Name: multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment
Uploaded: 2020-05-06T13:30:00
Duration: 9 min 27 s
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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Miguel Spuch-Calvar pelo esquema de cocultura na Figura 3 e à Dra. Este estudo foi apoiado pelo projeto PATROLS, Programa de Pesquisa e Inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção nº 760813, e pela Fundação Adolphe Merkle. B.D. agradece à Fundação Peter und Traudl Engelhorn pelo apoio financeiro.

Os autores não têm nada a revelar.

A produção emergente de novos materiais, incluindo produtos químicos e medicamentos, aumenta gradualmente a necessidade de modelos in vitro preditivos. Para cumprir os três princípios de substituição, redução e refinamento dos testes em animais32, os modelos de células in vitro tornaram-se ferramentas poderosas quanto ao aspecto de substituição e redução para mecanismos de elucidação da ação de uma droga ou material8,,9,,10,,11. Apresentado aqui é um protocolo detalhado de montagem do modelo multicelular usando células imunes que são recém-isoladas ou descongeladas de monócitos previamente congelados. Também é descrito o cultivo do modelo na ALI. Por fim, o protocolo ilustra um exemplo de exposição a estímulos proinflamatórios e compara a resposta dos dois modelos contendo monócitos frescos ou congelados.
Vários estudos têm sido realizados para confirmar e justificar o valor agregado da maior complexidade dos modelos cultivados e expostos em condições de ALI em comparação com a exposição submersa convencional7,22,31. A observação da maior resposta proinflamatória em coculturas em comparação com monoculturas de células epiteliais confirmam um estudo anterior. O estudo utilizou o modelo de cocultura apresentado (estimulado com LPS) e mostrou maior resposta aos níveis de expressão genética de TNF e IL1B em comparação com o modelo equivalente de monocultura A5497. Por outro lado, ambos os modelos apresentaram maiores variações dentro dos valores de liberação de mediadores proinflamatórios medidos em comparação com as monoculturas A549. Isso pode ser explicado pelo uso de células imunes de diferentes doadores (casacos buffy) dentro de repetições biológicas (ou seja, uma repetição, um doador), como mostrado anteriormente7. Se desejar, as variações entre as réplicas podem ser superadas por 1) utilizando PBMs descongelados do mesmo doador ou 2) agrupando PBMs de diferentes doadores antes do congelamento das células e, em seguida, posterior utilização do mesmo pool em cada repetição. Incluindo mais repetições biológicas também é recomendado.
A técnica de congelamento celular pode ser considerada como um passo crítico; no entanto, é um procedimento laboratorial comum para a preservação de células para análise fenotípica e funcional. Vários estudos demonstraram que a qualidade dos PBMs congelados é vital para sua sobrevivência, e uma técnica de congelamento adequada é fundamental para o sucesso de ensaios subsequentes com as mesmas células28,32. A modificação do protocolo pode ser realizada por meio do congelamento de PBMs, o que proporciona flexibilidade na configuração experimental, já que a disponibilidade de casacos buffy é geralmente limitada. Outra vantagem do uso de PBMs congelados (em vários frascos) sobre os recém-isolados é que eles podem ser usados em experimentos subsequentes mesmo após 1 ano. Isso diminui a potencial questão da variabilidade doador-a-doador se este for um parâmetro desejado ou necessário em um experimental.
Os resultados de uma comparação interlaboratória realizada após até 13 meses mostram que os PBMs, quando armazenados adequadamente em um tanque de nitrogênio líquido, podem ser usados por um longo período sem qualquer efeito sobre a viabilidade celular ou recuperação celular33. Tempos de armazenamento mais longos (mais de 1 ano) podem ser possíveis após a validação cuidadosa da viabilidade celular e da capacidade de resposta celular antes de realizar um experimento. Além disso, a temperatura no tanque de nitrogênio líquido deve permanecer estável o tempo todo. O principal fator que afetou a viabilidade dos PBMs criopreservados foi a concentração de DMSO, com concentração ideal de 10%-20 % (v/v)28. Para minimizar os efeitos potencialmente nocivos do congelamento, diferentes fontes de proteínas, FBS ou BSA (com uma ampla gama de concentração de 40% até 100 %34) são frequentemente adicionadas ao meio de congelamento como componentes protetores naturais que podem aumentar a sobrevivência celular.
Devido ao alto potencial citotóxico do DMSO, recomenda-se primeiro dispersar PBMs em FBS, depois adicionar DMSO a PBMs já dispersos em FBS. Notavelmente, embora maiores concentrações de FBS (>40%) não apresentaram melhora na viabilidade celular, ao mesmo tempo, não causaram danos às células28. No entanto, o congelamento de monócitos é uma possível abordagem para superar questões de disponibilidade limitada de casacos buffy. No entanto, se desejar o uso de MDDCs e MDMs de PBMs frescos, as células imunes podem ser diferenciadas e utilizadas 5-8 dias após o isolamento7,16,17,,35,,36,,37. Se o planejamento experimental permitir, pelo menos 6 dias de diferenciação em MDDCs e MDMs são recomendados. No entanto, a consistência entre diferentes repetições no mesmo experimento, juntamente com inspeções rotineiras de suas expressões específicas de marcadores de superfície, são cruciais. A capacidade de resposta a um estímulo proinflamatório, como o LPS, após o tempo de diferenciação também deve ser verificada regularmente.
