח משתחרר בצד האפי של תאי אפיתל חשופים לאוויר, הפחתת מתח פני השטח11,12,13. תכונה זו חשובה במיוחד בחקירות ננו-חומרים לנשימה ורעילות. לאחר שננו-חומרים/רעלים בשאיפה מופקדים באזור האלברים, הם מקיימים אינטראקציה ראשונה עם פעילי שטח ריאתיים ועקורים על ידי כוחות הרטבה לתוך ההיפופאה המימית, שם האינטראקציה עם תאיהריאות מתרחשת 14,15. למרות שתאי A549 יוצרים שכבת מונו-שכבה (שיכולה לבלוט יתר על פני שכבות בנקודות זמן מאוחרות יותר כאשר הם מעובדים ב-ALI) ולייצר פעילי שטח, חיסרון הוא היווצרות הצומת ההדוקה שלהם, וכתוצאה מכך ערכי התנגדות חשמלית טרנספיתלאליים נמוכים, אך עדיין מציגים מחסום פונקציונלי נגד חלקיקים בין-תאיים(ננו) טרנסלוקציה 16,17,18.
בריאות, יש מגוון רחב של אוכלוסיות תאים חיסוניים, כולל תאים פוגוציקים ומקצועיים אנטיגן הצגת (כלומר, מקרופאגים ותאים דנדריליים) כי ישירות לתקשר באמצעות מגע תא או איתות בין תאי כדי לשלוט ולשמור על הומואוסטזיס. מקרופאגים ותאים דנדריטיים הם אפקטים חיסוניים מולדים קריטיים ויוזמים של התגובה החיסונית אדפטיבית19. תאים דנדרטיים הממוקם בתוך או מתחת לאפיתל יכולים ליצור בלטות על פני האפיתל ללומן כדי לתפוס אנטיגן. מקרופאגים Alveolar ממוקמים על פני השטח apical של האפיתל ולפעול כתאי זקיף, המייצג את ההגנה התאית הראשונה נגד חומר זר, כמו גם זיהומים חיידקיים, ויראליים ופטריות. הפלסטיות phenotypic שלהם מאפשר אינדוקציה מהירה של תגובות דלקתיות בתגובה לגירויים כאלה, כמו גם מעבר לעורר תגובות אנטי דלקתיות (כלומר, מעכב)תגובות 20.
כדי לדמות את מחסום רקמת האפיתל האלוולרי האנושי, הקמנו מודל קוקולטורה משולשת עם תאי A549 בתוספת מקרופאגים נגזרים מדם אנושי (MDMs) ותאים דנדריטיים (MDDCs) בצדדים האפיים והבזליים,בהתאמה 17. טיפוח מודל זה ב-ALI דווח בעבר16, אפילו עד 72 שעות לאחר חשיפה21. תגובות חיסוניות חריפות חשיפות פחמן צינורות שופרו באופן משמעותי בתרבות התא חשוף ALI לעומת תנאיםשקועים 22. מודל coculture, תרבותי וחשף לחומרים שונים ב ALI, שימש בעבר כדי לחקור cytotoxicity, סטרס חמצוני ותגובות דלקתיות על חשיפות תחמוצת אבץ,23 חומרים הקשוריםגרפן 24,חלקיקי זהב 25,26,פחמן צינורות 21, ו אפר וולקני וחלקיקיםפליטה דיזל 27.
יתר על כן, התפקיד החשוב של מקרופאגים ותאים דנדרטיים כתאי אפקט חיסוני במודל ריאות אנושית במבחנה אושרה. בפרט, תגובה דלקתית מוגברת במודל נצפתה רק בנוכחות תאים חיסוניים בהשוואה למערכות monoculture7. חסרונות פוטנציאליים של שימוש בתאים חיסוניים ראשיים המופקים ממונוצייט הם הנגישות המוגבלת של PBMs, כמו גם וריאציה של תורם לתורם. כפתרון לחסרונות פוטנציאליים אלה, המוצג כאן הוא פרוטוקול המציג cryopreservation של PBMsמבודד טרי 28 עבור הרכבת מודל תרבות התא. מטרת מחקר זה היא להדגים את ההרכבה מודל רקמת אפיתל אדם 3D, כולל בידוד של PBMs ממעילי באפי אנושיים. ההיענות לגירויים דלקתיים מושווה למודל המורכב מ-MDMs ו-MDDCs הבדילים ממחשבי PBMs טריים או מובדלים ממחשבי PBM קפואים/מופשרות.
