Name: multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment
Uploaded: 2020-05-06T13:30:00
Duration: 9 min 27 s
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著者らは、図3のコカルチャースキームに対するミゲル・スプック=カルバー博士と、批判的な読書に対するベディア・ベグム・カラコカク博士に感謝したいと考えています。この研究は、PATROLSプロジェクト、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究イノベーションプログラム、補助金契約No 760813、アドルフ・メルクル財団によって支援されました。B.D.は、ピーター・ウント・トラウドル・エンゲルホルン財団に資金援助を感謝します。

著者らは開示するものは何もない。

化学物質や医薬品を含む新しい材料の新しい生産は、徐々にインビトロモデルの予測の必要性を高めます。動物実験32の置換、縮小、および精製の3つの原則に準拠するために、インビトロ細胞モデルは、薬物または材料の作用8、9、10、119,の薬剤または材料のメカニズムを解明するための置換および8還元態様に関する強力なツールとなっている。10,11ここで提示される、新たに単離された、または以前に凍結した単球から解凍された免疫細胞を使用して多細胞モデルを組み立てる詳細なプロトコルです。また、ALIでのモデルの栽培についても説明します。最後に、プロトコルは、炎症誘発性刺激への暴露の例を示し、新鮮または凍結した単球のいずれかを含む2つのモデルの応答を比較する。
従来の水没露光7、22、31と比較して、ALI条件下で成長し、露出したモデルの高められた複雑さの7,付加価値を確認し、31正当化するために様々な研究が行われている。上皮細胞の単一培養と比較して、共培養における高い炎症反応の観察は、以前の研究を確認する。本研究では、提示された共培養モデル(LPSで刺激)を用い、A549単一培養等価モデル7と比較してTNFおよびIL1Bの遺伝子発現レベルにおいて高い応答を示した。一方、両モデルは、A549単一培養物と比較して、測定された炎症促進メディエーター放出値内でより高い変動を示した。これは、生物学的反復(すなわち、1つの繰り返し、1つのドナー)内の異なるドナー(バフィーコート)からの免疫細胞の使用によって説明することができる、7を既に示した。必要に応じて、反復の変動は、1)同じドナーからの解凍PBMまたは2)細胞を凍結する前に異なるドナーからのPBMをプールし、その後、各繰り返しで同じプールを使用することによって克服することができる。より多くの生物学的繰り返しを含めることも推奨されます。
細胞凍結技術は重要なステップと考えることができます。しかし、それは、細胞を保存するための一般的な実験室の手順である。様々な研究は、凍結PBMの品質がその生存に不可欠であることを実証しており、適切な凍結技術は、同じ細胞28、32,32を有するその後のアッセイの成功の鍵である。プロトコルの改変は、通常、バフィーコートの利用可能性が限られているため、実験セットアップの柔軟性を提供するPBMを凍結することによって行うことができる。新たに分離されたPBMよりも冷凍PBM(いくつかのバイアル)を使用するもう一つの利点は、1年後でもその後の実験で使用できることです。これは、実験で必要なパラメータまたは必要なパラメータである場合、ドナー間変動の潜在的な問題を減少させる。
最大13ヶ月後に行われたラボ間比較の結果は、PBMが、液体窒素タンクに適切に貯蔵された場合、細胞生存率または細胞回収33に影響を及ぼすことなく長期間にわたって使用できることを示している。実験を行う前に細胞の生存率と細胞の応答性を慎重に検証すれば、より長い保管時間(1年以上)が可能になる可能性があります。また、液体窒素タンク内の温度は常に安定している必要があります。凍結保存されたPBMの生存率に影響を与える主な要因は、DMSO濃度であり、最適濃度は10%〜20%(v/v)28であることがわかった。28凍結の潜在的に有害な影響を最小限に抑えるために、タンパク質、FBSまたはBSAの異なる供給源(40%から100%34まで幅広い濃度)が、細胞生存率を高めることができる自然な保護成分として凍結培地に添加されることが多い。
