Name: multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment
Uploaded: 2020-05-06T13:30:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment at JoVE.com

Yazarlar, Şekil 3'teki coculture programı için Dr. Miguel Spuch-Calvar'a ve eleştirel okuma için Dr. Bedia Begüm Karaocak'a teşekkür eder. Bu çalışma, 760813 sayılı hibe anlaşması kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı ve Adolphe Merkle Vakfı tarafından PATROLS projesi tarafından desteklenmiştir. B.D. mali destek için Peter und Traudl Engelhorn vakfı sayesinde.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Kimyasallar ve ilaçlar da dahil olmak üzere yeni malzemelerin ortaya çıkan üretimi, giderek prediktif in vitro modeller için ihtiyacı artırır. Hayvan testi nin üç prensibine uymak için32, in vitro hücre modelleri, bir ilacın veya malzemenin eyleminin mekanizmalarını açıklamak için değiştirme ve azaltma yönü ile ilgili güçlü araçlar haline gelmiştir8,9,10,11. Burada sunulan ya taze izole veya daha önce dondurulmuş monositler çözülmüş bağışıklık hücreleri kullanarak çok hücreli modeli montaj ayrıntılı bir protokoldür. Ayrıca ali modelinin ekimi açıklanan. Son olarak, protokol proinflamatuar uyaranlara maruz kalma bir örnek göstermektedir ve taze veya dondurulmuş monositler içeren iki modelin yanıtını karşılaştırır.
Geleneksel su altı maruziyeti7,22,31ile karşılaştırıldığında ALI koşullarında yetiştirilen ve maruz kalan modellerin gelişmiş karmaşıklığının katma değerini doğrulamak ve haklı çıkarmak için çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Kokültürlerde epitel hücrelerinin monokültürlerine göre daha yüksek proinflamatuar yanıtın gözlemi bir önceki çalışmayı doğrulamaktadır. Çalışma sunulan coculture modeli kullanılan (LPS ile uyarılmış) ve A549 monokültür eşdeğermodeli7 ile karşılaştırıldığında TNF ve IL1B gen ekspresyon düzeylerinde daha yüksek bir yanıt gösterdi. Diğer taraftan, her iki modelde de ölçülen proinflamatuar mediatör salınım değerleri içinde A549 monokültürlerine göre daha yüksek varyasyonlar saptamıştır. Bu biyolojik tekrarlar içinde farklı donörlerin bağışıklık hücrelerinin kullanımı ile açıklanabilir (buffy kat) biyolojik tekrarlar içinde (yani, bir tekrarı, bir donör), daha önce gösterildiği gibi7. İstenirse, çoğaltmalar arasındaki varyasyonlar 1) aynı donörveya 2) farklı donörlerden pbms havuz hücreleri dondurma, daha sonra her tekrarı aynı havuzun sonraki kullanımı çözülmüş PBMs kullanılarak aşılabilir. Daha fazla biyolojik tekrarlar da dahil olmak üzere tavsiye edilir.
Hücre dondurma tekniği kritik bir adım olarak kabul edilebilir; ancak, fenotipik ve fonksiyonel analiz için hücreleri korumak için ortak bir laboratuvar prosedürüdür. Çeşitli çalışmalar dondurulmuş PBM'lerin kalitesinin hayatta kalmaları için hayati önem taşıdığını ve uygun bir dondurma tekniğinin aynı hücrelerle sonraki tahlillerin başarısının anahtarı olduğunu göstermiştir28,32. Protokolün modifikasyonu, genellikle buffy coats'un kullanılabilirliği genellikle sınırlı olduğundan, deneysel kurulumda esneklik sağlayan PBM'lerin dondurulması yla gerçekleştirilebilir. Dondurulmuş PBM'leri (birkaç şişede) taze izole olanlar üzerinde kullanmanın bir diğer avantajı da, 1 yıl sonra bile sonraki deneylerde kullanılabilmeleridir. Bu, bir deneyde istenilen veya gerekli bir parametre ise donörden donöre değişkenlik konusunu azaltır.