עבודה עם דגימות דם אנושיות שלא נבדקו כרוכה בטיפול ספציפי כדי למנוע העברה אפשרית של מחלות זיהומיות, כגון HIV (נגיף כשל חיסוני אנושי), צהבת B, ו הפטיטיס C. לכן, השימוש באמצעי הגנה אישיים כגון כפפות, שמלות, מסכות והגנה על העיניים הוא קריטי וחייב להיות בהתאם לעקרונות תרגול מעבדה טובים. הגנות אלה מפחיתות את הסיכון לחשיפת העור או ממברנות ריר לנוזלים שעלולים להיות זיהומיים. בנוסף, עבור אלה המעורבים בטיפול מעילי באפי PBMs, חיסון נגד נגיף הפטיטיס B הוא חובה, ורמות טטר דם של נוגדנים נגד הפטיטיס B חייב להיות מעל 100 IU / L (דרישות חקיקה ספציפיות למדינה צריך להיות מטופל). בנוסף, יש לבצע את כל העבודה במעבדות ברמה 2 של אבטחה ביולוגית (יש לטפל בדרישות חקיקה ספציפיות למדינה). יש לאמץ אמצעי זהירות סטנדרטיים של בריאות ובטיחות הקשורים לעבודה בסביבת מעבדה ולטיפול בתרבות התאים היונקים, לרבות טיפול בפסולת, בעת ניהול הפרוטוקול כולו.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchmark microplate reader</td>
			<td>does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Incubator</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container (for example Mr. Frosty)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>does not have to be specific, for example</td>
			<td>Zeiss LSM 710 meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatocytometer, or automatic cell counter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar bio-safety hood class II</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStand Macs (Macs Cell Separator)</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast inverted light microscope</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette boy, pipettors (different volumes)</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable small equipment/glassware</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353046 and 353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 &#956;m pore size</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapper</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass autoclaved Petri Dishes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>10040-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>A7030-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MicroBeads human - magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-097-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS, Norway</td>
			<td>1114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td>D5879_1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>E6758-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-093-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-095-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>4524-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 &#956;g/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 &#956;g/mL</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 &#956;g/mL</td>
			<td>Agrisera, Sweden</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 &#956;g/mL</td>
			<td>eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland</td>
			<td>14-0115-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 &#181;M</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab244204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment

מודל coculture תא alveolar אנושי מתואר כאן לסימולציה של מחסום רקמת האפיתל alveolar מורכב של תאים אפיתל alveolar סוג II ושני סוגים של תאים חיסוניים (כלומר, מקרופאגים נגזר ים אנושיים [MDMs] ותאים דנדרטיים [MDDCs]). פרוטוקול להרכבת הדגם הרב-תאי מסופק. תאי אפיתל Alveolar (קו תא A549) גדלים ומובדילים בתנאים שקועים על תוספות חדיר בארות דו-תאים, ולאחר מכן בשילוב עם MDMs מובחנים ו- MDDCs. לבסוף, התאים נחשפים לממשק אוויר נוזלי במשך מספר ימים. כמו תאים חיסוניים ראשוניים אנושיים צריך להיות מבודד ממעילים באפי אנושיים, תאים חיסוניים מובדילים מונוציטים טריים או מופשרים מושווים על מנת להתאים את השיטה בהתבסס על צרכים ניסיוניים. המודלים התלת מימדיים, המורכבים מתאי חומוס עם תאים חיסוניים חד-ממדיים או חד-ממדיים המופקים ממונוציטים, מראים עלייה משמעותית סטטיסטית בציטוקין (אינטרלודים 6 ו-8) המשחררים עם חשיפה לגירויים מעוררי דלק (lipopolysaccharide וגורם נמק גידולי α) בהשוואה לתאים לא מטופלים. מצד שני, אין הבדל משמעותי סטטיסטית בין שחרור ציטוקין שנצפה בcocultures. זה מראה כי המודל המוצג מגיב לגירויים דלקתיים בנוכחות MDMs ו MDDCs מובדלים מונוציטים טריים או הפשירים דם היקפי (PBMs). לכן, זהו כלי רב עוצמה לחקירות של תגובה ביולוגית חריפה לחומרים שונים, כולל תרופות תרסיסיות או ננו חומרים.