DMSO の細胞毒性の高いポテンシャルが高いため、まず FBS に PBM を分散し、FBS にすでに分散している PBM に DMSO を追加することをお勧めします。特に、FBS濃度は高いが(>40%)細胞生存率の改善を示さなかったが、同時に、細胞28に害を及ぼさなかった。それにもかかわらず、単球を凍結することは、限られたバフィーコートの可用性の問題を克服するための可能なアプローチである。しかし、新鮮なPBMからMDDcとMDMを使用することが望ましい場合、免疫細胞は分離し、分離後5〜8日後に7、16、17、35、36、37を使用することができる。,16,17,35,36,37実験計画が許すなら、MDDCとMDMの両方で少なくとも6日間の分化が推奨される。しかし、同じ実験における異なる繰り返しの間の一貫性は、特定の表面マーカー表現の定期的な検査と共に、非常に重要です。分化時間後のLPSなどの炎症促進刺激に対する応答性も定期的にチェックする必要があります。
A549細胞株を用いた多くの調査は、ALIにおいて、単培養として、または他の細胞タイプ(マクロファージ、樹状細胞、または線維芽細胞)と組み合わせて、3Dコカルチャーモデル2222、24、29、3824,29,38に対して行われている。この3D共培養モデルを用いて、細胞毒性、酸化ストレス、または(ナノ)材料の炎症効果(ナノ)の炎症効果が、最大72h1、17、21、24、29まで調べられている。1,17,21,24,29このモデルは生体内組織に類似しており、モデル16の共焦点レーザー走査イメージングに基づいて以前に調べられていた。モデルを組み立てる際には、細胞増殖(ここで示すモデルではA549に影響を与える可能性があります)と、プライマリ(増殖しない)免疫細胞(ここではMDDCおよびMDM)の性能の両方を考慮することが重要です。また、すべてのCD14陽性単球がMDDCとMDMに分化するわけではないこと、および細胞が付着した形態と浮遊形態の両方に存在することができることを考慮することも重要である。コカルチャーアセンブリの性質に基づいて(ここでは、両方の細胞タイプが既存の上皮層に付着する必要がある)、両方の免疫細胞タイプの接着サブ集団のみを使用することが推奨される。さらに、単球、MDDCおよびMDM単一培養のLPSへの応答性、および特定表面マーカー(CD14、CD163、CD86、CD93、またはCD206、図示しない)の発現のルーチン分析は、6日および7日間の分化が最適な時点であることを示唆している。
ヒト肺の肺胞上皮細胞の現実的な数は〜160,000細胞/cm2に相当するが、モデル内で数えられるA549細胞の数は、挿入部16,18,18で培養した9日後に〜1,000,000細胞/cm2である。したがって、このインビトロモデルの限界を考慮する必要があります。まず、上皮細胞の密度は、成長膜上にコンフルエント層を形成する能力に基づいて確立された。また、A549は、平らで広がった上皮I型細胞とは対照的に、立方体型の上皮II型細胞を表していることも言及することが重要である。一方、免疫細胞の必要数は文献に基づいて確立され、このプロトコルでは細胞数/表面積39、40、4140,41として提示された。39400細胞/mm2(4細胞/cm2)16の範囲2のMDDCの細胞密度2は、16生体内研究39から報告された500〜750細胞/mm2(5〜72細胞/cm2)の定常状態の細胞密度に匹敵する。このモデルにおけるMDMの密度は、ヒト肺胞領域40におけるインビボ状況の同じ範囲内にある。
成熟したマクロファージマーカー染色(25F9)は、補助側(MMSが存在する場所)と基底側(すなわち樹状細胞の部位)の両方で観察された。膜挿入孔を介した免疫細胞の転位が可能であり、またこのモデル16を用いて観察されており、これは染色強度の観察された違いを説明する可能性がある。しかし、もう一つの考えられる説明は、成熟したマクロファージマーカーも樹状細胞上で発現することができるが、その発現はドナー特異的な42である。また、25F9発現の強度は、MDMにおいてはるかに高い(図7、図8)。両方の炎症促進刺激(LPSおよびTNF-α)は、両方のコ培養において肺上皮バリアの完全性に影響を及した(図7、図8)。これは、炎症性サイトカインおよび細菌製品が上皮障壁の完全性を破壊することを示す以前の出版物43、44に基づいて予想された。43,
ヒト肺胞上皮の3D多細胞モデルは、以前17個の確立および特徴付け、生体応答(すなわち、急性炎症反応、酸化ストレス応答、粒子分布、および細胞伝達)の生体内応答を評価するための強力で有用なツールとして役立21,24,25,っている。結果は、共培養モデルの炎症促進性刺激(ここではLPSおよびTNF-α)の責任を確認する。新鮮なPBMからの免疫細胞を使用する場合、応答はわずかに増加しました;しかし、新鮮なPBMと解凍されたPBMを使用するコカルチャーの間には統計的に有意な差はなかった。さらに、両コカルチャーモデルの炎症反応は、同じ(ALI)条件下で培養した上皮細胞単一培養の反応よりも高かった。要約すると、このプロトコルは、MDMおよびMDDACへの分化のために新鮮または解凍されたPBMのいずれかを使用して、3Dヒト肺胞上皮組織共培養モデルの組み立てを記述する。両方のモデルは炎症促進刺激に対して非常に反応性が高い。したがって、潜在的な危険および毒性評価のための強力なツールとして役立ちます。

