Name: multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment
Uploaded: 2020-05-06T13:30:00
Duration: 9 min 27 s
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Los autores desean dar las gracias al Dr. Miguel Spuch-Calvar por el plan de cocultura de la Figura 3 y a la Dra. Bedia Begum Karakocak por su lectura crítica. Este estudio fue apoyado por el proyecto PATROLS, el Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención no 760813 y por la Fundación Adolphe Merkle. B.D. agradece la fundación Peter und Traudl Engelhorn por el apoyo financiero.

Los autores no tienen nada que revelar.

La producción emergente de materiales novedosos, incluidos productos químicos y medicamentos, aumenta gradualmente la necesidad de modelos predictivos in vitro. Para cumplir con los tres principios de sustitución, reducción y refinamiento de las pruebas con animales32,los modelos de células in vitro se han convertido en potentes herramientas relativas al aspecto de sustitución y reducción para elucidar de mecanismos de acción de un medicamento o material8,,9,,10,,11. Aquí se presenta un protocolo detallado de montaje del modelo multicelular utilizando células inmunitarias que están recién aisladas o descongeladas de monocitos previamente congelados. También se describe el cultivo del modelo en ALI. Por último, el protocolo ilustra un ejemplo de exposición a estímulos proinflamatorios y compara la respuesta de los dos modelos que contienen monocitos frescos o congelados.
Se han realizado diversos estudios para confirmar y justificar el valor añadido de la mayor complejidad de los modelos cultivados y expuestos en condiciones de ALI en comparación con la exposición sumergida convencional7,,22,,31. La observación de la respuesta proinflamatoria superior en cocultivos en comparación con los monocultivos de células epiteliales confirma un estudio previo. El estudio utilizó el modelo de cocultura presentado (estimulado con LPS) y mostró una mayor respuesta a los niveles de expresión génica de TNF e IL1B en comparación con el modelo7equivalente al monocultivo A549. Por otro lado, ambos modelos mostraron variaciones más altas dentro de los valores medidos de liberación de mediadores proinflamatorios en comparación con los monocultivos A549. Esto puede explicarse por el uso de células inmunitarias de diferentes donantes (capas de buffy) dentro de repeticiones biológicas (es decir, una repetición, un donante), como se muestra anteriormente7. Si se desea, las variaciones entre las réplicas se pueden superar 1) utilizando PPM descongelados del mismo donante o 2) agrupando PMM de diferentes donantes antes de congelar las células, luego el uso posterior del mismo grupo en cada repetición. También se recomienda incluir más repeticiones biológicas.
La técnica de congelación celular se puede considerar como un paso crítico; sin embargo, es un procedimiento de laboratorio común para preservar las células para el análisis fenotípico y funcional. Diversos estudios han demostrado que la calidad de los PPM congelados es vital para su supervivencia, y una técnica de congelación adecuada es clave para el éxito de ensayos posteriores con las mismas células28,,32. La modificación del protocolo se puede realizar congelando los PPM, lo que proporciona flexibilidad en la configuración experimental, ya que la disponibilidad de capas de buffy suele ser limitada. Otra ventaja de usar PRM congelados (en varios viales) sobre los recién aislados es que se pueden utilizar en experimentos posteriores incluso después de 1 año. Esto disminuye la posible cuestión de la variabilidad de donante a donante si se trata de un parámetro deseado o necesario en una experimental.
Los resultados de una comparación interlaborativa realizada después de hasta 13 meses muestran que los PPM, cuando se almacenan adecuadamente en un tanque de nitrógeno líquido, se pueden utilizar durante un largo período sin ningún efecto sobre la viabilidad celular o la recuperación celular33. Los tiempos de almacenamiento más largos (más de 1 año) pueden ser posibles tras una validación cuidadosa de la viabilidad de la célula y la capacidad de respuesta de las células antes de realizar un experimento. Además, la temperatura en el tanque de nitrógeno líquido debe permanecer estable en todo momento. El principal factor que afectaba a la viabilidad de los PPM crioconservados se encontró que era la concentración de DMSO, con una concentración óptima del 10%-20 % (v/v)28. Para minimizar los efectos potencialmente nocivos de la congelación, a menudo se añaden al medio de congelación diferentes fuentes de proteínas, FBS o BSA (con una amplia gama de concentración de 40% hasta 100 %34)al medio de congelación como componentes protectores naturales que pueden aumentar la supervivencia celular.
Debido al alto potencial citotóxico de DMSO, se recomienda primero dispersar los PBM en FBS, luego agregar DMSO a los PBM ya dispersos en FBS. En particular, aunque mayores concentraciones de FBS (>40%) no mostraron ninguna mejora en la viabilidad celular, al mismo tiempo, no causaron daño a las células28. Sin embargo, los monocitos de congelación es un posible enfoque para superar problemas de disponibilidad limitada de capas de buffy. Sin embargo, si se desea el uso de MDDC y MDM de PMM frescos, las células inmunitarias se pueden diferenciar y utilizar de 5 a 8 días después del aislamiento7,16,17,35,36,37. Si la planificación experimental lo permite, se recomienda al menos 6 días de diferenciación tanto en MDDC como en MDM. Sin embargo, la coherencia entre las diferentes repeticiones en el mismo experimento, junto con las inspecciones rutinarias de sus expresiones de marcadores de superficie específicas, son cruciales. La capacidad de respuesta a un estímulo proinflamatorio, como el LPS, después del tiempo de diferenciación también debe comprobarse regularmente.
