Name: multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment
Uploaded: 2020-05-06T13:30:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Мигеля Спуха-Гольвара за схему совместного ства на рисунке 3 и д-ра Бедию Бегум Каракочек за критическое чтение. Это исследование было поддержано проектом PATROLS, Программой исследований и инноваций Европейского союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения No 760813 и Фондом Адольфа Меркле. B.D. благодарит фонд Питера и Траудла Энгельхорна за финансовую поддержку.

Авторов нечего раскрывать.

Новое производство новых материалов, включая химические вещества и наркотики, постепенно увеличивает потребность в прогностический in vitro моделей. В соответствии с тремя принципами замены, сокращения иуточнения тестирования на животных 32, в пробирке модели клеток стали мощными инструментами в отношении замены и сокращения аспект для выяснения механизмов действия препарата или материала8,9,10,11. Здесь представлен подробный протокол сборки многоклеточной модели с использованием иммунных клеток, которые либо недавно изолированы, либо оттаяли от ранее замороженных моноцитов. Также описано культивирование модели в ALI. Наконец, протокол иллюстрирует пример воздействия провоспалительных стимулов и сравнивает реакцию двух моделей, содержащих либо свежие, либо замороженные моноциты.
Различные исследования были проведены, чтобы подтвердить и оправдать добавленную стоимость повышенной сложности моделей, выращенных и подвергшихся воздействию в условиях АЛИ по сравнению с обычными погруженныхвоздействия 7,22,31. Наблюдение за более высокой провоспламеняемой реакцией в кокультурах по сравнению с монокультурами эпителиальных клеток подтверждает предыдущее исследование. В исследовании использовалась представленная модель кокультуры (стимулируемая LPS) и показана более высокая реакция на уровни экспрессии генов TNF и IL1B по сравнению с монокультурной эквивалентной моделью A5497. С другой стороны, обе модели показали более высокие различия в измеренных значениях выброса провоспламеняемого посредника по сравнению с монокультурами A549. Это можно объяснить использованием иммунных клеток от различных доноров (баффи пальто) в биологических повторений (т.е. одно повторение, один донор), как ранеепоказано 7. При желании различия между репликациями могут быть преодолены на 1) с помощью разморожевания ПБМ от одного и того же донора или 2) объединения ПБМ от различных доноров до замораживания клеток, а затем последующего использования одного и того же пула в каждом повторении. В том числе более биологических повторений также рекомендуется.
Техника замораживания клеток может рассматриваться как критический шаг; однако, это обычная лабораторная процедура для сохранения клеток для фенотипического и функционального анализа. Различные исследования показали, что качество замороженных ПБМ имеет жизненно важное значение для их выживания, и соответствующий метод замораживания является ключом к успеху последующих анализов с темиже клетками 28,32. Модификация протокола может быть выполнена путем замораживания ПБМ, что обеспечивает гибкость в экспериментальной установке, так как доступность баффи пальто, как правило, ограничена. Еще одним преимуществом использования замороженных ПБМ (в нескольких флаконах) по сравнению со свежеисплиенными является то, что они могут быть использованы в последующих экспериментах даже после 1 года. Это уменьшает потенциальную проблему изменчивости от донора к донору, если это желаемый или необходимый параметр в экспериментальном эксперименте.
Результаты межлабораторного сравнения, выполненного после 13 месяцев, показывают, что ПБМ, при правильном хране в резервуаре с жидким азотом, могут использоваться в течение длительного периода без какого-либо влияния на жизнеспособность клеток или восстановлениеклеток 33. Более длительное время хранения (более 1 года) может быть возможным при тщательной проверке жизнеспособности клеток и реакции клеток перед выполнением эксперимента. Кроме того, температура в резервуаре с жидким азотом должна оставаться стабильной в все времена. Основным фактором, влияющим на жизнеспособность криоконсервированных ПБМ, была обнаружена концентрация ДМСО с оптимальной концентрацией 10%-20% (v/v)28. Чтобы свести к минимуму потенциально вредные последствия замораживания, различные источники белков, FBS или BSA (с широким диапазоном концентрации от 40% до 100 %34) часто добавляются в замораживание среды в качестве естественных защитных компонентов, которые могут увеличить выживаемость клеток.
В связи с высоким цитотоксическим потенциалом ДМСО рекомендуется сначала разогнать ПБМ в FBS, а затем добавить DMSO в PBMs, уже рассеянные в FBS. Примечательно, что, несмотря на более высокие концентрации FBS (nogt;40%) не показывают никакого улучшения жизнеспособности клеток, в то же время, они не причиняют вреда клеткам28. Тем не менее, замораживание моноцитов является возможным подходом к преодолению проблем ограниченной доступности баффи пальто. Однако, если использование MDDCs и MDMs от свежих PBMs желательно, иммунные клетки могут быть дифференцированы и использованы 5-8дней после изоляции 7,,16,,17,,35,,36,37. Если экспериментальное планирование позволяет, рекомендуется по крайней мере 6 дней дифференциации как в MDDCs, так и в MDM. Тем не менее, согласованность между различными повторениями в одном и том же эксперименте, наряду с рутинными проверками их конкретных выражений маркера поверхности, имеют решающее значение. Реагирование на провоспламеняющие стимулы, такие как LPS, после дифференциации время также должны быть регулярно проверены.