in vitro肺細胞培養は、エアロゾル1の危険性を評価するために、費用対効果の高い、堅牢で、適切に制御されたプラットフォームを提供します。ヒト肺胞性肺胞性肺球のモデル細胞系として、肺腺癌から単離された上皮A549細胞株がしばしば2を用いる。,これらの細胞は、歯槽領域3からの扁平上皮細胞を表し、危険および毒性評価,1、4、5、6、7、8、9、104,5,6,7に広く使用されている肺細胞株である。9,1018A549細胞株は、肺胞上皮II型細胞の関連特徴を有し、例えば、密に詰まったリン脂質3を含む特徴的な単層体の存在などである。
細胞が空気・液体界面(ALI)で培養されると、界面活性剤が空気露出上皮細胞の有端側に放出され、表面張力が11、12、13に減少することが示されている。,12,13この特徴は、ナノ物質的な呼吸ハザードおよび毒性調査において特に重要である。いったん吸入したナノ材料/毒性物質が肺胞領域に沈着すると、それらは最初に肺界面活性剤と相互作用し、水性低相に力を湿させることによって、肺細胞との相互作用が14,15,15に起こる。A549細胞は単層(ALIで栽培すると後で多層に成長する可能性がある)を形成し、界面活性剤を生成するが、欠点は、それらの不十分な接合点形成であり、その結果、過上皮電気抵抗値が低いが、細胞間(ナノ)粒子転位1616、17、1817,18に対する機能的障壁を示す。
肺には、細胞細胞の接触や細胞間シグナル伝達を通じて直接伝達する貪食および専門の抗原提示細胞(マクロファージおよび樹状細胞)を含む様々な免疫細胞集団があり、恒常性を制御および維持する。マクロファージおよび樹状細胞は、適応免疫応答19の重要な自然免疫エフェクターおよびイニシエーターである。上皮の内部または下に存在する樹状細胞は、上皮を横切って内腔に突出物を形成し、抗原を捕捉することができる。肺胞マクロファージは上皮の上端表面に位置し、センチネル細胞として作用し、細菌、ウイルスおよび真菌感染症だけでなく、異物に対する最初の細胞防御を表す。これらの表現型可塑性は、そのような刺激に応答して炎症反応を迅速に誘導し、抗炎症(すなわち、阻害性)反応を引き起こすに移行することを可能にする。
ヒト肺胞上皮組織のバリアを模擬するために、我々は、アペカル側と基底側に、それぞれ17の上にヒト単球由来マクロファージ(MDM)および樹状細胞(MDDC)を補ったA549細胞を用いた三重共培養モデルを確立した。ALIでのこのモデルの栽培は、以前に報告されています16,でも 72 時間のポスト露光21.カーボンナノチューブ曝露に対する急性免疫応答は、水没条件22と比較してALIに曝露された細胞培養において有意に増強された。培養した共培養モデルは、ALIで異なる物質に曝露され、これまで、酸化亜鉛への曝露時に細胞毒性、酸化ストレスおよび炎症反応を調査するために使用されてきたが、23のグラフェン関連材料24、金ナノ粒子25、26、,26カーボンナノチューブ21、火山灰およびディーゼル排気粒子27。
さらに、ヒト肺モデルにおける免疫エフェクター細胞としてのマクロファージおよび樹状細胞の重要な役割が確認された。特に、モデルにおける炎症反応の増加は、単一培養系7と比較して免疫細胞の存在下でのみ観察された。原発単球由来免疫細胞を使用することの潜在的な欠点は、PBMの限られたアクセシビリティならびにドナー間の変動である。これらの潜在的な欠点の解決策として、ここで提示される、細胞培養モデルアセンブリのための新たに単離されたPBM28 の凍結保存を導入するプロトコルである。本研究の目的は、ヒトバフィーコートからのPBMの分離を含む3Dヒト肺胞上皮組織モデルアセンブリを実証することである。炎症促進性刺激に対する応答性は、新鮮なPBMと区別されるか、凍結/解凍されたPBMと区別されるMDMおよびMDDCで構成されるモデルと比較される。