Muitas investigações utilizando a linha celular A549 têm sido realizadas na ALI, seja como monocultura ou combinadas com outros tipos de células (macrófagos, células dendríticas ou fibroblastos) em cocultura 3D modelo22,,24,,29,38. Utilizando este modelo de cocultura 3D, a citotoxicidade, o estresse oxidativo ou efeitos proinflamatórios de (nano-)materiais têm sido investigados por até 72 h1,17,21,,24,29. A semelhança do modelo com o tecido in vivo já foi investigada com base em imagens de escaneamento a laser confocal do modelo16. Ao montar o modelo, é importante considerar tanto a proliferação celular (que pode afetar A549 no modelo aqui apresentado) quanto o desempenho das células imunes primárias (não proliferando) (aqui, MDDCs e MDMs). Também é importante considerar que nem todos os monócitos positivos cd14 se diferenciam em MDDCs e MDMs, e que as células podem estar presentes tanto em formas anexadas quanto suspensas. Com base na natureza do conjunto de cocultura (aqui, ambos os tipos de células precisam se conectar à camada epitelial existente), recomenda-se usar apenas as subsusu populações aderentes de ambos os tipos de células imunes. Além disso, análises rotineiras de monócitos, monografia MDDC e MDM de resposta à moncultura para LPS, e expressão de marcadores de superfície específicos (CD14, CD163, CD86, CD93 ou CD206, dados não mostrados) sugeriram que 6 e 7 dias de diferenciação são os pontos de tempo ideais.
Embora um número realista de células epiteliais alveolares nos pulmões humanos corresponda a ~160.000 células/cm2, o número de células A549 contadas no modelo é de ~1.000.000 células/cm2 após 9 dias cultivados na inserção16,18. Assim, as limitações deste modelo in vitro precisam ser consideradas. Primeiro, a densidade das células epiteliais foi estabelecida com base em sua capacidade de formar uma camada confluente na membrana em crescimento. Também é importante mencionar que o A549 representa uma célula epitelial tipo II com uma forma cuboidal, ao contrário das células epiteliais tipo I, que são planas e outspread. Por outro lado, o número necessário de células imunes foi estabelecido com base na literatura e apresentado neste protocolo como número celular/área de superfície39,,40,,41. A densidade celular de MDDCs na faixa de 400 células/mm2 (4 células/cm2)16 é comparável à densidade celular de estado estável de 500-750 células/mm2 (5- 7 células/cm2) relatada a partir de estudos in vivo39. A densidade de MDMs neste modelo está dentro da mesma faixa de situação in vivo na região alveolar humana40.
A coloração madura do marcador macrófago (25F9) foi observada tanto no lado apical (onde os MDMs estão presentes) quanto no lado basal (ou seja, no local das células dendríticas). A translocação de células imunes através da membrana insere os poros é possível e também tem sido observada utilizando este modelo16, o que pode explicar as diferenças observadas nas intensidades de coloração. No entanto, outra explicação possível é que o marcador de macrófago maduro também pode ser expresso em células dendríticas, mas a expressão é altamente específica do doador42. Além disso, a intensidade da expressão 25F9 é muito maior em MDMs(Figura 7, Figura 8). Ambos os estímulos proinflamatórios (LPS e TNF-α) afetaram a integridade da barreira epitelial pulmonar em ambas as coculturas(Figura 7, Figura 8). Isso era esperado com base em publicações anteriores43,44 mostrando que citocinas proinflamatórias e produtos bacterianos perturbam a integridade das barreiras epiteliais.
O modelo multicelular 3D do epitélio alveolar humano, estabelecido e caracterizado anteriormente17, serviu como uma ferramenta poderosa e útil para avaliar respostas biológicas (ou seja, reações proinflamatórias agudas, resposta ao estresse oxidativo, distribuição de partículas e comunicação celular) in vitro21,24,,25,45. Os resultados confirmam a responsabilidade dos modelos de cocultura com estímulos proinflamatórios (aqui, LPS e TNF-α). A resposta foi ligeiramente aumentada ao usar células imunes de PBMs frescos; no entanto, não houve diferença estatisticamente significativa entre as coculturas utilizando PBMs frescos versus descongelados. Além disso, as reações proinflamatórias de ambos os modelos de cocultura foram maiores do que as das monoculturas de células epiteliais cultivadas sob as mesmas condições (ALI). Em resumo, o protocolo descreve a montagem de um modelo de cocultura de tecido epitelial 3D humano alveolar usando PBMs frescos ou descongelados para diferenciação em MDMs e MDDCs. Mostra-se que ambos os modelos são altamente responsivos a estímulos proinflamatórios; portanto, eles podem servir como ferramentas poderosas para avaliações potenciais de risco e toxicidade.