Многие исследования с использованием линии клеток A549 были проведены в ALI, либо в качестве монокультуры или в сочетании с другими типами клеток (макрофаги, дендритные клетки, или фибробласты) в 3D-моделькокультуры 22,24,29,38. Используя эту 3D модель кокультуры, цитотоксичность, окислительный стресс, или провоспламеняющий эффект (нано-) материалы были исследованы до 72 ч1,17,21,24,29. Сходство модели с тканью in vivo ранее исследовалось на основе конфокального лазерного сканирования изображения модели16. При сборке модели важно учитывать как пролиферацию клеток (которая может повлиять на A549 в представленной здесь модели), так и производительность первичных (не размножающихся) иммунных клеток (здесь MDDCs и MDMs). Важно также учитывать, что не все положительные моноциты CD14 дифференцируются на MDDCs и MDM, и что клетки могут присутствовать как в прикрепленных, так и в подвешенных формах. Основываясь на природе сборки кокультуры (здесь оба типа клеток должны прикрепляться к существующему эпителиальный слой), рекомендуется использовать только приверженцев под популяций обоих типов иммунных клеток. Кроме того, рутинный анализ моноцитов, монокультуры MDDC и MDM, реагирующих на LPS, и выражение конкретных поверхностных маркеров (CD14, CD163, CD86, CD93 или CD206, данные не показаны) показали, что 6 и 7 дней дифференциации являются оптимальными точками времени.
Несмотря на то, что реальное количество альвеолярных эпителиальных клеток в легких человека соответствует 160 000клеток/см 2,количество клеток A549, подсчитанных вмодели,составляет 1 000 000 клеток/см2 после 9 дней, культурных навставке 16,18. Таким образом, необходимо учитывать ограничения этой модели in vitro. Во-первых, плотность эпителиальных клеток была установлена на основе их способности образовывать стечение слоя на растущей мембране. Важно также отметить, что A549 представляет собой эпителианные клетки типа II с кубоидной формой, в отличие от эпителиальных клеток типа I, которые являются плоскими и перепрочитанными. С другой стороны, необходимое количество иммунных клеток было установлено на основе литературы и представлено в этом протоколе как номерклетки/площадь поверхности 39,,40,,41. Плотность клеток MDDCs в диапазоне 400 клеток/мм2 (4 клетки/см2)16 сопоставима с плотностью клеток стабильного состояния 500-750 клеток/мм2 (5- 7 клеток/см2),о чем сообщается в исследованиях in vivo39. Плотность MDMs в этой модели находится в пределах того же диапазона in vivo ситуации в области альвеолярных человека40.
Зрелое окрашивание макрофагового маркера (25F9) наблюдалось как в апической стороне (где присутствуют МДМ), так и в базальной стороне (т.е. в месте дендритных клеток). Транслокация иммунных клеток через мембрану вставляет поры возможно, а также наблюдается спомощью этой модели 16, которые могут объяснить наблюдаемые различия в интенсивности окрашивания. Тем не менее, другое возможное объяснение заключается в том, что зрелый маркер макрофагов также может быть выражен на дендритных клетках, но выражение является весьма доноромконкретных 42. Кроме того, интенсивность выражения 25F9 гораздо выше в MDMs(рисунок 7, рисунок 8). Оба провоспалительных стимула (LPS и TNF-я) повлияли на целостность легочного эпителиального барьера в обеих кокультурах(рисунок 7, рисунок 8). Это было ожидаемо на основе предыдущихпубликаций 43,44, показывающих, что провоспалительные цитокины и бактериальные продукты нарушают целостность эпителиальных барьеров.,
3D многоклеточная модель альвеолярного эпителия человека, установленная ихарактерная ранее 17, служила мощным и полезным инструментом для оценки биологических реакций (т.е. острых провоспламеняющих реакций, окислительной реакции стресса, распределения частиц и сотовой связи) впробирке21,24,,25,,45. Результаты подтверждают ответственность моделей совместной культуры за провоспалительные стимулы (здесь, LPS и TNF-я). Реакция была несколько увеличена при использовании иммунных клеток от свежих ПБМ; однако статистически значимой разницы между кооперативами, использующими свежие и размороженные ПБМ, не было. Кроме того, провоспламеняемые реакции обеих моделей кокультуры были выше, чем реакции монокультур эпителиальных клеток, культивируемых в одинаковых (АЛИ) условиях. Таким образом, протокол описывает сборку 3D человека альвеолярной эпителиальной ткани совместной модели с использованием либо свежие или оттаяли ПБМ для дифференциации в MDMs и MDDCs. Показано, что обе модели в значительной степени реагируют на провоспалительные стимулы; поэтому они могут служить мощными инструментами для оценки потенциальной опасности и токсичности.