Muchas investigaciones utilizando la línea celular A549 se han realizado en ALI, ya sea como monocultivo o combinado con otros tipos de células (macrofagos, células dendríticas o fibroblastos) en el modelo de cocultura 3D,22,24,,29,,38. Utilizando este modelo de cocultura 3D, se han investigado la citotoxicidad, el estrés oxidativo o los efectos proinflamatorios de (nano-)materiales durante hasta 72 h1,17,21,24,29. El parecido del modelo con el tejido in vivo ha sido investigado previamente sobre la base de imágenes láser confocales del modelo16. Al ensamblar el modelo, es importante considerar tanto la proliferación celular (que puede afectar a A549 en el modelo presentado aquí) como el rendimiento de las células inmunitarias primarias (no proliferantes) (aquí, MDDC y MDMs). También es importante considerar que no todos los monocitos positivos CD14 se diferencian en MDDC y MDM, y que las células pueden estar presentes en formularios adjuntos y suspendidos. Según la naturaleza del conjunto de cocultura (aquí, ambos tipos de células necesitan adherirse a la capa epitelial existente), se recomienda utilizar solo las submodas adherentes de ambos tipos de células inmunitarias. Además, los análisis rutinarios de monocitos, la capacidad de respuesta de los monocultivos MDDC y MDM a LPS, y la expresión de marcadores de superficie específicos (CD14, CD163, CD86, CD93 o CD206, datos no mostrados) han sugerido que 6 y 7 días de diferenciación son los puntos de tiempo óptimos.
Aunque un número realista de células epiteliales alveolares en los pulmones humanos corresponde a 160.000 células/cm2, el número de células A549 contadas en el modelo es de 1.000.000 de células/cm2 después de 9 días cultivados en el inserto16,,18. Por lo tanto, es necesario tener en cuenta las limitaciones de este modelo in vitro. En primer lugar, la densidad de las células epiteliales se estableció en función de su capacidad para formar una capa confluente en la membrana en crecimiento. También es importante mencionar que el A549 representa una célula epitelial tipo II con una forma cuboidal, contrariamente a las células epiteliales tipo I, que son planas y extendidas. Por otro lado, el número requerido de células inmunitarias se estableció sobre la base de la literatura y se presentó en este protocolo como número de célula/área de superficie39,40,41. La densidad celular de los MDDC en el rango de 400 células/mm2 (4 células/cm2)16 es comparable a la densidad de celdas en estado estacionario de 500–750 células/mm2 (5- 7 células/cm2) notificadas en estudios in vivo39. La densidad de los MDM en este modelo está dentro del mismo rango de situación in vivo en la región alveolar humana40.
Se observó tinción de marcadores de macrófagos maduros (25F9) tanto en el lado apical (donde están presentes los MDM) como en el lado basal (es decir, en el sitio de las células dendríticas). La translocación de las células inmunitarias a través de la membrana inserta poros es posible y también se ha observado utilizando este modelo16,lo que puede explicar las diferencias observadas en las intensidades de tinción. Sin embargo, otra posible explicación es que el marcador de macrófago maduro también se puede expresar en células dendríticas, pero la expresión es altamente específica del donante42. Además, la intensidad de la expresión 25F9 es mucho mayor en los MDM(Figura 7, Figura 8). Ambos estímulos proinflamatorios (LPS y TNF-o) afectaron la integridad de la barrera epitelial pulmonar en ambas coculturas(Figura 7, Figura 8). Esto se esperaba sobre la base de publicaciones anteriores43,44 que muestran que las citoquinas proinflamatorias y los productos bacterianos alteran la integridad de las barreras epiteliales.
El modelo multicelular 3D del epitelio alveolar humano, establecido y caracterizado anteriormente17,ha servido como una herramienta poderosa y útil para evaluar las respuestas biológicas (es decir, reacciones proinflamatorias agudas, respuesta al estrés oxidativo, distribución de partículas y comunicación celular) in vitro21,24,25,45. Los resultados confirman la responsabilidad de los modelos de cocultura a estímulos proinflamatorios (aquí, LPS y TNF-o). La respuesta aumentó ligeramente cuando se utilizaron células inmunitarias a partir de PMM frescos; sin embargo, no hubo diferencia estadísticamente significativa entre las coculturas que utilizan PBM frescos frente a descongelados. Además, las reacciones proinflamatorias de ambos modelos de cocultura fueron superiores a las de los monocultivos de células epiteliales cultivados bajo las mismas condiciones (ALI). En resumen, el protocolo describe el montaje de un modelo de cocultura de tejido epitelial alveolar humano 3D utilizando PPM frescos o descongelados para diferenciar en MDM y MDDC. Se ha demostrado que ambos modelos son altamente sensibles a los estímulos proinflamatorios; por lo tanto, pueden servir como herramientas poderosas para las evaluaciones de peligro potencial y toxicidad.