未検査のヒト血液サンプルを使用するには、HIV(ヒト免疫不全ウイルス)、B型肝炎、C型肝炎などの感染症の潜在的な伝染を防ぐために、特定のケアが必要です。したがって、手袋、ガウン、マスク、目の保護などの個人的な保護対策の使用は非常に重要であり、良い実験室の実践原則に従う必要があります。これらの保護は、潜在的に感染性の液体に皮膚や粘膜を暴露するリスクを低減します。さらに、バフィーコートやPBMの取り扱いに関わる人には、B型肝炎ウイルスに対するワクチン接種が必須であり、抗体B型肝炎の血中抗体レベルは100 IU/Lを超える必要があります(国固有の立法要件に対処する必要があります)。さらに、すべての作業は、バイオセーフティレベル2の研究所で行う必要があります(国固有の立法要件に対処する必要があります)。実験室環境での作業や、廃棄物の取り扱いを含む哺乳類細胞培養の取り扱いに関する標準的な健康および安全上の注意は、プロトコル全体を実施する際に採用されるべきである。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchmark microplate reader</td>
			<td>does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Incubator</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container (for example Mr. Frosty)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>does not have to be specific, for example</td>
			<td>Zeiss LSM 710 meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatocytometer, or automatic cell counter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar bio-safety hood class II</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStand Macs (Macs Cell Separator)</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast inverted light microscope</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette boy, pipettors (different volumes)</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable small equipment/glassware</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353046 and 353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 &#956;m pore size</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapper</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass autoclaved Petri Dishes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>10040-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>A7030-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MicroBeads human - magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-097-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS, Norway</td>
			<td>1114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td>D5879_1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>E6758-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-093-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-095-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>4524-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 &#956;g/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 &#956;g/mL</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 &#956;g/mL</td>