Culturas in vitro de células pulmonares oferecem plataformas econômicas, robustas e bem controladas para avaliar os perigos dos aerossóis1. Como um sistema celular modelo para pneumócitos alveolares humanos, a linha celular epitelial A549 isolada de um adenocarcinoma pulmonar é frequentemente usada2. Essas células representam células epiteliais escamosas tipo II da região alveolar3 e são uma linha de células pulmonares amplamente utilizada para avaliação de risco e toxicidade1,4,,5,,6,,7,,8,,9,,10. A linha celular A549 possui características relevantes das células epiteliais alveolares tipo II, como a presença de corpos lamelares característicos contendo fosfolipídios densamente embalados3.
Foi demonstrado que quando as células são cultivadas em uma interface ar-líquido (ALI), o surfactante é liberado no lado apical das células epiteliais expostas ao ar, reduzindo a tensão superficial11,,12,13. Essa característica é particularmente importante em investigações de risco respiratório e toxicidade de nanomateriais. Uma vez inalados nanomateriais/tóxicos são depositados na região alveolar, eles primeiro interagem com o surfactante pulmonar e são deslocados por forças de molhar na hipofase aquosa, onde a interação com células pulmonares ocorre14,,15. Embora as células A549 formem uma monocamada (que pode crescer demais em multicamadas em pontos de tempo posteriores quando cultivadas em ALI) e produzem surfactantes, uma desvantagem é sua formação de junção apertada insuficiente, resultando em baixos valores de resistência elétrica transepitelial, mas ainda apresentando uma barreira funcional contra a translocação intercelular (nano)partículas16,,17,,18.
Nos pulmões, há uma variedade de populações de células imunes, incluindo células fagocíticas e profissionais que apresentam antígenos (ou seja, macrófagos e células dendríticas) que se comunicam diretamente através do contato celular ou sinalização intercelular para controlar e manter a homeostase. Macrófagos e células dendríticas são efeitos imunológicos inatas críticos e iniciadores da resposta imune adaptativa19. Células dendríticas que residem dentro ou abaixo do epitélio podem formar saliências através do epitélio para o lúmen para capturar antígenos. Os macrófagos alveolares estão localizados na superfície apical do epitélio e atuam como células sentinelas, representando a primeira defesa celular contra material estranho, bem como infecções bacterianas, virais e fúngicas. Sua plasticidade fenotípica permite a rápida indução de reações proinflamatórias em resposta a tais estímulos, bem como mudar para desencadear reações anti-inflamatórias (ou seja, inibitórias)20.
Para simular a barreira do tecido epitelial alveolar humano, estabelecemos um modelo triplo de cocultura com células A549 suplementadas com macrófagos derivados do sangue humano (MDMs) e células dendríticas (MDDCs) nos lados apical e basal,respectivamente 17. O cultivo deste modelo na ALI foi previamente relatado16, mesmo até 72 h pós-exposição21. As respostas imunes agudas às exposições de nanotubos de carbono foram significativamente aumentadas na cultura celular exposta ao ALI em comparação com as condições submersas22. O modelo de cocultura, cultivado e exposto a diferentes materiais da ALI, tem sido previamente utilizado para investigar citotoxicidade, estresse oxidativo e respostas inflamatórias após exposições a óxido de zinco,23 materiais relacionados ao grafeno24, nanopartículas de ouro25,,26, nanotubos de carbono21, e cinzas vulcânicas e partículas de escape diesel27.
Além disso, o importante papel dos macrófagos e células dendríticas como células de efeito imunológico em um modelo pulmonar humano in vitro foi confirmado. Em particular, observou-se uma resposta proinflamatória aumentada no modelo apenas na presença de células imunes em comparação com os sistemas de monocultura7. As desvantagens potenciais do uso de células imunes derivadas do monocito primário são a acessibilidade limitada dos PBMs, bem como a variação de doadores para doadores. Como solução para essas potenciais desvantagens, apresentado aqui é um protocolo que introduz a criopreservação de PBMs recém-isolados28 para a montagem do modelo de cultura celular. O objetivo deste estudo é demonstrar a montagem do modelo de tecido epitelial 3D humano, incluindo o isolamento de PBMs de casacos de buffy humanos. A capacidade de resposta aos estímulos proinflamatórios é comparada ao modelo composto por MDMs e MDDCs diferenciados de PBMs frescos ou diferenciados de PBMs congelados/descongelados.
Trabalhar com amostras de sangue humano não testadas envolve cuidados específicos para prevenir a transmissão potencial de doenças infecciosas, como o HIV (vírus da imunodeficiência humana), hepatite B e hepatite C. Portanto, o uso de medidas de proteção pessoal, como luvas, vestidos, máscaras e proteção ocular são cruciais e devem estar de acordo com os princípios da boa prática laboratorial. Essas proteções reduzem o risco de expor a pele ou membranas mucosas a fluidos potencialmente infecciosos. Além disso, para os envolvidos no manuseio de casacos e PBMs, a vacinação contra o vírus da hepatite B é obrigatória, e os níveis de titulação sanguínea de anticorpos anti-hepatite B devem estar acima de 100 UI/L (requisitos legislativos específicos do país precisam ser abordados). Além disso, todo o trabalho deve ser realizado em laboratórios de biossegurança nível 2 (requisitos legislativos específicos do país precisam ser abordados). As precauções padrão de saúde e segurança associadas ao trabalho em um ambiente laboratorial e ao manuseio da cultura celular de mamíferos, incluindo o manuseio de resíduos, devem ser adotadas na condução de todo o protocolo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchmark microplate reader</td>
			<td>does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Incubator</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container (for example Mr. Frosty)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>does not have to be specific, for example</td>
			<td>Zeiss LSM 710 meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatocytometer, or automatic cell counter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar bio-safety hood class II</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStand Macs (Macs Cell Separator)</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast inverted light microscope</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette boy, pipettors (different volumes)</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable small equipment/glassware</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353046 and 353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 &#956;m pore size</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapper</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass autoclaved Petri Dishes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>10040-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>A7030-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MicroBeads human - magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-097-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS, Norway</td>
			<td>1114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td>D5879_1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>E6758-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-093-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-095-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>4524-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 &#956;g/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 &#956;g/mL</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 &#956;g/mL</td>
			<td>Agrisera, Sweden</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 &#956;g/mL</td>
			<td>eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland</td>
			<td>14-0115-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 &#181;M</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab244204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment

Um modelo de cocultura celular alveolar humana é descrito aqui para simulação da barreira do tecido epitelial alveolar composta por células epiteliais alveolares tipo II e dois tipos de células imunes (ou seja, macrófagos derivados de monócitos humanos [MDMs] e células dendríticas [MDDCs]). Um protocolo para a montagem do modelo multicelular é fornecido. As células epiteliais alveolares (linha celular A549) são cultivadas e diferenciadas sob condições submersas em pastilhas permeáveis em poços de duas câmaras, em seguida, combinadas com MDMs e MDDCs diferenciados. Finalmente, as células são expostas a uma interface ar-líquido por vários dias. Como as células imunes primárias humanas precisam ser isoladas das camadas de buffy humanas, as células imunes diferenciadas dos monócitos frescos ou descongelados são comparadas para adaptar o método com base em necessidades experimentais. Os modelos tridimensionais, compostos por células alveolares com células imunes recém-isoladas ou descongeladas derivadas de monócitos, mostram um aumento estatisticamente significativo na citocina (interleucinas 6 e 8) liberadas após a exposição a estímulos proinflamatórios (lipopolysaccarídeo e fator de necrose tumoral α) em comparação com células não tratadas. Por outro lado, não há diferença estatisticamente significante entre a liberação de citocinas observada nas coculturas. Isso mostra que o modelo apresentado responde a estímulos proinflamatórios na presença de MDMs e MDDCs diferenciados de monócitos sanguíneos periféricos frescos ou descongelados (PBMs). Assim, é uma poderosa ferramenta para investigações de resposta biológica aguda a diferentes substâncias, incluindo drogas aerossolizadas ou nanomateriais.