Los cultivos in vitro de células pulmonares ofrecen plataformas rentables, robustas y bien controladas para evaluar los peligros de los aerosoles1. Como sistema celular modelo para neumocitos alveolares humanos, la línea celular epitelial A549 aislada de un adenocarcinoma pulmonar se utiliza a menudo2. Estas células representan células epiteliales de tipo II escamosas de la región alveolar3 y son una línea celular pulmonar ampliamente utilizada para la evaluación de peligros y toxicidad1,4,5,6,7,8,9,10. La línea celular A549 posee características relevantes de las células epiteliales alveolares tipo II, como la presencia de cuerpos lamelares característicos que contienen fosfolípidos densamente embalados3.
Se ha demostrado que cuando las células se cultivan en una interfaz aire-líquido (ALI), el surfactante se libera en el lado apical de las células epiteliales expuestas al aire, reduciendo la tensión superficial11,12,13. Esta característica es particularmente importante en las investigaciones de peligro respiratorio y toxicidad de nanomateriales. Una vez que los nanomateriales/tóxicos inhalados se depositan en la región alveolar, primero interactúan con el tensioactivo pulmonar y son desplazados por las fuerzas humectantes en la hipofase acuosa, donde la interacción con las células pulmonares tiene lugar14,15. A pesar de que las células A549 forman una monocapa (que puede crecer en exceso en multicapas en momentos posteriores cuando se cultiva en ALI) y producir surfactante, un inconveniente es su formación de unión estrecha insuficiente, lo que resulta en valores bajos de resistencia eléctrica transepitelial, pero todavía presentando una barrera funcional contra la translocación intercelular (nano)partículas16,,17,,18.
En los pulmones, hay una variedad de poblaciones de células inmunitarias, incluyendo células fagocíticas y profesionales que presentan antígenos (es decir, macrófagos y células dendríticas) que se comunican directamente a través del contacto celular-célula o la señalización intercelular para controlar y mantener la homeostasis. Los macrófagos y las células dendríticas son efectores inmunes innatos críticos e iniciadores de la respuesta inmune adaptativa19. Las células dendríticas que residen dentro o debajo del epitelio pueden formar protuberancias a través del epitelio hasta el lumen para atrapar antígenos. Los macrófagos alveolares se encuentran en la superficie apical del epitelio y actúan como células centinela, representando la primera defensa celular contra el material extraño, así como las infecciones bacterianas, virales y fúngicas. Su plasticidad fenotípica permite la rápida inducción de reacciones proinflamatorias en respuesta a tales estímulos, así como el cambio a reacciones antiinflamatorias desencadenantes (es decir, inhibitorias)20.
Para simular la barrera del tejido epitelial alveolar humano, establecimos un modelo de triple cocultura con células A549 complementadas con macrófagos humanos derivados de monocitos sanguíneos (MDM) y células dendríticas (MDDC) en los lados apical y basal, respectivamente17. El cultivo de este modelo en ALI se ha notificado previamente16, incluso hasta 72 h después de la exposición21. Las respuestas inmunitarias agudas a las exposiciones a nanotubos de carbono se mejoraron significativamente en el cultivo celular expuesto al ALI en comparación con las condiciones sumergidas22. El modelo de cocultura, cultivado y expuesto a diferentes materiales en ALI, se ha utilizado previamente para investigar la citotoxicidad, el estrés oxidativo y las respuestas inflamatorias sobre exposiciones al óxido de zinc,23 materiales relacionados con elgrafeno 24,nanopartículas de oro25,,26,nanotubos de carbono21,y las partículas de escape de ceniza volcánica y diésel27.
Además, se ha confirmado el importante papel de los macrófagos y las células dendríticas como células efectores inmunes en un modelo pulmonar humano in vitro. En particular, sólo se observó una mayor respuesta proinflamatoria en el modelo en presencia de células inmunitarias en comparación con los sistemas monocultivos7. Los posibles inconvenientes del uso de células inmunitarias derivadas de monocitos primarios son la accesibilidad limitada de los PMM, así como la variación de donante a donante. Como solución a estos posibles inconvenientes, se presenta aquí un protocolo que introduce la criopreservación de PRM28 recién aislados para el ensamblaje del modelo de cultivo celular. El objetivo de este estudio es demostrar el ensamblaje del modelo de tejido epitelial alveolar humano 3D, incluyendo el aislamiento de PPM de batas de color humano. La capacidad de respuesta a los estímulos proinflamatorios se compara con el modelo compuesto de MDM y MDDC diferenciados de los PBM frescos o diferenciados de los PBM congelados o descongelados.
Trabajar con muestras de sangre humana no probadas implica atención específica para prevenir la transmisión potencial de enfermedades infecciosas, como el VIH (virus de inmunodeficiencia humana), la hepatitis B y la hepatitis C. Por lo tanto, el uso de medidas de protección personal como guantes, batas, máscaras y protección ocular son cruciales y deben estar de acuerdo con los principios de buenas prácticas de laboratorio. Estas protecciones reducen el riesgo de exponer la piel o las membranas mucosas a fluidos potencialmente infecciosos. Además, para los que se dedican a la manipulación de batas y PPM, la vacunación contra el virus de la hepatitis B es obligatoria, y los niveles de títulos sanguíneos de anticuerpos contra la hepatitis B deben ser superiores a 100 UI/L (es necesario abordar los requisitos legislativos específicos de cada país). Además, todo el trabajo debe realizarse en laboratorios de nivel 2 de bioseguridad (es necesario abordar los requisitos legislativos específicos de cada país). Al llevar a cabo todo el protocolo, deben adoptarse precauciones estándar de salud y seguridad asociadas con el trabajo en un entorno de laboratorio y la manipulación del cultivo celular de mamíferos, incluida la manipulación de residuos.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchmark microplate reader</td>
			<td>does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Incubator</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container (for example Mr. Frosty)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>does not have to be specific, for example</td>
			<td>Zeiss LSM 710 meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatocytometer, or automatic cell counter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar bio-safety hood class II</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStand Macs (Macs Cell Separator)</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast inverted light microscope</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette boy, pipettors (different volumes)</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable small equipment/glassware</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353046 and 353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 &#956;m pore size</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapper</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass autoclaved Petri Dishes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>10040-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>A7030-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MicroBeads human - magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-097-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS, Norway</td>
			<td>1114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td>D5879_1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>E6758-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-093-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-095-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>4524-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 &#956;g/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 &#956;g/mL</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 &#956;g/mL</td>
			<td>Agrisera, Sweden</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 &#956;g/mL</td>
			<td>eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland</td>
			<td>14-0115-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 &#181;M</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab244204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment

Un modelo de cocultivo de células alveolares humanas se describe aquí para la simulación de la barrera del tejido epitelial alveolar compuesta de células epiteliales alveolares tipo II y dos tipos de células inmunitarias (es decir, macrófagos derivados de monocitos humanos [MDM] y células dendríticas [MDDC]). Se proporciona un protocolo para ensamblar el modelo multicelular. Las células epiteliales alveolares (línea celular A549) se cultivan y diferencian en condiciones sumergidas en plaquitas permeables en pozos de dos cámaras, luego se combinan con MDM y MDDC diferenciados. Finalmente, las células se exponen a una interfaz aire-líquido durante varios días. Como las células inmunitarias primarias humanas necesitan ser aisladas de las capas de puly humanas, las células inmunitarias diferenciadas de los monocitos frescos o descongelados se comparan con el fin de adaptar el método en función de las necesidades experimentales. Los modelos tridimensionales, compuestos por células alveolares con células inmunitarias recién aisladas o descongeladas derivadas de monocitos, muestran un aumento estadísticamente significativo de la liberación de citoquinas (interleukins 6 y 8) tras la exposición a estímulos proinflamatorios (lipopolisacárido y factor de necrosis tumoral) en comparación con las células no tratadas. Por otro lado, no hay diferencia estadísticamente significativa entre la liberación de citoquinas observada en las coculturas. Esto demuestra que el modelo presentado responde a estímulos proinflamatorios en presencia de MDM y MDDC diferenciados de monocitos de sangre periférica fresca o descongelados (PBM). Por lo tanto, es una herramienta poderosa para las investigaciones de la respuesta biológica aguda a diferentes sustancias, incluyendo fármacos aerosolizados o nanomateriales.

