Name: multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment
Uploaded: 2020-05-06T13:30:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Dr. Miguel Spuch-Calvar for coculture ordningen i figur 3 og til Dr. Bedia Begum Karakocak for kritisk lesing. Denne studien ble støttet av PATROLS-prosjektet, EUs Horizon 2020 Research and Innovation Programme i henhold til tilskuddsavtale nr. B.D. takker Peter und Traudl Engelhorn foundation for økonomisk støtte.

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Fremvoksende produksjon av nye materialer, inkludert kjemikalier og narkotika, øker gradvis behovet for prediktive in vitro-modeller. For å overholde de tre prinsippene for utskifting, reduksjon og raffinement avdyretesting 32,in vitro celle modeller har blitt kraftige verktøy om erstatning og reduksjon aspektet for å belyse mekanismer av et stoff eller materialets handling8,9,10,11. Presentert her er en detaljert protokoll for montering av flercellet modell ved hjelp av immunceller som enten er nyisolerte eller tint fra tidligere frosne monocytter. Også beskrevet er dyrking av modellen på ALI. Til slutt illustrerer protokollen et eksempel på eksponering for proinflammatoriske stimuli og sammenligner responsen fra de to modellene som inneholder enten friske eller frosne monocytter.
Ulike studier har blitt utført for å bekrefte og rettferdiggjøre merverdien av den forbedrede kompleksiteten til modellene dyrket og utsatt under ALI forhold sammenlignet med konvensjonell nedsenketeksponering 7,,22,,31. Observasjon av høyere proinflammatoriske respons hos kokulturer sammenlignet med monokulturer av epitelceller bekrefter en tidligere studie. Studien brukte den presenterte kokulturmodellen (stimulert med LPS) og viste en høyere respons på genuttrykksnivåer av TNF og IL1B sammenlignet med A549 monokulturekvivalent modell7. På den annen side viste begge modellene høyere variasjoner innenfor målte proinflammatoriske meklerutgivelsesverdier sammenlignet med A549 monokulturer. Dette kan forklares ved bruk av immunceller fra forskjellige donorer (buffy coats) i biologiske repetisjoner (det vil si en repetisjon, en donor), som tidligere vist7. Hvis ønskelig, kan variasjonene blant replikere overvinnes med 1) ved hjelp av tinte PBMs fra samme donor eller 2) pooling PBMs fra forskjellige givere før frysing av cellene, deretter etterfølgende bruk av samme basseng i hver repetisjon. Inkludert mer biologiske repetisjoner anbefales også.
Cellefrysingsteknikken kan betraktes som et kritisk skritt; Det er imidlertid en vanlig laboratorieprosedyre for å bevare celler for fenotypisk og funksjonell analyse. Ulike studier har vist at kvaliteten på frosne PBMs er avgjørende for deres overlevelse, og en passende fryseteknikk er nøkkelen til suksessen til påfølgende analyser med de samme cellene28,32. Endring av protokollen kan utføres ved frysing pbms, som gir fleksibilitet i eksperimentell oppsett, som tilgjengeligheten av buffy strøk er vanligvis begrenset. En annen fordel med å bruke frosne PBMs (i flere hetteglass) over nyisolerte er at de kan brukes i etterfølgende eksperimenter selv etter 1 år. Dette reduserer det potensielle spørsmålet om donor-til-donor-variasjon hvis dette er en ønsket eller nødvendig parameter i en eksperimentell.
Resultatene av en interlaboratorisk sammenligning utført etter opptil 13 måneder viser at PBMs, når de er riktig lagret i en flytende nitrogentank, kan brukes over en lang periode uten noen effekt på celle levedyktighet eller cellegjenoppretting33. Lengre lagringstider (over 1 år) kan være mulig ved nøye validering av cellelevebilitet og cellerespons før du utfører et eksperiment. Temperaturen i den flytende nitrogentanken må også holde seg stabil til enhver tid. Hovedfaktoren som påvirker levedyktigheten til kryoreserverte PBMer ble funnet å være DMSO konsentrasjon, med en optimal konsentrasjon på 10%–20 % (v/v)28. For å minimere potensielt skadelige effekter av frysing, blir ulike kilder til proteiner, FBS eller BSA (med et bredt spekter av konsentrasjon fra 40% opp til 100 %34) ofte lagt til frysemediet som naturlige beskyttende komponenter som kan øke celleoverlevelse.
På grunn av det høye cytotoksiske potensialet til DMSO, anbefales det først å spre PBMs i FBS, og deretter legge DMSO til PBMs allerede spredt i FBS. Spesielt, selv om høyere FBS konsentrasjoner (> 40%) viste ingen forbedring i celle levedyktighet, samtidig forårsaket de ikke skade på cellene28. Likevel er frysing monocytter en mulig tilnærming til å overvinne problemer med begrenset buffy pels tilgjengelighet. Hvis bruk av MDDCer og MDM-er fra ferske PBM-er er ønsket, kan imidlertid immuncellene differensieres og brukes 5–8 dager etter isolasjon7,,16,,17,,35,,36,,37. Hvis eksperimentell planlegging tillater det, anbefales minst 6 dagers differensiering i både MDDCer og MDM-er. Konsistensen mellom ulike repetisjoner i samme eksperiment, sammen med rutinemessige inspeksjoner av deres spesifikke overflatemarkøruttrykk, er imidlertid avgjørende. Responsen på en proinflammatoriske stimulans, som LPS, etter differensieringstiden, bør også kontrolleres regelmessig.