Modelos de cocultura pulmonar humana, compostos por células epiteliais alveolares e células imunes, foram montados a partir de MDDCs frescos ou congelados e progenitores de MDMs (aqui, monócitos periféricos derivados do sangue humano). Conforme apresentado na Figura 1,as células A549 foram semeadas 3 dias após a primeira seção envolvendo isolamento/descongelamento de monócitos. Após 6 dias de diferenciação, os MDMs diferenciados apareceram em forma redonda, enquanto os MDDCs formaram uma forma mais alongada com saliências observáveis. Eles também apareceram como aglomerados, especialmente quando diferenciados dos monócitos frescos(Figura 2, Figura 3). As células epiteliais formaram uma densa camada celular de células após 3 dias de crescimento nas pastilhas de membrana(Figura 4),quando as coculturas foram montadas. Após 24h de montagem e 24h adicionais de serem submetidas às condições de ALI, as coculturas foram preparadas para exposições.
A responsividade dos modelos de cultura celular 3D foi investigada após a exposição a estímulos proinflamatórios conhecidos usando uma abordagem pseudo-ALI, como descrito anteriormente29. Os estímulos proinflamatórios, LPS e TNF-α, foram adicionados em volumes baixos (100 μL) à superfície apical do modelo celular exposto ao ar. Paralelamente, a ausência de ruptura da membrana como medida de citotoxicidade foi avaliada via ensaio LDH. Observou-se aumento significativo da liberação de LDH em CCM do compartimento basal após exposição ao controle positivo para ruptura da membrana, um detergente Triton-X 100 (Figura 5). Esses resultados mostraram responsividade do modelo a uma substância citotóxica, enquanto nenhum aumento na liberação de LDH foi observado após estimulação apical com TNF-α ou LPS.
Uma possível razão para os diferentes valores medidos de LDH nas amostras montadas com PBMs frescos ou previamente congelados pode ser atribuída ao armazenamento da amostra. Amostras de PBMs frescos foram armazenadas por mais tempo a -80 °C; portanto, a atividade da enzima LDH pode cair. Notavelmente, o LDH é estável por apenas até 4 dias no CCM; assim, recomenda-se realizar o ensaio nos últimos 2 dias após a coleta dos supernantes. Alternativamente, é possível congelar os supernaentes logo após a coleta. No entanto, é importante considerar que o congelamento pode diminuir a atividade enzimática do LDH.
A secreção de mediadores proinflamatórios (aqui, TNF-α e interleucinas 6 [IL-6] e 8 [IL-8]) no CCM basal foi quantificada via ELISA. Estatisticamente significativos (p < 0,05, ANOVA unidirecional) foram observados aumentos na liberação de IL-6 e IL-8 em amostras tratadas LPS e TNF-α em comparação com as respectivas células não tratadas, bem como nos modelos de cultura celular montados a partir de qualquer fonte de PBMs(Figura 6). Embora as concentrações (pg/mL) de todas as citocinas testadas no CCM basal tenham sido maiores nas coculturas compostas por PBMs frescos, as diferenças entre as duas coculturas e monoculturas não foram estatisticamente significativas (p > 0,05) (Figura 6). Para confirmar o valor agregado dos modelos de cocultura em relação a uma cultura celular epitelial 2D, as monoculturas A549 também foram expostas a LPS ou TNF-α. Como esperado, a liberação de todos os mediadores investigados das monoculturas A549 foi menor em relação aos dois modelos de cocultura; embora, a diferença entre eles não tenha sido estatisticamente significante (p > 0,05, ANOVA unidirecional).
A morfologia celular da barreira do tecido epitelial alveolar humano 3D foi avaliada por meio de microscopia de varredura a laser confocal (LSM). Para visualizar a composição de cada modelo, os macrófagos dentro dos modelos de cocultura (MDMs) foram manchados com marcador macrófago maduro 25F9. Os MDDCs foram manchados com CD83, que é um importante marcador para células dendríticas ativadas30. Quanto à morfologia celular, não foi observada diferença entre os modelos de cocultura utilizando MDMs e MDDCs de PBMs frescos em comparação com aqueles que utilizam PBMs descongelados. Em coculturas expostas ao LPS e TNF-α, ambas compostas por