Los modelos de cocultura pulmonar humana, compuestos por células epiteliales alveolares y células inmunitarias, se ensamblaron a partir de MDDC frescos o congelados y progenitores DE MDM (aquí, monocitos humanos derivados de la sangre periférica). Como se presenta en la Figura 1,las células A549 se sembraron 3 días después de la primera sección que implica el aislamiento/descongelación de monocitos. Después de 6 días de diferenciación, los MDM diferenciados aparecieron en forma redonda, mientras que los MDDC formaron una forma más alargada con protuberancias observables. También aparecieron como aglomerados, especialmente cuando se diferenciaban de los monocitos frescos(Figura 2, Figura 3). Las células epiteliales formaron una capa celular densa de células después de 3 días de crecimiento en inserciones de membrana(Figura 4), cuando se ensamblaron las coculturas. Después de 24 horas de montaje y otras 24 horas de ser sometidos a condiciones de ALI, las coculturas fueron preparadas para exposiciones.
La capacidad de respuesta de los modelos de cultivo celular 3D se investigó tras la exposición a estímulos proinflamatorios conocidos utilizando un enfoque pseudo-ALI, como se describió anteriormente29. Los estímulos proinflamatorios, LPS y TNF-o, se añadieron en volúmenes bajos (100 l) sobre la superficie apical del modelo celular expuesto por aire. Paralelamente, la ausencia de ruptura de membrana como medida de citotoxicidad se evaluó mediante un ensayo de LDH. Se observó un aumento significativo en la liberación de LDH en el CCM del compartimiento basal al exponerse al control positivo de la rotura de la membrana, un detergente Triton-X 100 (Figura 5). Estos resultados demostraron la capacidad de respuesta del modelo a una sustancia citotóxica, mientras que no se observó ningún aumento en la liberación de LDH tras la estimulación apical con TNF-o LPS.
Una posible razón para los diferentes valores medidos de LDH en las muestras ensambladas con PMM frescos o previamente congelados se puede atribuir al almacenamiento de muestras. Las muestras de PPM frescos se almacenaron durante más tiempo a -80 oC; por lo tanto, la actividad de la enzima LDH puede disminuir. En particular, LDH es estable por sólo hasta 4 días en CCM; por lo tanto, se recomienda realizar el ensayo a más tardar 2 días después de recoger los sobrenadantes. Alternativamente, es posible congelar los sobrenadantes directamente después de la recolección. Sin embargo, es importante considerar que la congelación puede disminuir la actividad enzimática de LDH.
La secreción de mediadores proinflamatorios (aquí, TNF- e interleukins 6 [IL-6] y 8 [IL-8]) en el MCP basal se cuantificó a través de ELISA. Estadísticamente significativas (p < 0.05, ANOVA unidireccional) en la liberación de IL-6 e IL-8 se observaron en muestras tratadas con LPS y TNF en comparación con las células no tratadas respectivas, así como en los modelos de cultivo celular ensamblados a partir de cualquiera de las fuentes de PBM (Figura 6). Aunque las concentraciones (pg/ml) de todas las citoquinas probadas en el MCP basal fueron mayores en las cocultivos compuestas de PBM fresco, las diferencias entre los dos cocultivos y monocultivos no fueron estadísticamente significativas (p > 0.05) (Figura 6). Para confirmar el valor añadido de los modelos de cocultura con respecto a un cultivo celular epitelial 2D, los monocultivos A549 también fueron expuestos a LPS o TNF- . Como era de esperar, el lanzamiento de todos los mediadores investigados de monocultivos A549 fue menor en comparación con ambos modelos de cocultura; aunque, la diferencia entre ellos no fue estadísticamente significativa (p > 0.05, ANOVA unidireccional).