Mange undersøkelser ved hjelp av A549 cellelinjen har blitt utført på ALI, enten som en monokultur eller kombinert med andre celletyper (makrofager, dendrittiske celler, eller fibroblaster) i 3D kokultur modell22,24,29,38. Ved hjelp av denne 3D kokulturmodellen har cytotoksisitet, oksidativt stress eller proinflammatoriske effekter av (nano-)materialer blitt undersøkt i opptil 72 t1,,17,,21,,24,,29. Modellens likhet med in vivo vev har tidligere blitt undersøkt basert på confocal laser skanning avbildning av modellen16. Når du monterer modellen, er det viktig å vurdere både cellespredning (som kan påvirke A549 i modellen som presenteres her) samt ytelsen til de primære (ikke spre) immuncellene (her MDDCer og MDM). Det er også viktig å vurdere at ikke alle CD14 positive monocytter skiller seg inn i MDDCer og MDM-er, og at cellene kan være til stede i både vedlagte og suspenderte former. Basert på arten av kokulturenheten (her må begge celletypene festes til det eksisterende epitellaget), anbefales det å bruke bare de tilslutnende underpopulasjonene av begge immuncelletyper. I tillegg har rutinemessige analyser av monocytter, MDDC og MDM monokulturrespons til LPS, og uttrykk for spesifikke overflatemarkører (CD14, CD163, CD86, CD93 eller CD206, data som ikke vises) antydet at 6 og 7 dager med differensiering er de optimale tidspunktene.
Selv om et realistisk antall alveolr epitelceller i menneskelige lunger tilsvarer ~ 160.000 celler / cm2, er antall A549-celler talt i modellen ~ 1.000.000 celler / cm2 etter 9 dager kultivert på innsatsen16,18. Dermed må denne in vitro-modellens begrensninger vurderes. For det første ble tettheten av epitelceller etablert basert på deres evne til å danne et samløpet lag på den voksende membranen. Det er også viktig å nevne at A549 representerer en epiteltype II-celle med en cuboidal form, i motsetning til epiteltype I-celler, som er flate og outspread. På den annen side ble det nødvendige antallet immunceller etablert basert på litteraturen og presentert i denne protokollen som cellenummer / overflateareal39,40,41. Celletettheten til MDDCer i området 400 celler/mm2 (4 celler/cm2)16 kan sammenlignes med steady-state celletettheten på 500–750 celler/mm2 (5- 7 celler/cm2) rapportert fra in vivo-studier39. Tettheten av MDMs i denne modellen er innenfor samme spekter av in vivo situasjon i den menneskelige alveolr regionen40.
Eldre makrofagmarkørfarging (25F9) ble observert både på den a apiske siden (der MDM-er er til stede) samt basalsiden (det vil vil vil at det er på stedet av dendrittiske celler). Translokasjon av immunceller gjennom membranen setter porene er mulig og har også blitt observert ved hjelp av denne modellen16, noe som kan forklare de observerte forskjellene i fargingsintensiteter. En annen mulig forklaring er imidlertid at den modne makrofagmarkøren også kan uttrykkes på dendrittiske celler, men uttrykket er svært giverspesifikt42. Intensiteten av 25F9-uttrykket er også mye høyere i MDMs (figur 7, figur 8). Både proinflammatoriske stimuli (LPS og TNF-α) påvirket integriteten til lungeepitelbarrieren i begge kokulturer (figur 7, figur 8). Dette var forventet basert påtidligere publikasjoner 43,44 viser at proinflammatoriske cytokiner og bakterielle produkter forstyrre integriteten til epitelbarrierer.
3D multicellulær modell av det humane alveolære epitelet, etablert og karakteriserttidligere 17,har fungert som et kraftig og nyttig verktøy for å vurdere biologiske responser (det vil vil vil at akutte proinflammatoriske reaksjoner, oksidativ stressrespons, partikkeldistribusjon og cellulær kommunikasjon) in vitro21,24,25,45. Resultatene bekrefter ansvaret for kokulturmodeller til proinflammatoriske stimuli (her LPS og TNF-α). Responsen ble litt økt ved bruk av immunceller fra ferske PBMs; Det var imidlertid ingen statistisk signifikant forskjell mellom kokulturer ved bruk av ferske vs. tinte PBMer. Videre var de proinflammatoriske reaksjonene til begge kokulturmodellene høyere enn de av epitelcellemonokulturer dyrket under samme (ALI) forhold. Oppsummert beskriver protokollen monteringen av en 3D human alveolr epitelvevkokulturmodell ved hjelp av enten friske eller tinte PBMer for differensiering i MDMs og MDDCer. Det er vist at begge modellene er svært lydhøre for proinflammatoriske stimuli; Derfor kan de tjene som kraftige verktøy for potensielle fare- og toksisitetsvurderinger.