células imunes frescas e congeladas, observou-se uma camada epitelial interrompida em imagens LSM, o que não ocorreu em células não tratadas(Figura 7, Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig01.jpg"> Figura 1: Cronograma esquemático do protocolo. Apresentação do modelo de cocultura 3D preparação, montagem e aplicação (exposição a uma substância testada). ALI = interface ar-líquido, MDDCs = células dendríticas derivadas de monocitos, MDMs = macrófagos derivados de monócitos, PBMs = monócitos sanguíneos periféricos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig02.jpg"> Figura 2: MDMs e MDDCs diferenciados de PBMs frescos. Imagem de microscopia de contraste de fase de MDMs diferenciados(A)e(B) MDDCs de PBMs frescos (6 dias após isolamento celular). Os MDMs são em forma redonda, enquanto os MDDCs são frequentemente observados como aglomeradores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig03.jpg"> Figura 3: MDMs e MDDCs diferenciados de PBMs congelados. Imagem de microscopia de contraste de fase de MDMs diferenciados(A)e(B) MDDCs de PBMs descongelados (6 dias após o descongelamento). Os MDMs têm formato redondo, mas algumas células alongadas podem ser observadas. Os MDDCs também aparecem em forma redonda com saliências. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig04.jpg"> Figura 4: Crescimento das células epiteliais nas pastilhas de membrana. Imagem de microscopia de contraste de fase do confluente A549 crescendo em uma membrana inserida 4 dias após a semeadura, formando uma camada densa de células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig05.jpg"> Figura 5: Resultados de citotoxicidade investigados através do ensaio baseado em ruptura de membrana (LDH). Os dados são apresentados como um aumento de dobra sobre células não tratadas (média ± SD, n = 3, asterisco denota aumento estatisticamente significativo em comparação com células não tratadas, **p < 0,01, ****p < 0,0001). Nos modelos verdes, MDMs e MDDCs de PBMs frescos são representados, e em modelos roxos montados a partir de PBMs descongelados são representados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig06.jpg"> Figura 6: Reações proinflamatórias nas coculturas e monoculturas. Os mediadores proinflamatórios (TNF-α, IL-6 e IL-8) liberam nas coculturas após o desafio de 24 h com LPS ou TNF-α. Os dados são apresentados em relação às células não tratadas (média ± SD, n = 3, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). Nos modelos verdes, MDMs e MDDCs de PBMs frescos são representados, e em modelos roxos montados a partir de PBMs descongelados são representados. Grey representa monoculturas A549. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig07.jpg"> Figura 7: Morfologia de coculturas compostas de células imunes frescas. Imagens LSM de lados apical e basais do modelo de cocultura com projeções xz de lados apical do modelo usando MDMs e MDDCs de PBMs frescos. Cyan representa núcleos (DAPI), magenta representa citoesqueleto (rhodamine-phalloidin), branco representa MDMs (25F9), e verde representa MDDCs (CD 83). A seta branca denota MDM, enquanto o arqueiro verde denota MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig08.jpg"> Figura 8: Morfologia de coculturas compostas de células imunes congeladas. Imagens LSM do lado apical do modelo de cocultura com projeções xz correspondentes, e lado basal do modelo usando MDMs e MDDCs de PBMs descongelados. Cyan representa núcleos (DAPI), magenta representa citoesqueleto (rhodamine-phalloidin), branco representa MDMs (25F9), e verde representa MDDCs (CDDCs). A seta branca denota MDM, enquanto o arqueiro verde denota MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Apresentado aqui é um protocolo para isolamento do monócito sanguíneo humano primário, bem como sua diferenciação em macrófagos e células dendríticas e montagem com células epiteliais em um modelo pulmonar humano multicelular. Respostas biológicas de coculturas compostas de células imunes diferenciadas de monócitos recém-isolados ou descongelados, após exposição a estímulos proinflamatórios, são comparadas.