			<td>Agrisera, Sweden</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 &#956;g/mL</td>
			<td>eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland</td>
			<td>14-0115-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 &#181;M</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab244204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment

ヒト肺胞細胞共培養モデルは、肺胞上皮II型細胞と2種類の免疫細胞(すなわちヒト単球由来マクロファージ[MDMs]および樹状細胞[MDMs])からなる肺胞上皮組織障壁のシミュレーションのためにここに記載されている。多細胞モデルを組み立てるためのプロトコルが提供される。歯槽上皮細胞(A549細胞株)は、2室のウェル内の透過性インサート上の水没条件下で増殖し、分化され、その後、分化されたMDMsおよびMDDCと組み合わされる。最後に、細胞は数日間空気液体界面に露出される。ヒトの原発性免疫細胞はヒトのバフィーコートから分離する必要があるので、新鮮な単球または解凍された単球から分化した免疫細胞を比較して、実験ニーズに基づいて方法を調整する。この3次元モデルは、単球由来の新しい細胞または解凍された単球由来免疫細胞を有する肺胞細胞で構成され、未治療細胞と比較して炎症促進性刺激(リポ多糖および腫瘍壊死因子α)への曝露時にサイトカイン(インターロイキン6および8)放出の統計的に有意な増加を示す。一方、コカルチャーにおいて観察されるサイトカイン放出との間に統計的に有意な差はない。これは、提示されたモデルが、新鮮または解凍された末梢血単球(PBM)と区別されるMDMおよびMDDCの存在下で炎症誘発刺激に反応することを示す。このように、エアロゾル化薬やナノ材料を含む、さまざまな物質に対する急性生物学的反応の調査のための強力なツールです。

肺胞上皮細胞と免疫細胞で構成されるヒト肺共培養モデルは、新鮮または凍結したMDDCおよびMDMs前駆体(ここでは、ヒト末梢血由来単球)から組み立てられた。図1に示すように、A549細胞は単球単球の単離/解凍を含む最初のセクションの3日後に播種した。6日間の分化後、分化したMDMは丸型に見え、MDDCは観察可能な突起でより細長い形状を形成した。また、特に新鮮な単球と区別された場合には、凝集体として現れました(図2、図3)。上皮細胞は、細胞の密な細胞層を形成し、膜インサート上で3日間増殖した後(図4)、共培養を組み立てたとき。24時間の組み立て後、さらに24時間のALI条件を受けた後、コカルチャーを曝露のために調製した。
3D細胞培養モデルの応答性を、前述の29に記載した擬似ALIアプローチを用いて既知の炎症誘発刺激に曝露した際に調査した。炎症促進刺激を、LPSおよびTNF-αは、空気露出細胞モデルの有端表面に少量(100μL)で添加した。並行して、細胞毒性の尺度としての膜破裂の欠如をLDHアッセイを介して評価した。基底コンパートメントのCCMにおけるLDH放出の有意な増加は、膜破裂に対する陽性制御への暴露時に観察された、洗浄剤Triton-X 100(図5)。これらの結果は、細胞毒性物質に対するモデルの応答性を証明したのに対し、TNF-αまたはLPSによる有端刺激ではLDH放出の増加は認められなかった。
新鮮なまたは以前に凍結したPBMを組み立てたサンプル中のLDHの異なる測定値の考えられる理由は、サンプルストレージに起因する可能性があります。新鮮なPBMからのサンプルは-80 °Cで長期間保存されました。したがって、LDH酵素の活性が低下する可能性があります。特に、LDH は CCM で 4 日間までだけ安定しています。したがって、上清を収集した後、最新の2日間のアッセイを行うことを推奨します。あるいは、コレクション後直ぐに上清を凍結することができる。しかし、凍結はLDHの酵素活性を低下させることができることを考慮することが重要である。