Культуры клеток легких in vitro предлагают экономически эффективные, надежные и хорошо контролируемые платформы для оценки опасностей аэрозолей1. В качестве модели клеточной системы для человека альвеолярных пневмоцитов, эпителиальной линии клеток A549 изолированы от легочной аденокарциномычасто используется 2. Эти клетки представляют собой плоскоклеточный тип II эпителиальных клетокиз альвеолярной области 3 и широко используются линии клеток легкихдля оценки опасности итоксичности 1, 4,,5,,6,,7,,8,,9,10., Клеточная линия A549 обладает соответствующими особенностями альвеолярных эпителиальных клеток типа II, такими как наличие характерных ламеллярных тел, содержащих плотно упакованные фосфолипиды3.
Было показано, что, когда клетки культуруются на воздухо-жидком интерфейсе (ALI), сурфактант высвобождается на апической стороне открытых воздухом эпителиальных клеток, уменьшая поверхностноенатяжение 11,,12,,13. Эта особенность особенно важна при исследованиях наноматериальной респираторной опасности и токсичности. После вдыхания наноматериалов / токсикантов откладываются в альвеолярной области, они сначала взаимодействуют с легочным сурфактантом и вытесняются смачивающими силами в аквеозную гипофаз, где взаимодействие с легочнымиклетками происходит 14,15. Несмотря на то, что A549 клетки образуют монослой (который может разрастаться в многослойных на более поздних точках времени при выращивании в ALI) и производить сурфактант, недостатком является их недостаточное плотное образование соединения, в результате чего низкие значения трансепителиальной электрической устойчивости, но все еще представляет функциональный барьер против межклеточных (нано) частицтранслокации 16,17,18.
В легких существует множество популяций иммунных клеток, включая фагоцитные и профессиональные антиген-представления клеток (т.е. макрофагов и дендритных клеток), которые непосредственно общаются через контакт клеток или межклеточный сигнал для контроля и поддержания гомеостаза. Макрофаги и дендритные клетки являются критическими врожденными иммунными эффекторами и инициаторами адаптивного иммунного ответа19. Дендритные клетки, проживающие внутри или под эпителием, могут образовывать выступы через эпителий к люмену, чтобы поймать антигены. Альвеолярные макрофаги расположены на апической поверхности эпителия и действуют как дозорные клетки, представляющие собой первую клеточную защиту от инордного материала, а также бактериальные, вирусные и грибковые инфекции. Их фенотипическая пластичность позволяет быстро индукции провоспалительных реакций в ответ на такие раздражители, а также переход в запуск противовоспалительных (т.е. ингибирующие)реакции 20.
Для имитации альвеолярного эпителиального барьера ткани человека, мы создали тройную модель совместной культуры с клетками A549, дополненными макрофагами, полученными из моноцитов человека (MDM) и дендритными клетками (MDDCs) на апиальной и базальной сторонах,соответственно 17. Культивирование этой модели на ALI ранеесообщалось 16, даже до 72 ч после экспозиции21. Острые иммунные реакции на воздействие углеродных нанотрубок были значительно усилены в клеточной культуре, подвергаемой воздействию АЛИ, по сравнению с подводнымиусловиями 22. Модель кокультуры, культурные и подвергаются воздействию различных материалов на ALI, ранее был использован для исследования цитотоксичности, окислительного стресса и воспалительных реакций при воздействииоксида цинка, 23 графена связанных материалов24, золотые наночастицы25,26, углеродные нанотрубки21, и вулканического пепла и дизельныхвыхлопных частиц 27.
Кроме того, была подтверждена важная роль макрофагов и дендритных клеток в качестве иммунных клеток-эффекторов в модели легких человека in vitro. В частности, повышенная провоспламеняемая реакция в модели наблюдалась только при наличии иммунных клеток по сравнению с монокультурнымисистемами 7. Потенциальными недостатками использования первичных моноцитов, полученных из иммунных клеток, являются ограниченная доступность ПБМ, а также вариации от донора к донору. В качестве решения этих потенциальных недостатков, представленный здесь протокол введения криоконсервации свежеиспеченногоPBMs 28 для сборки модели культуры клеток. Цель этого исследования состоит в том, чтобы продемонстрировать 3D человека альвеолярной эпителиальной ткани модели сборки, в том числе изоляции ПБМ от человека баффи пальто. Реагирование на провоспалительные стимулы сравнивается с моделью, состоящей из МДМ и МДДК, дифференцированной от свежих ПБМ или дифференцированной от замороженных/оттаяющих ПБМ.
Работа с непроверенными образцами крови человека включает в себя конкретную помощь для предотвращения потенциальной передачи инфекционных заболеваний, таких как ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), гепатит В и гепатит С. Таким образом, использование мер индивидуальной защиты, таких как перчатки, платья, маски и защита глаз имеют решающее значение и должны быть в соответствии с принципами хорошей лабораторной практики. Эти средства защиты снижают риск обиболивания кожи или слизистых оболочек с потенциально инфекционными жидкостями. Кроме того, для тех, кто участвует в обработке баффи пальто и ПБМ, вакцинация против вируса гепатита В является обязательным, и уровень титры крови антител против гепатита В должны быть выше 100 МЕ / Л (страна конкретных законодательных требований должны быть рассмотрены). Кроме того, вся работа должна проводиться в лабораториях уровня биобезопасности 2 (необходимо решать законодательные требования, предъявляемые к конкретным стране). При проведении всего протокола должны быть приняты стандартные меры предосторожности для здоровья и безопасности, связанные с работой в лабораторных условиях и обработкой культуры клеток млекопитающих, включая обработку отходов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchmark microplate reader</td>
			<td>does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Incubator</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container (for example Mr. Frosty)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>does not have to be specific, for example</td>
			<td>Zeiss LSM 710 meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatocytometer, or automatic cell counter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar bio-safety hood class II</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStand Macs (Macs Cell Separator)</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast inverted light microscope</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette boy, pipettors (different volumes)</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable small equipment/glassware</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353046 and 353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 &#956;m pore size</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapper</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass autoclaved Petri Dishes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>10040-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>A7030-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MicroBeads human - magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-097-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS, Norway</td>
			<td>1114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td>D5879_1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>E6758-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-093-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-095-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>4524-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 &#956;g/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 &#956;g/mL</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 &#956;g/mL</td>
			<td>Agrisera, Sweden</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 &#956;g/mL</td>
			<td>eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland</td>
			<td>14-0115-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 &#181;M</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab244204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment

Модель совместной культуры альвеолярных клеток человека описана здесь для моделирования альвеолярного эпителиального барьера тканей, состоящего из альвеолярных эпителиальных клеток типа II и двух типов иммунных клеток (т.е. макрофагов, полученных из моноцитов человека ,MDM) и дендритных клеток (MDDCs). Предусмотрен протокол для сборки многоклеточной модели. Альвеолярные эпителиальные клетки (линия клеток A549) выращиваются и дифференцированы в условиях погружения на проницаемые вставки в двухкамерных скважинах, а затем в сочетании с дифференцированными MDM и MDDCs. Наконец, клетки подвергаются воздействию воздушно-жидкого интерфейса в течение нескольких дней. Поскольку первичные иммунные клетки человека должны быть изолированы от человека баффи пальто, иммунные клетки отличаются от свежих или оттаяли моноцитов сравниваются для того, чтобы адаптировать метод, основанный на экспериментальных потребностей. Трехмерные модели, состоящие из альвеолярных клеток со только что изолированными или оттаянными моноцитными иммунными клетками, показывают статистически значимое увеличение цитокинов (интерлекинов 6 и 8) при воздействии провоспалительных стимулов (липополисахарида и фактора некроза опухоли) по сравнению с необработанными клетками. С другой стороны, нет статистически значимой разницы между высвобождением цитокинов, наблюдаемым в кокультурах. Это показывает, что представленная модель реагирует на провоспалительные стимулы в присутствии МДМ и MDDCs отличается от свежих или оттаяющих периферических моноцитов крови (PBMs). Таким образом, он является мощным инструментом для исследования острой биологической реакции на различные вещества, включая аэрозольные препараты или наноматериалы.