In vitro lungecellekulturer tilbyr kostnadseffektive, robuste og velkontrollerte plattformer for å vurdere farene ved aerosoler1. Som et modellcellesystem for humane alveolære pneumocytter brukes den epiteliske A549-cellelinjen isolert fra et lungeadenokarsinomofte 2. Disse cellene representerer plateepitelceller type II fra alveolrområdet3 og er en mye brukt lungecellelinje for fare- og toksisitetsvurdering1,,4,,5,,6,,7,,8,,9,,10. A549-cellelinjen har relevante trekk ved alveoler epiteltype II-celler, for eksempel tilstedeværelsen av karakteristiske lamellerlegemer som inneholder tettpakkede fosfolippider3.
Det har vist seg at når cellene er dyrket på et luftvæskegrensesnitt (ALI), frigjøres overflateaktivt middel på den a apiske siden av luftutsatte epitelceller, noe som redusereroverflatespenningen 11,12,,13. Denne funksjonen er spesielt viktig i nanomateriale respiratoriske respirasjonsfare- og toksisitetsundersøkelser. Når inhalerte nanomaterialer/toksikosmidler deponeres i alveolrområdet, samhandler de først med lungeovervveningsmiddel og forskyves ved å fukte krefter inn i vandig hypofase, hvor samspillet med lungecellerfinner sted 14,15. Selv om A549-celler danner en monolayer (som kan overvekst i flerlags ved senere tidspunkter når de dyrkes ved ALI) og produserer overflateaktivt middel, er en ulempe deres utilstrekkelige tette koblingsdannelse, noe som resulterer i lave transepitheliale elektriske motstandsverdier, men fortsatt presenterer en funksjonell barriere mot intercellulære (nano)partikler translokasjon16,17,18.
I lungene er det en rekke immuncellepopulasjoner, inkludert fagocytiske og profesjonelle antigen-presenterende celler (det vil si makrofager og dendrittiske celler) som direkte kommuniserer gjennom cellecellekontakt eller intercellulær signalisering for å kontrollere og opprettholde homeostase. Makrofager og dendrittiske celler er kritiske medfødte immuneffektorer og initiativtakere til adaptiv immunrespons19. Dendrittiske celler som bor i eller under epitelet kan danne fremspring over epitelet til lumen for å fange antigener. Alveolr makrofager ligger på den akaliske overflaten av epitelet og fungerer som sentinel celler, som representerer det første cellulære forsvaret mot fremmedlegemer samt bakterielle, virale og soppinfeksjoner. Deres fenotypisk plastisitet tillater raskt induksjon av proinflammatoriske reaksjoner som svar på slike stimuli, samt skifte til å utløse antiinflammatoriske (det vil si hemmende) reaksjoner20.
For å simulere den menneskelige alveolær epitelvevbarrieren etablerte vi en trippel kokulturmodell med A549-celler supplert med humant blodmon monocyttavledede makrofager (MDM) og dendrittiske celler (MDDCer) på de apiske og basale sidene,henholdsvis 17. Dyrking av denne modellen ved ALI har tidligere blitt rapportert16, selv opp til 72 h etter eksponering21. Akutte immunresponser mot eksponeringer av karbonnanorør ble betydelig forbedret i cellekulturen utsatt for ALI sammenlignet med nedsenkede forhold22. Kokulturmodellen, kultivert og utsatt for ulike materialer ved ALI, har tidligere blitt brukt til å undersøke cytotoksisitet, oksidativt stress og inflammatoriske responser på eksponeringer for sinkoksid,23 grafenrelatertematerialer 24, gullnanopartikler25,,26, karbonnanorør21, og vulkansk aske og diesel eksospartikler27.
Videre er makrofagenes og dendrittiske cellers viktige rolle som immuneffektorceller i en in vitro human lungemodell bekreftet. Spesielt ble en økt proinflammatoriske respons i modellen kun observert i nærvær av immunceller sammenlignet med monokultursystemer7. Potensielle ulemper ved å bruke primære monocytt-avledede immunceller er begrenset tilgjengelighet av PBMs samt donor-til-donor variasjon. Som en løsning på disse potensielle ulempene, presentert her er en protokoll som introduserer kryopreservation av nyisolerte PBMs28 for cellekulturmodellenheten. Målet med denne studien er å demonstrere 3D human alveolar epitelvev modell montering, inkludert isolering av PBMs fra menneskelige buffy strøk. Responsen til proinflammatoriske stimuli sammenlignes med modellen bestående av MDM-er og MDDCer differensiert fra ferske PBMs eller differensiert fra frosne/tinte PBMs.
Arbeid med utestede blodprøver innebærer spesifikk forsiktighet for å forhindre potensiell overføring av smittsomme sykdommer, som HIV (humant immunsviktvirus), hepatitt B og hepatitt C. Derfor er bruk av personlige beskyttelsestiltak som hansker, kjoler, masker og øyebeskyttelse avgjørende og må være i samsvar med gode laboratoriepraksisprinsipper. Disse beskyttelsene reduserer risikoen for å utsette huden eller slimhinnene for potensielt smittsomme væsker. I tillegg, for de som er involvert i håndtering av buffy strøk og PBMs, vaksinasjon mot hepatitt B-viruset er obligatorisk, og blod titer nivåer av antistoffer anti-hepatitt B må være over 100 IE / L (landspesifikke lovkrav må løses). I tillegg må alt arbeid utføres i biosikkerhetsnivå 2 laboratorier (landsspesifikke lovkrav må tas opp). Standard helse- og sikkerhetsforanstaltninger knyttet til arbeid i et laboratoriemiljø og håndtering av pattedyrcellekultur, herunder håndtering av avfall, bør vedtas ved gjennomføring av hele protokollen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchmark microplate reader</td>
			<td>does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Incubator</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container (for example Mr. Frosty)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>does not have to be specific, for example</td>
			<td>Zeiss LSM 710 meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatocytometer, or automatic cell counter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar bio-safety hood class II</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStand Macs (Macs Cell Separator)</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast inverted light microscope</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette boy, pipettors (different volumes)</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable small equipment/glassware</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353046 and 353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 &#956;m pore size</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapper</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass autoclaved Petri Dishes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>10040-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>A7030-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MicroBeads human - magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-097-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS, Norway</td>
			<td>1114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td>D5879_1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>E6758-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-093-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-095-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>4524-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 &#956;g/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 &#956;g/mL</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 &#956;g/mL</td>
			<td>Agrisera, Sweden</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 &#956;g/mL</td>
			<td>eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland</td>
			<td>14-0115-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 &#181;M</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab244204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment

En menneskelig alveolær cellekokulturmodell er beskrevet her for simulering av alveolær epitelvevbarrieren som består av alveolr epitelceller av type II og to typer immunceller (det vil si menneskelige monocyttavledede makrofager [MDM] og dendrittiske celler [MDDCer]). En protokoll for montering av den flercellede modellen er gitt. Alveolar epitelceller (A549 cellelinje) dyrkes og differensieres under nedsenkede forhold på gjennomtrengelige innsatser i to-kammerbrønner, deretter kombinert med differensierte MDM-er og MDDCer. Til slutt blir cellene utsatt for et luftvæskegrensesnitt i flere dager. Som menneskelige primære immunceller må isoleres fra menneskelige buffy strøk, immunceller differensiert fra enten friske eller tint monocytter sammenlignes for å skreddersy metoden basert på eksperimentelle behov. De tredimensjonale modellene, bestående av alveolære celler med enten nyisolert eller tint monocyttavledede immunceller, viser en statistisk signifikant økning i cytokin (interlekin 6 og 8) frigjøring ved eksponering for proinflammatoriske stimuli (lipopolysakkarid og tumornekrosefaktor α) sammenlignet med ubehandlede celler. På den annen side er det ingen statistisk signifikant forskjell mellom cytokinfrigjøring observert i kokulturene. Dette viser at den presenterte modellen er lydhør overfor proinflammatoriske stimuli i nærvær av MDM-er og MDDCer differensiert fra friske eller tinte perifere blodmonocytter (PBMs). Dermed er det et kraftig verktøy for undersøkelser av akutt biologisk respons på forskjellige stoffer, inkludert aerosoliserte stoffer eller nanomaterialer.