La morfología celular de la barrera del tejido epitelial alveolar humano 3D se evaluó mediante microscopía de escaneo láser confocal (LSM). Para visualizar la composición de cada modelo, los macrófagos dentro de los modelos de cocultura (MDM) se teñiron con el marcador de macrófago maduro 25F9. Los MDDC se mancharon con CD83, que es un marcador importante para las células dendríticas activadas30. En cuanto a la morfología celular, no se observó ninguna diferencia entre los modelos de cocultura que utilizan MDM y MDDC de PBM frescos en comparación con los que utilizan PPM descongelados. En las coculturas expuestas a LPS y TNF, ambas compuestas de células inmunitarias frescas y congeladas, se observó una capa epitelial interrumpida en imágenes LSM, lo que no fue el caso en células no tratadas(Figura 7, Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig01.jpg"> Figura 1: Línea de tiempo esquemática del protocolo. Presentación del modelo de cocultura 3D preparación, montaje y aplicación (exposición a una sustancia probada). ALI - interfaz aire-líquido, MDDC - células dendríticas derivadas de monocitos, MDM - macrófagos derivados de monocitos, PBM - monocitos de sangre periférica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig02.jpg"> Figura 2: Los MDM y los MDDC se diferencian de los PDM frescos. Imagen de microscopía de contraste de fase de MDM diferenciados (A) y(B) MDDC de PBM frescos (6 días después del aislamiento celular). Los MDM tienen forma redonda, mientras que los MDDC se observan a menudo como aglomerados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig03.jpg"> Figura 3: LOS MDM y los MDDC se diferencian de los PBM congelados. Imagen de microscopía de contraste de fase de MDM diferenciados (A) y(B) DE PBM descongelados (6 días después de la descongelación). Los MDM son de forma redonda, pero se pueden observar algunas células alargadas. Los MDDC también aparecen de forma redonda con protuberancias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig04.jpg"> Figura 4: Crecimiento de células epiteliales en inserciones de membrana. Imagen de microscopía de contraste de fase del confluente A549 creciendo en un inserto de membrana 4 días después de la siembra, formando una densa capa de células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig05.jpg"> Figura 5: Resultados de citotoxicidad investigados mediante un ensayo basado en ruptura de membrana (LDH). Los datos se presentan como un aumento de pliegue sobre las celdas no tratadas (media SD, n a 3, el asterisco denota un aumento estadísticamente significativo en comparación con las celdas no tratadas, **p < 0.01, ****p < 0.0001). En los modelos verdes se representan los MDM y los MDDC de PBM frescos, y en los modelos morados ensamblados a partir de PBM descongelados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig06.jpg"> Figura 6: Reacciones proinflamatorias en los cocultivos y monocultivos. Los mediadores proinflamatorios (TNF-o, IL-6 e IL-8) se liberan en las coculturas tras el desafío de 24 horas con LPS o TNF-o. Los datos se presentan en relación con las células no tratadas (media SD, n a 3, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0.0001). En los modelos verdes se representan los MDM y los MDDC de PBM frescos, y en los modelos morados ensamblados a partir de PBM descongelados. El gris representa los monocultivos A549. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig07.jpg"> Figura 7: Morfología de cocultivos compuesta de células inmunitarias frescas. Imágenes LSM de lados apical y basal del modelo de cocultura con proyecciones xz de lados apicales del modelo utilizando MDMs y MDDCs de PBM frescos. La flecha blanca denota MDM, mientras que la flecha verde denota MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig08.jpg"> Figura 8: Morfología de cocultivos compuesta de células inmunitarias congeladas. Imágenes LSM del lado apical del modelo de cocultura con las proyecciones xz correspondientes, y el lado basal del modelo usando MDMs y MDDCs de PBM descongelados. Cian representa núcleos (DAPI), magenta representa citoesqueleto (rhodamine-phalloidin), blanco representa MDM (25F9) y verdes representan MDDC (CD 83). La flecha blanca denota MDM, mientras que la flecha verde denota MDDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento primario de monocitos de sangre humana, así como su diferenciación en macrófagos y células dendríticas y el montaje con células epiteliales en un modelo pulmonar humano multicelular. Se comparan las respuestas biológicas de las cocultivos compuestas de células inmunitarias diferenciadas de los monocitos recién aislados o descongelados, tras la exposición a estímulos proinflamatorios.