この基底CCMへの炎症促進メディエーター(ここでは、TNF-αおよびインターロイキン6[IL-6]および8[IL-8])の分泌は、ELISAを介して定量した。LPS-およびTNF-α-α処理サンプルの両方で、IL-6およびIL-8の放出における統計的に有意な(p<0.05、一方向ANOVA)の増加は、それぞれの未処理細胞と比較して、またPBM源から組み立てられた細胞培養モデルにおいて観察された(図6)。基礎CCM中の全ての試験サイトカインの濃度(pg/mL)は、新鮮なPBMで構成される共同培養において高かったが、2つの共同培養と単一培養の間の差は統計的に有意ではなかった(p> 0.05) (図6)。2D上皮細胞培養に関するコカルチャーモデルの付加価値を確認するために、A549単一培養もLPSまたはTNF-αに曝露した。予想通り、A549単一培養物からの調査されたメディエーターのリリースは、両方の共同培養モデルに比べて低かった。しかし、両者の差は統計的に有意ではなかった(p > 0.05、一方向の分散分析)。
3Dヒト肺胞上皮組織バリアの細胞形態は、共焦点レーザー走査顕微鏡(LSM)を介して評価した。各モデルの組成を可視化するために、コカルチャーモデル(MDM)内のマクロファージを成熟マクロファージマーカー25F9で染色した。MDDCはCD83で染色され、これは活性化樹状細胞30の重要なマーカーである。細胞形態に関しては、解凍されたPBMを使用する場合と比較して、新鮮なPBMからMDMとMDDCを使用するコカルチャーモデルの間に違いは認められなかった。LPS-およびTNF-α-暴露された共培養物では、いずれも新鮮な免疫細胞と凍結免疫細胞から構成され、LSM画像中の破壊された上皮層が観察されたが、未治療細胞には当てはまらなかった(図7、図8)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig01.jpg"> 図1:プロトコルの概略タイムライン3D共培養モデルの調製、組み立て、および適用(試験物質への暴露)の提示。ALI=空気液体界面、MDDc=単球由来樹状細胞、MDMs=単球由来マクロファージ、PBMs=末梢血単球。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig02.jpg"> 図 2: MDM と MDDC は、新鮮な PBM と区別されています。新鮮なPBMからの差別化(A)MMSおよび(B)MDDCの位相対視画像(細胞分離の6日後)。MDMは丸型であり、MDDCは凝集体として観察されることが多い。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig03.jpg"> 図 3: 冷凍 PBM と区別された MMS と MDDC分離された(A)MMSおよび(B)MDDCの相コントラストB顕微鏡画像(解凍後6日間)MMSは丸型ですが、一部の細長い細胞が観察される可能性があります。MDDCはまた、突起で丸い形で表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig04.jpg"> 図4:上皮細胞は膜挿入物上で増殖する。播種の4日後に膜挿入物上に成長するコンフルエントA549の位相対照顕微鏡画像は、細胞の密な層を形成する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig05.jpg"> 図5:膜破裂ベース(LDH)アッセイを介して調査した細胞傷害性の結果。データは、未処理の細胞に対する倍率増加として提示されます(平均±SD、n = 3、アスタリスクは未治療セルと比較して統計的に有意な増加を示し、**p< 0.01、****p < 0.0001)。緑色のモデルでは、新鮮なPBMからMDMとMDDCが表現され、解凍されたPBMから組み立てられた紫色のモデルで表現されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig06.jpg"> 図6:共培養および単一培養における炎症反応を示す。24時間にコカルチャーにおける炎症促進メディエーター(TNF-α、IL-6、およびIL-8)放出はLPSまたはTNF-αに挑戦する。データは、未処理のセルに対して相対的に表示されます (平均 ± SD, n = 3, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001)。