Модели кокультуры легких человека, состоящие из альвеолярных эпителиальных клеток и иммунных клеток, были собраны либо из свежих или замороженных MDDCs и MDMs прародителей (здесь, человека периферических кроветворных моноцитов). Как по представлено на рисунке 1, A549 клетки были посеяны через 3 дня после первого раздела с участием моноцитов изоляции / оттаивания. После 6 дней дифференциации, дифференцированные MDMs появились круглой формы, в то время как MDDCs сформировали более удлиненную форму с наблюдаемыми выступами. Они также появились в качестве агломератов, особенно когда отличаются от свежих моноцитов(рисунок 2, рисунок 3). Эпителиальные клетки образуют плотный клеточный слой клеток после 3 дней роста на мембранныхвставок (рисунок 4), когда кокультуры были собраны. После 24 ч сборки и еще 24 ч, которые подверглись условиям АЛИ, кокультуры были подготовлены для экспозиции.
Ответственность моделей культуры 3D клеток была исследована при воздействии известных провоспалительных стимулов с использованием псевдо-ALI подход, как описаноранее 29. Провоспламеняемые стимулы, LPS и TNF-q, были добавлены в низких объемах (100 л) на апкическую поверхность модели клеток, подвергшихся воздействию воздуха. Параллельно с анализом LDH оценивалось отсутствие разрыва мембраны в качестве меры цитотоксии. Значительное увеличение выброса LDH в СКК базального отсека наблюдалось при воздействии положительного контроля при разрыве мембраны моющего средства Triton-X 100(рисунок 5). Эти результаты доказали отзывчивость модели к цитотоксическому веществу, в то время как никакого увеличения выброса LDH не наблюдалось при апической стимуляции с помощью TNF-q или LPS.
Возможная причина различных измеренных значений ЛДГ в образцах, собранных со свежими или ранее замороженными ПБМ, может быть отнесена к хранению образцов. Образцы из свежих ПБМ хранились в течение более длительного времени при -80 градусов по Цельсию; поэтому активность фермента LDH может снизиться. Примечательно, что LDH стабилен только до 4 дней в СКК; таким образом, рекомендуется выполнить анализ последних 2 дней после сбора супернатантов. Кроме того, можно заморозить супернатанты сразу после сбора. Тем не менее, важно учитывать, что замораживание может уменьшить энзиматической активности LDH.
Через ELISA была количественно определена секреция провоспламеняющихся посредников (здесь ТНФ-я и интерлейкины 6 и 8 Ил-8) в базальный СКК. Статистически значимое (p lt; 0.05, в одну сторону ANOVA) увеличение выпуска IL-6 и IL-8 наблюдалось как в LPS- и TNF-- обработанных образцах по сравнению с соответствующими необработанными клетками, так и в моделях клеточной культуры, собранных из любого источника PBMs(рисунок 6). Хотя концентрации (пг/мл) всех проверенных цитокинов в базальных СКК были выше в кокультурах, состоящих из свежих ПБМ, различия между двумя кокультурами и монокультурами не были статистически значимыми (стр. 0,05) (Рисунок 6). Чтобы подтвердить добавленную стоимость моделей совместной культуры в отношении 2D эпителиальной клеточной культуры, монокультуры A549 также подверглись воздействию LPS или TNF-Q. Как и ожидалось, выпуск всех исследуемых посредников из монокультур A549 был ниже по сравнению с обеими моделями совместной культуры; хотя, разница между ними не была статистически значимой (стр. 0,05, в одну сторону ANOVA).