Modelo alveolar humano multicelular compuesto por células epiteliales y células inmunes primarias para la evaluación de riesgos

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Este modelo de audio humano individual utiliza células inmunitarias relevantes como una poderosa herramienta para predecir la respuesta inmune aguda de sustancias incluyendo nanomateriales y fármacos de conocimiento. Estos medicamentos combinan células epiteliales humanas y células inmunitarias primarias humanas para evaluar esas reacciones específicas. El uso de monocitos frescos y congelados proporciona flexibilidad para el plan de experimento.Numerosos estudios han demostrado que este modelo puede proporcionar una visión de la comunicación interestelar entre un sentido del comportamiento y el sentido inmune. Como esta demostración incluye todos los detalles importantes para taching del modelo un rasgo personal en el cultivo celular, instrucciones visuales para replicar experimentos. Varios pasos en el protocolo de la vejiga son complejos y requieren un manejo especial.Por lo tanto, se demuestran con todos los detalles necesarios que se pueden seguir fácilmente. Para el aislamiento de monocitos de sangre periférica de las capas humanas de Buffy, dividir el contenido de la bolsa de la bolsa De Buffy cosecha, uniformemente entre 250 mililitros tubos cónicos. Traiga cuidadosamente el volumen total en cada tubo 250 mililitros con PBS y mezcle los tubos con tres inversiones suaves.A continuación, dividir la solución de PBS de capa Buffy por igual entre cuatro nuevos tubos de 50 mililitros, a continuación, añadir 10 microlitros de CD 14 cuentas magnéticas positivas las séptimas células totales al tubo y mezclar bien por pipeteo. Al rellenar, desenchufe la pipeta de la pipeta e inmediatamente enchufara la abertura superior de la pipeta con un pulgar y luego coloque la pipeta rellena en la parte inferior de un tubo y desenchufe la abertura de la pipeta para permitir que el medio de gradiente de densidad fluya lentamente por debajo de la mezcla de PBS de capa de color, hasta que quede un mililitro del medio de gradiente de densidad dentro de la pipeta. Cuando se ha añadido un medio de gradiente de densidad a cada tubo de la misma manera, separa las células por centrifugación de gradiente de densidad y usa una pipeta serológica para recoger la capa blanca de células mononucleares de sangre periférica de dos a tres milímetros de espesor de entre el plasma y las capas medias de gradiente de densidad.La mejor manera de conectar la capa es eliminar el plasma primero y luego suprimir nuestras pipetas lógicas para recoger las células. Tire de las células mononucleares de sangre periférica de cada conjunto de dos tubos en un nuevo tubo de 50 mililitros y lave las células dos veces con un volumen total de 50 mililitros de PBS fresco por lavado. A continuación, deseche el sobrenadante y resusppend la pipeta en cada uno en cinco mililitros de PBS fresco y acarrear las suspensiones celulares en un solo tubo para el recuento.Después de contar, centrifugar las células de nuevo y resuspender la pelette a 80 mililitros de búfer de separación magnética por atender a las séptimas células. Luego agregue 10 microlitros de cd 14 cuentas magnéticas positivas por asistir a las séptimas células totales al tubo y mezcle bien por pipeteo. Después de una incubación de 15 minutos a cuatro grados Celsius enjuague una columna magnética con tres mililitros de búfer de separación magnética y agregue las células a la columna.Lave la columna tres veces con tres volúmenes de tampón por lavado y transfiera la columna a un tubo de 15 mililitros que contenga un mililitro de tampón de separación magnética fresca. A continuación, utilice el émbolo y cinco mililitros de tampón para vaciar las células positivas del CD 14 en el tubo. Inducir la diferenciación de las células positivas CD 14 aisladas del cordón magnético.En primer lugar, resuspend las células en una sola vez atender a las seis células por mililitro concentración en el medio de cultivo celular. O diferenciación MDDC, añadir 10 nanogramos por mililitro de y de planta de macrófago sitio granula factor estimulante al tubo y añadir tres mililitros de células a cada pozo de una placa de cultivo celular de seis pozos, o diferenciación añadir 10 nanogramos por mililitro de factor estimulante de colonia de macrófago a las células y placar las células como acaba de demostrar. Para establecer un modelo de cultivo de co-cultivo de células triples de tejido epitelial alveolar humano, primero transfiera 1,5 mililitros de medio de cultivo celular precaliente al número