緑色のモデルでは、新鮮なPBMからMDMとMDDCが表現され、解凍されたPBMから組み立てられた紫色のモデルで表現されます。グレーはA549の単一文化を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig07.jpg"> 図7:新鮮な免疫細胞からなる共同培養物の形態新鮮なPBMからMDMとMDDCを使用したモデルのアピカル側と核側面を持つ共培養モデルの補助的および基底面のLSM画像は、シアンは核(DAPI)を表し、マゼンタは細胞骨格(ローダミン-ファロイジン)を表し、白はMDMs(25F9)を表し、緑色はMDDCs(CD83)を表す。白い矢印は MDM を示し、緑の矢印は MDDC を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig07large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig08.jpg"> 図8:凍結免疫細胞からなる共同培養物の形態対応するxz投影を有する共培養モデルの元素側のLSM画像、および解凍されたPBMからMDMおよびMDDCを用いたモデルの基底側のLSM画像は核(DAPI)を表し、マゼンタは細胞骨格(ローダミン-ファロイジン)を表し、白はMDMs(CD83)を表す。白い矢印は MDM を示し、緑の矢印は MDDC を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig08large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

ここでは、原発性ヒト単球単球単球の分離に関するプロトコルと、マクロファージおよび樹状細胞への分化、および上皮細胞を有する多細胞ヒト肺モデルへの組み立てのためのプロトコルを提示する。免疫細胞からなる共培養物の生物学的応答は、単球または解凍された単球から分離し、炎症促進性刺激に曝露した際に、比較される。

危険評価のための上皮細胞と原発性免疫細胞からなる多細胞ヒト歯槽モデル

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

これらの個々のヒトオーディオモデルは、関連する免疫細胞を強力なツールとして使用して、ナノ材料や知識薬を含む物質の急性免疫応答を予測します。これらの医療は、ヒト上皮細胞とヒト初等免疫細胞を組み合わせて、これらの特異的反応を評価する。新鮮な、凍結した単球の使用は実験計画に柔軟性を提供する。このモデルは、行動感覚と免疫感覚の間の星間コミュニケーションに関する洞察を提供できることを、多くの研究が示しています。このデモには、細胞培養における個人的な形質をモデルに付けるための重要な詳細がすべて含まれているので、実験を再現するための視覚的な指示を示します。膀胱のプロトコルのいくつかのステップは複雑であり、特別な取り扱いを必要とする。したがって、簡単に従うことができるすべての必要な詳細を示しています。ヒトバフィーコートからの末梢血単球の分離のために、収穫バフィーコートバッグの内容物を250ミリリットルの円錐形チューブの間で均等に分割する。PBSで各チューブ250ミリリットルの総体積を慎重に持参し、3つの穏やかな反転とチューブを混合します。その後、バフィーコートPBS溶液を4つの新しい50ミリリットルチューブの間で均等に分割し、その後、チューブに7番目の総細胞をCD 14正の磁気ビーズの10マイクロリットルを追加し、ピペットによってよく混合します。充填時にピペットをピペットから取り外し、すぐにピペットの上部開口部を親指で差し込み、充填されたピペットを1つのチューブの底に置き、ピペット開口部を抜き、密度勾配媒体がピペットの中に1ミリリットル残るまで、バフィーコートPBS混合物の下にゆっくりと流れる密度勾配媒体を可能にします。密度勾配培地が各管に同じように添加された場合、密度勾配遠心分離により細胞を分離し、血漿と密度勾配媒体層の間から白2〜3ミリメートル厚末梢血単核細胞層を採取するための血清学的ピペットを使用する。層を接続する最善の方法は、最初にプラズマを除去し、次に細胞を収集するために私たちの論理的なピペットを抑制することです。2つのチューブの各セットから末梢血単核細胞を1つの新しい50ミリリットルチューブに引き出し、洗浄ごとに新鮮なPBSの合計体積50ミリリットルで細胞を2回洗浄します。その後、上清を捨て、新鮮なPBSの5ミリリットルでそれぞれピペットを再中断し、セルの懸濁液をカウント用の単一のチューブにプールします。