מודלים של תותבת ריאות אנושית, המורכבים מתאי אפיתל ותאי מערכת החיסון, הורכבו מ-MDDCs טריים או קפואים ומחשבי אב חסות MDMs (כאן, מונוציטים הנגזרים מדם היקפי אנושי). כפי שהוצג באות 1,תאי A549 נזרעו 3 ימים לאחר הסעיף הראשון שכלל בידוד/הפשרה חד-צייטיים. לאחר 6 ימים של בידול, MDMs מובחן הופיע עגול בצורת, בעוד MDDCs יצרו צורה מוארך יותר עם בלטים נצפים. הם גם הופיעו כאגלומרטים, במיוחד כאשר הם מובדילים ממונוציטים טריים (איור 2, איור 3). תאי אפיתל יצרו שכבת תאים צפופה של תאים לאחר 3 ימים של צמיחה על ממברנה תוספות (איור 4), כאשר cocultures הורכבו. לאחר 24 שעות של הרכבה ו-24 שעות נוספות של חשיפה לתנאי ALI, התוכנו התוכנות לחשיפה.
ההיענות של מודלים תרבות תא 3D נחקרה עם חשיפה לגירויים מדלקתיים ידועים באמצעות גישה פסאודו-ALI, כמתוארקודם לכן 29. הגירויים הדלקתיים, LPS ו-TNF-α, נוספו בכמויות נמוכות (100 μL) על פני השטח האפאליים של דגם התא החשוף לאוויר. במקביל, היעדר קרע קרום כמדד של cytotoxicity הוערך באמצעות LDH assay. עלייה משמעותית בשחרור LDH ב CCM של תא הבסת נצפתה עם חשיפה לשליטה חיובית לקרע קרום, טריטון-X 100 דטרגנט(איור 5). תוצאות אלה הוכיחו את ההיענות של המודל לחומר cytotoxic, בעוד אין עלייה בשחרור LDH נצפתה על גירוי apical עם TNF-α או LPS.
ניתן לייחס סיבה אפשרית לערכים המדודים השונים של LDH בדגימות המורכבות עם PBMs טריים או קפואים בעבר לאחסון לדוגמה. דגימות מ- PBMs טריים אוחסנו למשך זמן רב יותר ב- -80 °C; לכן, הפעילות של אנזים LDH עלולה לרדת. במיוחד, LDH יציב רק עד 4 ימים ב CCM; לכן, מומלץ לבצע את ההתאסה ביומיים האחרונים לאחר איסוף הסופרנטנטים. לחלופין, ניתן להקפיא את supernatants מיד לאחר האיסוף. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון כי הקפאה יכולה להקטין את הפעילות האנזימטית של LDH.
הפרשת מתווכים דלקתיים (כאן, TNF-α ו interleukins 6 [IL-6] ו 8 [IL-8]) לתוך CCM בסיס היה לכמת באמצעות ELISA. מבחינה סטטיסטית משמעותי (p < 0.05, ANOVA בכיוון אחד) עליות בשחרור IL-6 ו IL-8 נצפו הן LPS- ו TNF-α- שטופלו בהשוואה לתאים לא מטופלים בהתאמה, כמו גם במודלים תרבות התא שנאספו ממקור PBMs(איור 6). למרות ריכוזים (pg/mL) של כל ציטוקינות שנבדקו CCM בסיס היו גבוהים יותר cocultures מורכב PBMs טרי, ההבדלים בין שתי cocultures monocultures לא היו משמעותיים סטטיסטית (p > 0.05) (איור 6). כדי לאשר את הערך המוסף של מודלים coculture ביחס לתרבות תא אפיתל 2D, מונוקולטורה A549 נחשפו גם LPS או TNF-α. כצפוי, שחרורם של כל המתווכים שנחקרו מ-A549 monocultures היה נמוך יותר בהשוואה לשני המודלים של coculture; למרות שההבדל ביניהם לא היה משמעותי סטטיסטית (p > 0.05, ANOVA חד-כיוון).
מורפולוגיה תאית של מחסום רקמת האפיתל האלברול האנושי 3D הוערך באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (LSM). כדי לדמיין את ההרכב של כל דגם, מקרופאגים בתוך מודלים coculture (MDMs) היו מוכתמים עם סמן מקרופאג בוגר 25F9. MDDCs היו מוכתמים CD83, שהוא סמן חשוב עבור תאים דנדריטייםמופעלים 30. לגבי מורפולוגיה תאית, לא נצפה הבדל בין מודלים coculture באמצעות MDMs ו MDDCs מ PBMs טרי בהשוואה לאלה באמצעות PBMs מופשרים. ב-LPS- ו-TNF-α-חשוף