Modeller for human lungekokultur, bestående av alveolærepitelceller og immunceller, ble satt sammen enten fra friske eller frosne MDDCer og MDMs forfedre (her humane perifere blodavledede monocytter). Som presentert i figur 1ble A549-cellene seeded 3 dager etter den første delen som involverte monocyttisolering/tining. Etter 6 dager med differensiering dukket de differensierte MDM-ene opp rundt, mens MDDCer dannet en mer langstrakt form med observerbare fremspring. De dukket også opp som agglomerater, spesielt når differensiert fra friske monocytter (Figur 2, Figur 3). Epitelceller dannet et tett cellelag av celler etter 3 dager med vekst på membraninnlegg (figur 4), da kokulturene ble montert. Etter 24 timer montering og ytterligere 24 timer med å bli utsatt for ALI-forhold, ble kokulturene forberedt på eksponeringer.
Responsen til 3D-cellekulturmodellene ble undersøkt ved eksponering for kjente proinflammatoriske stimuli ved hjelp av en pseudo-ALI-tilnærming, som beskrevet tidligere29. Proinflammatoriske stimuli, LPS og TNF-α, ble tilsatt i lave volumer (100 μL) på den aketiske overflaten av den luftutsatte cellemodellen. Parallelt ble fraværet av membranbrudd som et mål på cytotoksisitet vurdert via LDH-analyse. En signifikant økning i LDH-frigjøring i CCM i basalrommet ble observert ved eksponering for positiv kontroll for membranbrudd, et vaskemiddel Triton-X 100 (figur 5). Disse resultatene viste seg å være en reaksjonsevne for et cytotoksisk stoff, mens det ikke ble observert noen økning i LDH-frigjøring ved aksisk stimulering med TNF-α eller LPS.
En mulig årsak til de ulike målte verdiene for LDH i prøvene som er montert med enten ferske eller tidligere frosne PBMer, kan tilskrives prøvelagringen. Prøver fra ferske PBMs ble lagret i lengre tid ved -80 °C; Aktiviteten til LDH-enzymet kan derfor synke. Spesielt er LDH stabil i bare opptil 4 dager i CCM; dermed anbefales det å utføre analysen de siste 2 dagene etter innsamling av supernatantene. Alternativt er det mulig å fryse ned supernativa direkte etter innsamling. Det er imidlertid viktig å vurdere at frysing kan redusere den enzymatiske aktiviteten til LDH.
Sekresjon av proinflammatoriske meklere (her ble TNF-α og interleukins 6 [IL-6] og 8 [IL-8]) i basal CCM kvantifisert via ELISA. Statistisk signifikante (p < 0,05, enveis ANOVA) økninger i utgivelsen av IL-6 og IL-8 ble observert i både LPS- og TNF-α-behandlede prøver sammenlignet med respektive ubehandlede celler, samt i cellekulturmodellene som er satt sammen fra enten PBMs kilde (figur 6). Selv om konsentrasjonene (pg/ml) av alle de testede cytokinene i basal CCM var høyere i kokulturene bestående av ferske PBMer, var forskjellene mellom de to kokulturene og monokulturene ikke statistisk signifikante (p > 0,05) (figur 6). For å bekrefte merverdien av kokulturmodeller med hensyn til en 2D epitelcellekultur, ble A549 monokulturer også utsatt for LPS eller TNF-α. Som forventet var utgivelsen av alle undersøkte meklere fra A549 monokulturer lavere sammenlignet med begge kokulturmodellene; selv om forskjellen mellom dem ikke var statistisk signifikant (p > 0,05, enveis ANOVA).
Cellulær morfologi av 3D human alveolr epitelvev barriere ble vurdert via konfokal laser skanning mikroskopi (LSM). For å visualisere sammensetningen av hver modell, ble makrofager i kokulturmodellene (MDM-er) farget med moden makrofagmarkør 25F9. MDDCs ble farget med CD83, som er en viktig markør for aktiverte dendrittiske celler30. Når det gjelder cellulær morfologi, ble det ikke observert noen forskjell mellom kokulturmodellene ved hjelp av MDM-er og MDDCer fra ferske PBMer sammenlignet med de som bruker tinte PBMs. I LPS- og TNF-α-eksponerte kokulturer, både sammensatt av