Modelo Alveolar Humano Multicelular Composto por Células Epiteliais e Células Imunes Primárias para Avaliação de Riscos

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Este modelo de áudio humano individual usa células imunes relevantes como uma ferramenta poderosa para prever a resposta imune aguda de substâncias, incluindo nanomateriais e drogas de conhecimento. Estes médicos combinam células epiteliais humanas e células imunes primárias humanas para avaliar essas reações específicas. O uso de monócitos frescos e congelados proporciona flexibilidade para o plano de experimentos.Inúmeros estudos têm demonstrado que esse modelo pode fornecer uma visão da comunicação interestelar entre um sentido comportamental e o senso imunológico. Como esta demonstração inclui todos os detalhes importantes para cravar o modelo um traço pessoal na cultura celular, instruções visuais para replicar experimentos. Várias etapas no protocolo da bexiga são complexas e requerem manuseio especial.Portanto, eles são demonstrados com todos os detalhes necessários que eles podem ser facilmente seguidos. Para o isolamento de monócitos sanguíneos periféricos de casacos buffy humanos, divida o conteúdo do saco de casaco buffy da colheita, uniformemente entre tubos cônicos de 250 mililitros. Leve cuidadosamente o volume total em cada tubo 250 mililitros com PBS e misture os tubos com três inversões suaves.Em seguida, divida a solução DEMELhador de casacos Buffy igualmente entre quatro novos tubos de 50 mililitros, em seguida, adicione 10 microliters de CD 14 contas magnéticas positivas as sétimas células totais ao tubo e misture bem por pipetação. Após o enchimento, retire a pipeta da pipeta e conecte imediatamente a abertura superior da pipeta com um polegar, em seguida, coloque a pipeta preenchida na parte inferior de um tubo e desligue a abertura da pipeta para permitir que o gradiente de densidade flua lentamente sob a mistura de pbs de casaco buffy, até que um mililitro do meio de gradiente de densidade seja deixado dentro da pipeta. Quando o meio gradiente de densidade tiver sido adicionado a cada tubo da mesma forma, separe as células por centrifugação de gradiente de densidade e use uma pipeta sorológica para coletar a camada branca de dois a três milímetros de espessura do sangue mononuclear de espessura entre o plasma e as camadas médias gradientes de densidade.A melhor maneira de conectar a camada é remover o plasma primeiro e então você suprimir nossas pipetas lógicas para coletar as células. Puxe as células mononucleares de sangue periféricos de cada conjunto de dois tubos em um novo tubo de 50 mililitros e lave as células duas vezes com um volume total de 50 mililitros de PBS fresco por lavagem. Em seguida, descarte o supernaspe e resuspenque a pipeta em cada um em cinco mililitros de PBS fresco e acumule as suspensões celulares em um único tubo para contar.Após a contagem, centrifugar as células novamente e resuspensar a pelette para 80 mililitros de tampão de separação magnética por atender às sétimas células. Em seguida, adicione 10 microliters de CD 14 contas magnéticas positivas por atender as sétimas células totais ao tubo e misturar bem por pipetação. Após uma incubação de 15 minutos a quatro graus Celsius enxágue uma coluna magnética com três mililitros de tampão de separação magnética e adicione as células à coluna.Lave a coluna três vezes com três volumes mililitros de tampão por lavagem e transfira a coluna para um tubo de 15 mililitros contendo um mililitro de tampão de separação magnética fresco. Em seguida, use o êmbolo e cinco mililitros de tampão para colocar o CD 14 células positivas no tubo. Induzir diferenciação das contas magnéticas isoladas CD 14 células positivas.Primeiro, resuspensar as células de uma só vez atender às seis células por mililitro concentração no meio da cultura celular. Ou diferenciação de MDDC, adicione 10 nanogramas por mililitro de e de colônia de macrófagos do local de granula ao tubo e adicione três mililitros de células a cada poço de uma placa de cultura celular de seis poços, ou a diferenciação de MDM adicione 10 nanogramas por mililitro de fator estimulante da colônia macrófago às células e emplaque as células como apenas demonstrado. Para configurar um tecido epitelial alveolar de tecido triplo celular modelo de co-cultura, primeiro transfira 1,5 mililitros de cultura celular pré-quente para o número apropriado de Poços de uma placa de 12 poços e