cocultures, שניהם מורכבים תאים חיסוניים טריים וקפואים, שכבה אפיתל משובשת בתמונות LSM נצפתה, אשר לא היה המקרה בתאים לא מטופלים (איור 7, איור 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig01.jpg"> איור 1: ציר זמן סכמטי של הפרוטוקול. הצגת מודל 3D coculture הכנה, הרכבה, ויישום (חשיפה לחומר נבדק). ALI = ממשק נוזלי אוויר, MDDCs = תאים דנדריטיים נגזר מונוציטים, MDMs = מקרופאגים נגזר מונוציטים, PBMs = מונוציטים דם היקפי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig02.jpg"> איור 2: MDMs ו- MDDCs הבדילו ממחשבי PBMs טריים. תמונת מיקרוסקופית ניגודיות שלב של MDMs מובדיל (A) ו - (B) MDDCs מ PBMs טרי (6 ימים לאחר בידוד התא). MDMs הם עגולים, בעוד MDDCs נצפים לעתים קרובות כמו agglomerates. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig03.jpg"> איור 3: MDMs ו- MDDCs מובדילים ממחשבי PBMs קפואים. תמונת מיקרוסקופית ניגודיות שלב של MDMs מובדיל (A) ו - (B) MDDCs מ PBMs מופשרים (6 ימים לאחר הפשרה). MDMs הם עגולים, אבל כמה תאים מוארך ניתן לצפות. MDDCs מופיעים גם עגול בצורת עם בלטים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig04.jpg"> איור 4: גידול תאי אפיתל בממברנה. תמונת מיקרוסקופ ניגודיות שלב של A549 confluent גדל על ממברנה להוסיף 4 ימים לאחר זריעה, ויוצרים שכבה צפופה של תאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig05.jpg"> איור 5: תוצאות Cytotoxicity נחקרו באמצעות ממברנה מבוססי קרע (LDH) תסיסה. הנתונים מוצגים כעלייה קיפול על תאים לא מטופלים (ממוצע ± SD, n = 3, כוכבית מציינת עלייה משמעותית סטטיסטית בהשוואה לתאים לא מטופלים, **p < 0.01, ****p < 0.0001). במודלים ירוקים מיוצגים MDMs ו-MDDCs ממחשבי PBMs טריים, ובדגמים סגולים המורכבים מ- PBMs מופרשרים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig06.jpg"> איור 6: תגובות מדלקות בקולטות ובמונוקולטורה. המתווכים הדלקתיים (TNF-α, IL-6 ו-IL-8) משחררים את התותחות באתגר של 24 שעות עם LPS או TNF-α. הנתונים מוצגים יחסית לתאים לא מטופלים (ממוצע ± SD, n = 3, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001). במודלים ירוקים מיוצגים MDMs ו-MDDCs ממחשבי PBMs טריים, ובדגמים סגולים המורכבים מ- PBMs מופרשרים. גריי מייצגת מונוקולטורה A549. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig07.jpg"> איור 7: מורפולוגיה של תותבות המורכבות מתאי מערכת החיסון הטריים. תמונות LSM של צדדים אפיים ובזליים של מודל coculture עם הקרנת xz של צדדים apical של המודל באמצעות MDMs ו MDDCs מ PBMs טרי. החץ הלבן מציין MDM, בעוד החץ הירוק מציין MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig07large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig08.jpg"> איור 8: מורפולוגיה של תותבות המורכבות מתאי מערכת חיסוניים קפואים. תמונות LSM של הצד האפאלי של מודל coculture עם הקרנות xz המתאים, וצד בסיס של המודל באמצעות MDMs ו- MDDCs מ PBMs המופשרים. החץ הלבן מציין MDM, בעוד החץ הירוק מציין MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig08large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment at JoVE.com