friske og frosne immunceller, ble det observert et forstyrret epitellag i LSM-bilder, som ikke var tilfelle i ubehandlede celler (figur 7, figur 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk tidslinje for protokollen. Presentasjon av 3D kokultur modell forberedelse, montering og anvendelse (eksponering for et testet stoff). ALI = luft-flytende grensesnitt, MDDCs = monocytt-avledede dendrittiske celler, MDMs = monocytt-avledede makrofager, PBMs = perifere blod monocytter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig02.jpg"> Figur 2: MDM-er og MDDCer differensiert fra ferske PBMer. Fasekontrast mikroskopibilde av differensierte (A) MDM-er og (B) MDDCer fra ferske PBMs (6 dager etter celleisolering). MDM-er er rundeformede, mens MDDCer ofte observeres som agglomerater. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig03.jpg"> Figur 3: MDM-er og MDDCer differensiert fra frosne PBMer. Mikroskopi av fasekontrast av differensierte (A) MDM-er og(B) MDDCer fra tinte PBMer (6 dager etter tining). MDMs er rundformede, men noen langstrakte celler kan observeres. MDDCer vises også rundformed med fremspring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig04.jpg"> Figur 4: Epitelceller vekst på membraninnsatser. Fasekontrast mikroskopi bilde av samløpet A549 vokser på en membran innsats 4 dager etter seeding, danner et tett lag av celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig05.jpg"> Figur 5: Cytotoksisitetsresultater undersøkt via membranbruddsbasert (LDH)-analyse. Dataene presenteres som en fold økning over ubehandlede celler (gjennomsnitt ± SD, n = 3, stjerne betegner statistisk signifikant økning sammenlignet med ubehandlede celler, ** p < 0,01, **** p < 0,0001). I grønne modeller er MDM-er og MDDCer fra ferske PBMer representert, og i lilla modeller som er montert fra tinte PBMer er representert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig05large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig06.jpg"> Figur 6: Proinflammatoriske reaksjoner i kokulturer og monokulturer. Proinflammatoriske meklere (TNF-α, IL-6 og IL-8) slippes ut i kokulturene på 24 h utfordring med LPS eller TNF-α. Dataene presenteres i forhold til ubehandlede celler (gjennomsnitt ± SD, n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). I grønne modeller er MDM-er og MDDCer fra ferske PBMer representert, og i lilla modeller som er montert fra tinte PBMer er representert. Grå representerer A549 monokulturer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig06large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig07.jpg"> Figur 7: Morfologi av kokulturer bestående av friske immunceller. LSM-bilder av apiske og basale sider av kokulturmodellen med xz-projeksjoner av apiske sider av modellen ved hjelp av MDM-er og MDDCer fra ferske PBMs. Cyan representerer kjerner (DAPI), magenta representerer cytoskeleton (rhodamine-phalloidin), hvitt representerer MDMs (25F9), og grønn representerer MDDCs (CD 83). Den hvite pilen angir MDM, mens den grønne pilen angir MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig07large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig08.jpg"> Figur 8: Morfologi av kokulturer bestående av frosne immunceller. LSM-bilder av den apiske siden av kokulturmodellen med tilsvarende xz-projeksjoner, og basal side av modellen ved hjelp av MDM-er og MDDCer fra tinte PBMs. Cyan representerer kjerner (DAPI), magenta representerer cytoskeleton (rhodamine-phalloidin), hvitt representerer MDMs (25F9), og grønn representerer MDDCs (CD 83). Den hvite pilen angir MDM, mens den grønne pilen angir MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig08large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment at JoVE.com