adecuado de Pozos de una placa de 12 pozos y coloque un inserto de cultivo celular en cada pozo.A continuación añadir 500 microlitros de suspensión de células epiteliales a una densidad de cinco veces 10 a las quintas células por mililitro en el lado apical de cada plaquita y cubrir la placa para una incubación de cuatro días en la incubadora de cultivo celular. O la siembra MDDC reemplaza el sobrenadante de los Pozos de seis placas de pozos utilizados para la diferenciación MDDC, con un mililitro de medio de cultivo celular cálido fresco y utilizar un rascador celular para separar las células de adherencia de cada pozo. Lavar cada pozo tres veces con el supernate y en cada pozo y combinar todas las soluciones celulares en un solo tubo centrífugo.El MDDC cosechado por centrifugación y pinzas estériles para colocar las plaquitas de las placas de 12 pozos boca abajo en un plato estéril de Petri. Raspar cualquier célula epitelial del lado basal de la plaquita y resuspend los MDDC en un medio de cultivo celular fresco hacer una concentración de 4.2 veces 10 de estas células por mililitro. A continuación, agregue 150 microlitros de células en cada plaquita para que toda la superficie basal de la plaquita esté igualmente cubierta con el líquido sin burbujas.Para la siembra de MDDM después de cosechar los MDDM diferenciados como se demostró para los MDDC, diluir las células a un 2,5 veces 10 a las cuatro células por mililitro de concentración media de cultivo celular fresco y agregar 500 microlitros de células por la pared de cada célula epitelial y MDDC que contiene el inserto de cultivo celular, luego coloque la tapa en la placa y coloque la placa en una incubadora de cultivo celular durante 24 horas. Al día siguiente aspirar el sobrenadante de las áreas apical y basal de cada inserto de cultivo celular y Wells. Luego esterilizas pinzas para levantar las inserciones de los Wells y añadir 600 microlitros de precalentamiento fresco a medio de cultivo celular a cada pozo.Después de seis días de diferenciación, los MDM aparecen redondos en forma mientras que los MDDC forman clústeres formados por celdas con una forma más alargada y protuberancias observables. Después de tres días de crecimiento en inserciones de membrana, las células epiteliales forman un aumento significativo de la densa en la liberación de lactato deshidrogenasa se observa en el medio de cultivo celular del compartimento basal tras la exposición a un control positivo para la ruptura de la membrana, lo que demuestra la capacidad de respuesta del modelo a una sustancia citotóxica. No hay aumento en la liberación de lactato deshidrogenasa medida tras la estimulación apical con TNF alfa o LPS.Se observan aumentos estadísticamente significativos en la liberación de IL6 e IL8 en muestras tratadas alfa LPS y TNF en comparación con el control de células no tratadas. No se observan diferencias en la morfología celular entre los modelos de cultivo cocultivo que utilizan MDDM y MDDC a partir de monocitos de sangre periférica fresca en comparación con aquellos que utilizan células descongeladas en LPS y el cocultivo alfa expuesto TNF, se observó una capa epitelial alterada. Es posible utilizar otros tipos de células humanas como las vías respiratorias o células bronquiares, también se pueden analizar otros puntos finales.Principalmente los investigadores se han inspirado en esta técnica utilizando una configuración similar a la configuración pero con diferentes tipos de células.

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Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primaria células epiteliales bronquiales Cultivada a partir de explantes

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

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Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Cultura de células humanas primarias epiteliales del tubo de Falopio

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

El aislamiento de las células inmunes de tumores primarios

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Adult Stem Cells Aislamiento de Primaria cultivos de fibroblastos humanos

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

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Lentivirus óptimo de producción y el cultivo celular condiciones necesarias para la transducción de éxito células epiteliales bronquiales humanos primarios

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Monitoreo in situ de conjuntos de chaperona molecular formadas transitoriamente en bacterias, levaduras y células humanas

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