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

מוצג כאן פרוטוקול לבידוד מונוציט דם אנושי ראשי, כמו גם ההבידול שלהם לתוך מקרופאגים ותאים דנדריטיים והרכבה עם תאים אפיתל לתוך מודל ריאות אנושי רב תאי. תגובות ביולוגיות של cocultures המורכבים תאים חיסוניים מובדלים או חדוציטים מבודדים טריים או מופשרים, עם חשיפה לגירוייםדלקתיים, מושווים.

מודל אדם רב-תאי המורכב מתאי אפיתל ותאי מערכת החיסון העיקריים להערכת סיכונים

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

מודל אודיו אנושי אינדיבידואלי זה משתמש בתאי חיסון רלוונטיים ככלי רב עוצמה לחיזוי תגובה חיסונית חריפה של חומרים כולל ננו-חומרים ותרופות ידע. תרופות אלה משלבת תאי אפיתל אנושיים ותאי חיסון ראשוניים אנושיים כדי להעריך את התגובות הספציפיות האלה. השימוש במונוציטים טריים וקפואים מספק גמישות לתוכנית הניסוי.מחקרים רבים הראו כי מודל זה יכול לספק תובנה על התקשורת הבין-כוכבית בין חוש התנהגות לחוש החיסוני. כמו הדגמה זו כוללת את כל הפרטים החשובים עבור הרבעה המודל תכונה אישית בתרבות התא, הוראות חזותיות לשכפל ניסויים. מספר שלבים בפרוטוקול שלפוחית השתן מורכבים ודורשים טיפול מיוחד.לכן הם הוכחו עם כל הפרטים הנדרשים כי הם יכולים בקלות אחריו. לבידוד מונוציטים של דם היקפי מעילים אנושיים של באפי, פצלו את תכולת שקית המעיל של באפי, באופן שווה בין 250 צינורות חרוטיים מיליליטר. בזהירות להביא את הנפח הכולל בכל צינור 250 מיליליטר עם PBS ומערבבים את הצינורות עם שלושה היפוכים עדינים.לאחר מכן לפצל את פתרון PBS מעיל באפי באופן שווה בין ארבעה צינורות חדשים 50 מיליליטר, ולאחר מכן להוסיף 10 microliters של CD 14 חרוזים מגנטיים חיוביים התאים הכולל השביעי לצינור ומערבבים היטב על ידי צינורות. עם מילוי, לנתק את פיפטה מן הצינור ומיד חיבר את הפתח העליון של פיפטה עם אגודל ואז הניח את פיפטה מלא בתחתית צינור אחד לנתק את פתיחת פיפטה כדי לאפשר בינוני שיפוע צפיפות לזרום לאט מתחת לתערובת PBS מעיל באפי, עד מיליליטר אחד של מדיום שיפוע צפיפות נשאר בתוך פיפי. כאשר בינוני שיפוע צפיפות נוספה לכל צינור באותו אופן להפריד את התאים על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות ולהשתמש פיפטה סרולוגית לאיסוף לבן 2-3 מילימטר עבה שכבת תאים חד-גרעיניים דם היקפיים בין הפלזמה לבין שכבות בינוניות שיפוע צפיפות.הדרך הטובה ביותר לחבר את השכבה היא להסיר את הפלזמה תחילה ואז אתה מדכא את הפיפסות הלוגיות שלנו כדי לאסוף את התאים. משוך את התאים mononuclear הדם ההיקפיים מכל קבוצה של שני צינורות לתוך צינור אחד חדש 50 מיליליטר ולשטוף את התאים פעמיים עם נפח כולל של 50 מיליליטר של PBS טרי לכל לשטוף. ואז להשליך supernatant ולתלות את פיפטה בכל אחד בחמישה מיליליטר של PBS טרי בריכה מתלים התא לתוך צינור אחד לספירה.לאחר הספירה, צנטריפוגה התאים שוב resuspend pelette ל 80 מיליליטר של חיץ הפרדה מגנטית לכל לטפל בתאים השביעיים. לאחר מכן להוסיף 10 microliters של CD 14 חרוזים מגנטיים חיוביים לכל להשתתף בתאים הכולל השביעי לצינור ומערבבים היטב על ידי צינורות. לאחר דגירה של 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס שוטפים עמוד מגנטי עם שלושה מיליליטר של חיץ הפרדה מגנטית ומוסיפים את התאים לעמודה.לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם שלושה כמויות מיליליטר של חיץ לכל לשטוף ולהעביר את העמוד לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של חיץ הפרדה מגנטית טרי. לאחר מכן השתמש הבוכנה וחמישה מיליליטר של חיץ כדי לשטוף את התקליטור 14 תאים חיוביים לתוך הצינור. האם לגרום התביור של תקליטור מבודד חרוז מגנטי 14 תאים חיוביים.