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Presentert her er en protokoll for primær humant blod monocytt isolasjon samt deres differensiering i makrofager og dendrittiske celler og montering med epitelceller i en flercellet menneskelig lungemodell. Biologiske responser av kokulturer bestående av immunceller differensiert fra enten nyisolerte eller tinte monocytter, ved eksponering for proinflammatoriske stimuli, sammenlignes.

Flercellet human alveolærmodell bestående av epitelceller og primære immunceller for farevurdering

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Disse individuelle menneskelige lydmodellen bruker relevante immunceller som et kraftig verktøy for å forutsi akutt immunrespons av stoffer, inkludert nanomaterialer og kunnskapsmedisiner. Disse medisinske kombinerer menneskelige epitelceller og humane primære immunceller for å vurdere de spesifikke reaksjonene. Bruk av friske og frosne monocytter gir fleksibilitet for eksperimentplanen.Tallrike studier har vist at denne modellen kan gi et innblikk i den interstellare kommunikasjonen mellom en atferdsfølelse og immunsans. Siden denne demonstrasjonen inneholder alle viktige detaljer for studing modellen en personlig egenskap i cellekultur, visuelle instruksjoner for å gjenskape eksperimenter. Flere trinn i blærens protokoll er komplekse og krever spesiell håndtering.Derfor er de demonstrert med alle nødvendige detaljer som de lett kan følges. For isolering av perifere blodmon monocytter fra menneskelige Buffy strøk, dele høsten Buffy pels bag innhold, jevnt mellom 250 milliliter koniske rør. Ta forsiktig det totale volumet i hvert rør 250 milliliter med PBS og bland rørene med tre milde inversjoner.Del deretter Buffy coat PBS-løsningen likt mellom fire nye 50 ml ml, og legg deretter til 10 mikroliter CD 14 positive magnetiske perler de syvende totalcellene til røret og bland godt ved å pipettering. Ved fylling, koble pipetten fra pipetteren og umiddelbart plugget den øvre åpningen av pipetten med en tommel og plasserte deretter den fylte pipetten nederst på ett rør og kobler fra pipetteåpningen slik at tetthetsgradientmediet sakte kan strømme under buffy coat PBS-blandingen, til en milliliter av tetthetsgradientmediet er igjen inne i pipetten. Når tetthet gradient medium er lagt til hvert rør på samme måte skille cellene ved tetthet gradient sentrifugering og bruke en serologisk pipette for å samle den hvite to til tre millimeter tykk periferblod mononukleære celle lag fra mellom plasma og tetthet gradient middels lag.Den beste måten å koble laget på er å fjerne plasmaet først, og deretter undertrykker du våre logiske pipetter for å samle cellene. Trekk de perifere blodmonukleære cellene fra hvert sett med to rør inn i ett nytt 50 milliliter rør og vask cellene to ganger med et totalt volum på 50 milliliter frisk PBS per vask. Kast deretter supernatant og resuspend pipetten i hver i fem milliliter med fersk PBS og pool celle suspensjoner i et enkelt rør for telling.Etter telling, sentrifuge cellene igjen og resuspend pelette til 80 milliliter magnetisk separasjonbuffer per delta på de syvende cellene. Tilsett deretter 10 mikroliter cd 14 positive magnetiske perler per delta på de syvende totalcellene til røret og bland godt ved pipettering. Etter en 15 minutters inkubasjon ved fire grader Celsius skyll en magnetisk kolonne med tre milliliter magnetisk separasjonsbuffer og legg cellene til kolonnen.Vask kolonnen tre ganger med tre milliliter buffervolum per vask og overfør kolonnen til et 15 milliliter rør som inneholder en milliliter frisk magnetisk separasjonsbuffer. Bruk deretter stempelet og fem milliliter buffer til å skylle CD 14 positive celler inn i røret. Induser differensiering av den magnetiske perlen isolerte CD 14 positive celler.Først, resuspend cellene på en gang delta på de seks cellene per milliliter konsentrasjon i cellekultur medium. Eller MDDC differensiering, tilsett 10 nanogram per milliliter og av granula området makrofag koloni stimulerende faktor til røret og legge til tre milliliter celler til hver brønn av en seks brønn celle kultur plate, eller MDM differensiering legge 10 nanogram per milliliter makrofag koloni stimulerende faktor til cellene og plate cellene som nettopp demonstrert. For å