Клеточная морфология 3D альвеолярного эпителиального барьера ткани человека оценивалась с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (LSM). Чтобы визуализировать состав каждой модели, макрофаги в рамках моделей совместной культуры (MDM) были окрашены зрелым маркером макрофага 25F9. MDDCs были окрашены CD83, который является важным маркером для активированных дендритных клеток30. Что касается клеточной морфологии, то никакой разницы между моделями совместной культуры с использованием МДМ и MDDCs от свежих ПБМ по сравнению с теми, которые используют оттаявые ПБМ, не наблюдалось. В lpS- и TNF--открытых кокультурах, как состоящих из свежих и замороженных иммунных клеток, был замечен нарушенный эпителиальный слой в изображениях LSM, чего не было в необработанных клетках(рисунок 7, Рисунок 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig01.jpg"> Рисунок 1: Схематическая хронология протокола. Презентация подготовки, сборки и применения модели 3D-кокультуры (воздействие испытанного вещества). АЛИ - воздушно-жидкий интерфейс, MDDCs - моноциты, производные дендритные клетки, МДМ - моноциты, макрофаги, ПБМ - периферические моноциты крови. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig02.jpg"> Рисунок 2: ЦРТ и MDDCs отличаются от свежих ПБМ. Фазово-контрастное микроскопия изображения дифференцированных(A) MDMs и(B) MDDCs от свежих PBMs (6 дней после изоляции клеток). ЦРТ имеют круглую форму, в то время как MDDCs часто наблюдаются как агломераты. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig03.jpg"> Рисунок 3: MDMs и MDDCs дифференцируются от замороженных ПБМ. Фазово-контрастное микроскопия изображения дифференцированных(A) MDM и(B)MDDCs от оттаялих ПБМ (6 дней после оттаивания). MDMs круглой формы, но некоторые удлиненные клетки могут наблюдаться. MDDCs также появляются круглой формы с выступами. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig04.jpg"> Рисунок 4: Эпителиальные клетки роста на мембранных вставок. Фазово-контрастное микроскопия изображения стеченного A549, растущего на мембранной вставке через 4 дня после посева, образует плотный слой клеток. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig05.jpg"> Рисунок 5: Результаты цитотоксичности исследованы с помощью анализа разрыва мембраны (LDH). Данные представлены как увеличение створки по сравнению с необработанными клетками (средний й SD, n No 3, звездочка обозначает статистически значимое увеличение по сравнению с необработанными клетками, q p lt; 0.01, йоут; 0.0001). В зеленых моделях представлены MDM и MDDCs из свежих ПБМ, а в фиолетовых моделях представлены собранные из размороженных ПБМ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig06.jpg"> Рисунок 6: Провоспламеняемые реакции в кокультурах и монокультурах. Провоспламеняемые посредники (ТНФ-З, Ил-6 и Ил-8) выпускают в кокультурах на 24 ч вызов с LPS или TNF-З. Данные представлены по отношению к необработанным ячейкам (средний - SD, n No 3, хт; 0,01, йоут; 0,001, йоут; 0,0001). В зеленых моделях представлены MDM и MDDCs из свежих ПБМ, а в фиолетовых моделях представлены собранные из размороженных ПБМ. Серый цвет представляет монокультуры A549. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig07.jpg"> Рисунок 7: Морфология кокультур, состоящих из свежих иммунных клеток. LSM изображения апических и базальных сторон модели кокультуры с xz проекции апических сторон модели с использованием MDMs и MDDCs из свежих PBMs. Cyan представляет ядра (DAPI), пурпурный представляет цитоскелет (родамин-фаллоидин), белый представляет MDMs (25F9), а зеленый представляет MDDCs (CD 83). Белая стрелка обозначает МДМ, в то время как зеленая стрелка обозначает MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig07large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig08.jpg"> Рисунок 8: Морфология кокультур, состоящих из замороженных иммунных клеток. LSM изображения апической стороны модели кокультуры с соответствующими проекциями xz, и базальная сторона модели с использованием MDMs и MDDCs от оттаялого PBMs. Cyan представляет ядра (DAPI), пурпурный представляет цитоскелет (родамин-фаллоидин), белый представляет MDMs (25F9), а зеленый представляет MDDCs (CD 83). Белая стрелка обозначает МДМ, в то время как зеленая стрелка обозначает MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig08large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment at JoVE.com