ראשית, להשתמש מחדש את התאים פעם אחת לטפל ששת התאים לריכוז מיליליטר במדיום תאים. או הבחנה MDDC, להוסיף 10 ננוגרם למיליליטר של מושבת מקרופאג אתר גרנולה גורם מגרה לצינור ולהוסיף שלושה מיליליטר של תאים לכל באר של צלחת תרבות תאים שש היטב, או דידול MDM להוסיף 10 ננוגרם למיליליטר של מושבת מקרופאג מגרה גורם לתאים צלחת התאים כפי שהודגם רק. כדי להקים מודל אנושי של רקמת תא אפיתל מכתשית משולשת, העבר תחילה 1.5 מיליליטר של מדיום תרבות תאים טרום-חמה למספר המתאים של בארות של צלחת 12 היטב והצבת תרבות תאים מוכנסת לתוך כל באר.הבא להוסיף 500 microliters של השעיה תא אפיתל בצפיפות של חמש פעמים 10 לתאים החמישי למיליליטר לתוך הצד apical של כל הכנס לכסות את הצלחת עבור אינקובציה ארבעה ימים באינקובטור תרבות התא. או זריעת MDDC מחליף supernatant מן הבאר של שש צלחות גם המשמשים התברות MDDC, עם מיליליטר אחד של מדיום תרבות תאים חמים טריים ולהשתמש מגרד תאים כדי לנתק את תאי הדבקה מכל באר. לשטוף כל טוב שלוש פעמים עם supernate ובכל באר ולשלב את כל פתרונות התא לתוך צינור צנטריפוגה אחת.MDDC שנקטף על ידי צנטריפוגה ו tweezers סטריליים למקם את מוסיף מ 12 צלחות גם במהופך בצלחת פטרי סטרילית. לגרד את כל תאי האפיתל מהצד הבסיסי של הכנס ולתלות מחדש את MDDCs במדיום תרבות תאים טריים לעשות ריכוז של 4.2 פעמים 10 של תאים אלה למיליליטר. לאחר מכן להוסיף 150 microliters של תאים על כל הכנס, כך פני השטח הבסיסיים כולו של הכנס מכוסה באותה מידה עם הנוזל ללא בועות.עבור זריעת MDDM לאחר קצירת MDDMs מבודל כפי שהודגם עבור MDDCs, לדלל את התאים 2.5 פעמים 10 לארבעה תאים למיליליטר של ריכוז בינוני של תאים טריים ולהוסיף 500 microliters של תאים במורד הקיר של כל תא אפיתל MDDC המכיל תא תרבות להוסיף, ולאחר מכן למקם את המכסה על הצלחת ולמקם את הצלחת בממגר תרבות התא עבור 24 שעות. למחרת שאף את העל-טבעי הן מאזורי האפיקל והן מאזורי הבזל של כל תכלית תאים והן מ- Wells. לאחר מכן אתה מעקר פינצטה כדי להרים את התוספות מה בארות ולהוסיף 600 microliters של טרום המלחמה טריים לתרבות התא בינוני לכל באר.לאחר שישה ימים של התבלטות, ה- MDMs מופיעים עגולים בצורתם בעוד MDDCs יוצרים אשכולות מורכבים מתאים עם צורה מוארכת יותר ובלטים ניתנים לצפייה. לאחר שלושה ימים של צמיחה על ממברנה מוסיף, תאי האפיתל יוצרים צפוף עלייה משמעותית שחרור לקטט דהידרוגנאז נצפתה במדיום תא התרבות של התא הבסיסי עם חשיפה לשליטה חיובית על קרע קרום, להוכיח את ההיענות של המודל לחומר ציטוקקסי. אין עלייה בשחרור לקטט דהידרוגנאז כפי שנמדד על גירוי אפי עם אלפא TNF או LPS.עליות מובהקות סטטיסטית בשחרור IL6 ו IL8 נצפים הן LPS ו TNF אלפא שטופלו דגימות לעומת שליטה בתאים מטופלים. אין הבדלים במורפולוגיה של התאים נצפו בין המודלים של תרבות-משותף באמצעות MDDMs ו- MDDCs ממונוציטים טריים של דם היקפי בהשוואה לאלה המשתמשים בתאים מופשרים בתרבות ה- LPS ו- TNF אלפא חשופה, נצפתה שכבת אפיתל משובשת. ניתן להשתמש בסוגים אחרים של תאים אנושיים כגון דרכי הנשימה או תאים bronchiolar, נקודות קצה אחרות ניתן גם לנתח.בעיקר חוקרים קיבלו השראה מטכניקה זו באמצעות דומה להגדיר אבל עם סוגי תאים שונים.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

Tissues of the Human Body

SCIENTISTS IN ACTION

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

ראשי תאים אנושיים אפיתל הסימפונות גדלה מ Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

אופטימלית Lentivirus ייצור תרבית תאי תנאים הכרחיים בהצלחת transduce האדם הראשי תאי אפיתל סימפונות

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

בידוד והעשרה של תאי אב אפיתל הריאה האנושיים לתרבית אורגנואידית

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...