sette opp en menneskelig alveolær epitelcellevev trippelcellekokulturmodell, må du først overføre 1,5 milliliter med pre-varm cellekulturmedium til riktig antall brønner av en 12-brønnplate og plasser en cellekulturinnsats i hver brønn.Deretter legger du til 500 mikroliter epitelcelleoppheng med en tetthet på fem ganger 10 til de femte cellene per milliliter i den apiske siden av hver innsats og dekker platen for en fire dagers inkubasjon i cellekulturinkubatoren. Eller MDDC seeding erstatter supernatant fra brønnene av seks brønnplater som brukes til MDDC differensiering, med en milliliter fersk varm celle kultur medium og bruke en celle skrape for å løsne tilslutningscellene fra hver brønn. Vask hver brønn tre ganger med supernate og i hver brønn og kombinere alle celleløsninger i en enkelt sentrifuge rør.Den høstede MDDC ved sentrifugering og sterile pinsett for å plassere innsatsene fra de 12 brønnplatene opp ned i en steril petriskål. Skrap eventuelle epitelceller fra Basal-siden av innsatsen og gjenoppliv MDDCene i fersk cellekulturmedium gjør en konsentrasjon på 4,2 ganger 10 av disse cellene per milliliter. Tilsett deretter 150 mikroliter celler på hvert innlegg slik at hele basaloverflaten av innsatsen er like dekket med væsken uten bobler.For MDDM-seeding etter høsting av differensierte MDDMer som demonstrert for MDDC-ene, fortynne cellene til en 2,5 ganger 10 til de fire cellene per milliliter av fersk cellekulturmediumkonsentrasjon og legg til 500 mikroliter celler ned veggen i hver epitelcelle og MDDC som inneholder cellekulturinnsats, og plasser lokket på platen og legg platen i en cellekulturinkubator i 24 timer. Neste dag aspirerer overnatanten fra både de a apiske og basale områdene i hver cellekulturinnsats og Wells. Deretter steriliserer du pinsett for å løfte innsatsene fra brønnene og legge til 600 mikroliter frisk prewarm til cellekulturmedium til hver brønn.Etter seks dager med differensiering vises MDM-ene runde i form, mens MDDCer danner klynger som består av celler med en mer langstrakt form og observerbare fremspring. Etter tre dager med vekst på membraninnlegg danner epitelcellene en tett En betydelig økning i laktatdehydrogenasefrigjøring observeres i cellekulturmediet i basalrommet ved eksponering for en positiv kontroll for membranbrudd, noe som beviser at modellens respons til et cytotoksisk stoff. Ingen økning i laktatdehydrogenasefrigjøring målt ved aksisk stimulering med TNF alfa eller LPS.Statistisk signifikante økninger i utgivelsen av IL6 og IL8 observeres i både LPS- og TNF alfabehandlede prøver sammenlignet med kontroll av ubehandlede celler. Ingen forskjeller i cellemorfologi observeres mellom co-kultur modeller ved hjelp av MDDMs og MDDCs fra friske perifere blod monocytter sammenlignet med de som bruker tinte celler i LPS og TNF alfa eksponert co-kultur, et forstyrret epitellag ble observert. Det er mulig å bruke andre typer menneskelige celler som luftveier eller bronkiolar celler, andre endepunkter kan også analyseres.Hovedsakelig forskere har blitt inspirert av denne teknikken ved hjelp av en lignende å sette opp, men med ulike celletyper.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

Tissues of the Human Body

SCIENTISTS IN ACTION

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naive Adult Stem Cells Isolasjon fra primære humane fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induksjon og analyse av Epiteliale til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Optimal Lentivirus Produksjon og cellekultur betingelser nødvendig for å kunne omsette Primær Menneskelig Bronkial epitelceller

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nyreskade Mikroinjeksjon i Sebrafisk til Model Akutt nyreskade

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Et grafisk brukergrensesnitt for programvareassistert sporing av proteinkonsentrasjon i dynamiske cellulære protrusjoner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

In situ overvåking av midlertidig dannet Molecular Anstandsdame forsamlinger i bakterier, gjær, og menneskelige celler

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Isolering og anrikning av humane lungeepiteliale stamceller for organoidkultur

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...