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Здесь представлен протокол первичной изоляции моноцитов крови человека, а также их дифференциации на макрофаги и дендритные клетки и сборки с эпителиальными клетками в многоклеточную модель легких человека. Биологические реакции кокультур, состоящих из иммунных клеток, дифференцированных либо от свежеиспеченные или оттаянные моноциты, при воздействии провоспалительных стимулов, сравниваются.

Многоклеточная альвеолярная модель человека, состоящая из эпителиальных клеток и первичных иммунных клеток для оценки опасности

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Эти отдельные человеческие аудио модели использует соответствующие иммунные клетки в качестве мощного инструмента для прогнозирования острого иммунного ответа веществ, включая наноматериалы и знания наркотиков. Эти медицинские сочетает в себе человеческие эпителиальные клетки и человеческие первичные иммунные клетки для оценки этих конкретных реакций. Использование свежих и замороженных моноцитов обеспечивает гибкость для плана эксперимента.Многочисленные исследования показали, что эта модель может обеспечить понимание межзвездной связи между чувством поведения и иммунным чувством. Поскольку эта демонстрация включает в себя все важные детали для шпильки модели личной чертой в клеточной культуре, визуальные инструкции для репликации экспериментов. Несколько этапов в протоколе мочевого пузыря являются сложными и требуют специальной обработки.Поэтому они продемонстрированы со всеми необходимыми деталями, что они могут быть легко следуют. Для изоляции периферических моноцитов крови от человека Баффи пальто, разделить урожай Баффи пальто мешок содержимое, равномерно между 250 миллилитров конических труб. Аккуратно довнесите общий объем в каждой трубке 250 миллилитров с PBS и смешайте трубки с тремя нежными инверсиями.Затем разделить Buffy пальто PBS решение поровну между четырьмя новыми 50 миллилитров труб, а затем добавить 10 микролитров CD 14 положительных магнитных бусин седьмой общей клетки в трубку и хорошо перемешать с помощью пипетки. После заполнения, отсоединить пипетку от pipetter и сразу же подключили верхнее отверстие пипетки с большим пальцем, то размещены заполнены пипетки в нижней части одной трубки и отключить пипетку открытия, чтобы плотность градиента среды медленно течь под баффи пальто PBS смеси, пока один миллилитр плотности градиента среды остается внутри пипетки. При добавлении градиентной среды плотности к каждой трубке таким же образом отделяют клетки по плотности градиентной центрифугации и используют серологическую пипетку для сбора белого двух-трехмиллиметрового толщиного периферического слоя моноядерных клеток крови между плазмой и плотностью градиентных средних слоев.Лучший способ соединить слой, чтобы удалить плазму, а затем подавить наши логические пипетки для сбора клеток. Вытяните периферические моноядерные клетки крови из каждого набора из двух трубок в одну новую 50-миллилитровую трубку и промыть клетки два раза с общим объемом 50 миллилитров свежего PBS за стирку. Затем отбросьте супернатант и перерасходуйте пипетку в каждом из пяти миллилитров свежего PBS и объединить клеточные суспензии в одну трубку для подсчета.После подсчета, центрифуга клетки снова и повторно пелет до 80 миллилитров магнитного буфера разделения на участие в седьмой клетки. Затем добавьте 10 микролитров CD 14 положительных магнитных шариков на участие в седьмом общей клетки в трубку и хорошо перемешать с помощью пипетки. После 15-минутной инкубации при четырех градусах Цельсия смойте магнитную колонку тремя миллилитровами буфера магнитного разделения и добавьте клетки в столбец.Вымойте столбец три раза с тремя миллилитровых объемов буфера на стирку и передать столбец в 15 миллилитров трубки, содержащей один миллилитр свежего магнитного буфера разделения. Затем используйте поршень и пять миллилитров буфера, чтобы промыть CD 14 положительных клеток в трубку. Индуцировать дифференциацию магнитного шарика изолированных CD 14 положительных клеток.Во-первых, повторное течение клеток в один раз присутствовать на шесть клеток на миллилитр концентрации в среде культуры клеток. Или MDDC дифференциации, добавить 10 нанограммов на миллилитр и гранулы сайт макрофаг колонии стимулирующий фактор в трубку и добавить три миллилитров клеток в каждый колодец из шести хорошо пластины культуры клеток, или МДМ дифференциации добавить 10 нанограмм на миллилитр макрофагов колонии стимулирующий фактор клеток и пластины клеток, как только что продемонстрировали. Чтобы создать человека альвеолярной эпителиальной клеточной ткани тройной клеточной модели совместной культуры, первый передачи 1,5 миллилитров предварительно теплой среды клеточной культуры в соответствующее количество Уэллс из 12 хорошо пластины и место клеточной культуры вставить в каждый колодец.