coloque uma cultura celular inserida em cada poço.Em seguida, adicione 500 microliters de suspensão celular epitelial a uma densidade de cinco vezes 10 às quintas células por mililitro no lado apical de cada inserção e cubra a placa para uma incubação de quatro dias na incubadora de cultura celular. Ou a semeadura MDDC substitui o supernascido dos Poços de seis placas de poços usados para diferenciação de MDDC, com um mililitro de meio de cultura celular quente fresco e usar um raspador de células para separar as células de adesão de cada poço. Lave cada poço três vezes com o supernato e em cada poço e combine todas as soluções celulares em um único tubo de centrífuga.O MDDC colhido por centrifugação e pinças estéreis para colocar as pastilhas das 12 placas de poço de cabeça para baixo em uma placa de Petri estéril. Raspe quaisquer células epiteliais do lado basal da inserção e resuspenque os MDDCs em meio de cultura celular fresca faça uma concentração de 4,2 vezes 10 dessas células por mililitro. Em seguida, adicione 150 microliters de células em cada inserção para que toda a superfície basal da inserção seja igualmente coberta com o líquido sem bolhas.Para a semeadura de MDDM após a colheita dos MDDMs diferenciados, como demonstrado para os MDDCs, diluir as células para um 2,5 vezes 10 para as quatro células por mililitro de concentração média de cultura celular fresca e adicionar 500 microliters de células abaixo da parede de cada célula epitelial e MDDC contendo inserção de cultura celular, em seguida, colocar a tampa sobre a placa e colocar a placa em uma incubadora de cultura celular por 24 horas. No dia seguinte, aspire o supernaente das áreas apical e basal de cada inserção de cultura celular e Wells. Em seguida, você esteriliza pinças para levantar as pastilhas dos Poços e adicionar 600 microliters de pré-aquecimento fresco ao meio de cultura celular para cada poço.Após seis dias de diferenciação, os MDMs aparecem em forma redonda, enquanto os MDDCs formam aglomerados compostos por células com uma forma mais alongada e saliências observáveis. Após três dias de crescimento nas pastilhas de membrana, as células epiteliais formam um denso Um aumento significativo na liberação de lactato desidrogenase é observado no meio de cultura celular do compartimento basal após a exposição a um controle positivo para ruptura da membrana, provando a capacidade de resposta do modelo a uma substância citotóxica. Nenhum aumento na liberação de lactato dehidrogênioase medida sobre estimulação apical com TNF alfa ou LPS.Aumentos estatisticamente significativos na liberação de IL6 e IL8 são observados em amostras tratadas alfa LPS e TNF em comparação com o controle de células não tratadas. Não são observadas diferenças na morfologia celular entre os modelos de co-cultura usando MDDMs e MDDCs de monócitos de sangue periféricos frescos em comparação com aqueles que usam células descongeladas em LPS e TNF alfa exposto co-cultura, observou-se uma camada epitelial interrompida. É possível usar outros tipos de células humanas, como as vias aéreas ou células bronquiolares, outros pontos finais também podem ser analisados.Principalmente os pesquisadores foram inspirados por essa técnica usando uma configuração semelhante, mas com diferentes tipos de células.

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Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primárias células epiteliais brônquicas humanas Grown a partir de explantes

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Biologia

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo de Cultura Primária células epiteliais trompa de Falópio

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Isolamento de células imunes de tumores primários

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Adult Stem Cells isolamento de culturas primárias de fibroblastos humanos

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Optimal Lentivírus produção e cultura celular condições para sucesso pilhas transdução primária brônquicas humanas epiteliais

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

Monitoração in situ de montagens moleculars formadas Transientemente do chaperone nas bactérias, no fermento, e nas pilhas humanas

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Isolamento e enriquecimento de células progenitoras epiteliais pulmonares humanas para a cultura organoide

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...