カウント後、再び細胞を遠心分離し、7番目の細胞に出席して1回80ミリリットルの磁気分離バッファーにペレレットを再懸濁する。その後、チューブに7番目の総細胞に出席するごとにCD 14陽性磁気ビーズの10マイクロリットルを追加し、ピペットによってよく混合します。摂氏4度で15分間のインキュベーションを行った後、3ミリリットルの磁気分離バッファーで磁気カラムをリンスし、セルをカラムに加えます。1回の洗浄で3ミリリットルのバッファーでカラムを3回洗浄し、新鮮な磁気分離バッファーの1ミリリットルを含む15ミリリットルチューブにカラムを移します。次に、プランジャーと5ミリリットルのバッファーを使用して、CD 14陽性細胞をチューブにフラッシュします。磁気ビーズ単離CD14陽性細胞の分化を誘導する。まず、細胞培養培地中のミリリットル濃度当たり6細胞に一度に再懸濁する。MDDC分化は、チューブに1ミリリットル当たり10ナノグラムを加え、グラナサイトマクロファージコロニー刺激因子を加え、6つのウェル細胞培養プレートの各ウェルウェルに3ミリリットルの細胞を加える、またはMDM分化は、ちょうど実証したように細胞に1ミリリットル当たり10ナノグラムのマクロファージコロニー刺激因子を加え、細胞をプレートする。ヒト肺胞上皮細胞組織トリプル細胞共培養モデルを設定するには、まず1.5ミリリットルのプレウォーム細胞培養培地を12ウェルプレートの適切な数のウェルに移し、細胞培養インサートを各ウェルに入れる。次に、500マイクロリットルの上皮細胞懸濁液を5倍の密度で500マイクロリットルから1ミリリットル当たり5番目の細胞を各挿入物のアプリカル側に加え、細胞培養インキュベーターで4日間プレートを覆う。またはMDDC播種は、MDDC分化に使用される6つのウェルプレートのウェルズからの上清を1ミリリットルの新鮮な温細胞培養培地に置き換え、細胞スクレーパーを使用して各ウェルから接着細胞を取り外す。各井戸を上華で3回洗い、各ウェルで洗浄し、すべての細胞溶液を1つの遠心分離管に組み合わせます。遠心分離と無菌ピンセットによって収穫されたMDDCは、無菌ペトリ皿に12ウェルプレートからのインサートを逆さまに配置する。挿入物の基底側から任意の上皮細胞を掻き取り、新鮮な細胞培養培地中のMDDCを再中断し、この細胞の濃度をミリリットル当たり10倍にする。次に、各インサートに150マイクロリットルのセルを加え、挿入物の基底面全体が泡なしで液体で均等に覆われるようにします。MDDCに対して実証された分化MDDMを収穫した後のMDDM播種の場合、細胞を新鮮な細胞培養培地濃度の4ミリリットル当たり2.5倍に希釈し、各上皮細胞およびMDDC含有細胞培養インサーの壁に500マイクロリットルの細胞を加え、蓋をプレートに置き、プレートにプレートにプレートを置く。翌日、各細胞培養インサートとウェルズの補助領域と基底領域の両方から上清を吸引する。その後、ピンセットを殺菌してウェルズからインサートを持ち上げ、600マイクロリットルの新鮮なプリウォームを細胞培養培地に各ウェルに加えます。6日間の分化の後、MDMは形状が丸く表示され、MDDCはより細長い形状と観察可能な突起を持つ細胞で構成されたクラスターを形成します。膜挿入物上で3日間の増殖の後、上皮細胞は膜破断に対する陽性対照への暴露時に基底コンパートメントの細胞培養培地において高密度の高い乳酸デヒドロゲナーゼ放出の有意な増加を認め、細胞傷害性物質に対するモデルの応答性を証明する。TNFアルファまたはLPSによるアプリカル刺激で測定した乳酸デヒドロゲナーゼ放出の増加なし。IL6およびIL8の放出における統計的に有意な増加は、未処理細胞の対照と比較してLPSおよびTNFアルファ処理サンプルの両方で観察される。新末梢血単球由来のMDDMとMDDcを用いた共培養モデルと、LPSおよびTNFα露出共培養で解凍細胞を用いたものと比較して、細胞形態の違いは認められず、破壊された上皮層が観察された。気道や気管支の細胞などの他のタイプのヒト細胞を用いることができ、他の端点も解析できる。主に研究者は、セットアップに似ていますが、異なる細胞タイプを使用して、この技術に触発されています。

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外植片から成長した初代ヒト気管支上皮細胞

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Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

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