Далее добавьте 500 микролитров эпителиальной клеточной суспензии при плотности в пять раз 10 до пятых клеток на миллилитр в апийскую сторону каждой вставки и накройте пластину в течение четырех дней инкубации в инкубаторе культуры клеток. Или MDDC посева заменяет супернатант из уэллс из шести пластин хорошо используется для дифференциации MDDC, с одним миллилитр свежей теплой среде культуры клеток и использовать клеточный скребок, чтобы отделить клетки соблюдения от каждой скважины. Вымойте каждый хорошо три раза с супернатом и в каждом хорошо и объединить все клеточные растворы в одну центрифугу трубки.Собранные MDDC центрифугации и стерильные пинцеты, чтобы поместить вставки из 12 хорошо пластины вверх дном в стерильной чашке Петри. Очистите любые эпителиальные клетки с базальной стороны вставки и повторно почистьте MDDCs в среде свежей клеточной культуры, сделайте концентрацию в 4,2 раза 10 из этих клеток на миллилитр. Затем добавьте 150 микролитров клеток на каждую вставку, чтобы вся базальная поверхность вставки была одинаково покрыта жидкостью без пузырьков.Для посева MDDM после сбора дифференцированных MDDMs, как попродемонстрировано для MDDCs, разбавить клетки в 2,5 раза 10 до четырех клеток на миллилитр свежей клеточной культуры средней концентрации и добавить 500 микролитров клеток вниз стены каждой эпителиальной клетки и MDDC, содержащих вставки клеточной культуры, а затем поместить крышку на пластину и поместить пластину в инкубатор клеточной культуры в течение 24 часов. На следующий день аспирировать супернатант как из апических, так и из базальных областей каждой клеточной культуры вставки и Уэллса. Затем вы стерилизовать пинцет, чтобы поднять вставки из уэллса и добавить 600 микролитров свежей довоерной клеточной культуры среды для каждого колодца.После шести дней дифференциации, MDMs появляются круглые формы в то время как MDDCs образуют кластеры, состоит из клеток с более удлиненной формы и наблюдаемых выступов. После трех дней роста на мембранных вставок, эпителиальные клетки образуют плотный Значительное увеличение высвобождения лактата дегидрогеназы наблюдается в среде клеточной культуры базального отсека при воздействии положительного контроля на разрыв мембраны, доказывая отзывчивость модели к цитотоксической субстанции. Нет увеличения высвобождения лактат дегидрогеназы, как измеряется на апкической стимуляции с TNF альфа или LPS.Статистически значимое увеличение выбросов IL6 и IL8 наблюдается как в образцах альфа-обработанных LPS, так и в TNF по сравнению с контрольными необработанными клетками. Никаких различий в морфологии клеток не наблюдается между совместной культуры моделей с использованием MDDMs и MDDCs из свежих периферических моноцитов крови по сравнению с теми, которые используют талые клетки в LPS и TNF альфа подвергаются совместной культуры, нарушенный эпителиальный слой не наблюдалось. Можно использовать другие типы человеческих клеток, таких как дыхательные пути или бронхиолярные клетки, другие конечные точки также могут быть проанализированы.Главным образом исследователя были воодушевляны этим методом используя подобное для того чтобы установить вверх но с по-разному типами клетки.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

Tissues of the Human Body

SCIENTISTS IN ACTION

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Первичные человеческие бронхиальные эпителиальные клетки, выращенных из эксплантов

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Экс Vivo культуры первичных человеческих маточных труб эпителиальных клеток

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Выделение иммунных клеток из первичной опухоли

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Наивные стволовых клеток взрослых Изоляция от первичных человеческих культурах фибробластов

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Индукционные и анализ эпителиальных к мезенхимальных перехода

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Оптимальное Лентивирус производства и клеточной культуры условия, необходимые для успешного трансдукции Первичные человеческие бронхиальные эпителиальные клетки

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Микроинъекция в данио рерио к модели острое повреждение почек

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

В Ситу Мониторинг переходно сформированных молекулярных сборок чаперона в бактериях, дрожжах и клетках человека

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Выделение и обогащение эпителиальных клеток-предшественников легких человека для органоидной культуры

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...