13 aya kadar yapılan laboratuvarlar arası karşılaştırmanın sonuçları, pbm'lerin sıvı nitrojen tankında düzgün bir şekilde depolandığında hücre canlılığı veya hücre geri kazanımı üzerinde herhangi bir etkisi olmaksızın uzun bir süre boyunca kullanılabileceğini göstermektedir33. Daha uzun depolama süreleri (1 yıldan fazla) bir deneme gerçekleştirmeden önce hücre canlılığı ve hücre duyarlılığının dikkatli bir şekilde doğrulanması yla mümkün olabilir. Ayrıca, sıvı nitrojen tankındaki sıcaklık her zaman sabit kalmalıdır. Kriyopayrılmış PBM'lerin canlılığını etkileyen ana faktör DMSO konsantrasyonu olarak bulundu, optimal konsantrasyon %10-20 (v/v)28idi. Donma potansiyel zararlı etkilerini en aza indirmek için, farklı protein kaynakları, FBS veya BSA (% 40'tan %100%34'ekadar geniş bir konsantrasyon aralığı ile) genellikle hücre sağkalımını artırabilir doğal koruyucu bileşenler olarak dondurma ortamına eklenir.
DMSO'nun yüksek sitotoksik potansiyeli nedeniyle, önce FBS'de PBM'lerin dağılması, daha sonra FBS'de dağılmış olan PBM'lere DMSO eklenmesi önerilir. Özellikle, yüksek FBS konsantrasyonları (>40%) hücre canlılığında herhangi bir iyileşme göstermedi, aynı zamanda, onlar hücrelere zarar vermedi28. Bununla birlikte, donma monositler sınırlı buffy kat kullanılabilirliği sorunları nın üstesinden gelmek için olası bir yaklaşımdır. Ancak, taze PBM'lerden MdDC ve MdM kullanımı isteniyorsa, bağışıklık hücreleri ayırt edilebilir ve izolasyondansonra 5-8 gün kullanılabilir 7,16,17,35,36,37. Deneysel planlama izin veriyorsa, hem MDDC'lerde hem de MdM'lerde en az 6 günlük farklılaşma önerilir. Ancak, aynı deneydeki farklı tekrarlar arasındaki tutarlılık ve belirli yüzey işaretleyici ifadelerinin rutin denetimleri çok önemlidir. Farklılaşma süresinden sonra LPS gibi proinflamatuar bir uyarıcıya yanıt da düzenli olarak kontrol edilmelidir.
A549 hücre hattı kullanarak birçok araştırma ALI ya bir monokültür olarak ya da diğer hücre tipleri ile birlikte yapılmıştır (makrofajlar, dendritik hücreler, veya fibroblastlar) içine 3D coculture modeli22,24,29,38. Bu 3D coculture modeli kullanılarak, sitotoksisite, oksidatif stres, ya da proinflamatuar etkileri (nano-)malzemelerin kadar araştırılmıştır 72 h1,17,21,24,29. Modelin in vivo dokuya olan benzerliği daha önce model16'nınkonfokal lazer tarama görüntülemesine dayanarak araştırılmıştır. Modeli oluştururken, hem hücre çoğalması (burada sunulan modelde A549 etkileyebilir) hem de birincil (çoğalmayan) bağışıklık hücrelerinin performansı (burada, MdDcs ve MKH) dikkate almak önemlidir. Tüm CD14 pozitif monositlerin MKH'ler ve MKH'ler arasında ayrım yapmamaları ve hücrelerin hem bağlı hem de askıda formlarda bulunabildiği göz önünde bulundurulmalıdır. Coculture assembly (burada, her iki hücre türleri mevcut epitel tabakası eklemek gerekir) doğasına göre, her iki bağışıklık hücresi türünün sadece yapışkan alt popülasyonları kullanılması tavsiye edilir. Buna ek olarak, monositler, MDDC ve MDM monokültür duyarlılığının LPS'ye karşı rutin analizleri ve belirli yüzey belirteçlerinin (CD14, CD163, CD86, CD93 veya CD206, veri gösterilmez) ifadesi, 6 ve 7 günlük farklılaşmanın optimum zaman noktaları olduğunu ileri sürmüştür.
İnsan akciğerlerinde alveoler epitel hücreleringerçekçi bir sayı ~ 160.000 hücreleri / cm2karşılık olsa da, modelde sayılan A549 hücrelerinin sayısı ~ 1.000.000 hücre / cm2 9 gün sonra eklemek16,18kültürlü . Bu nedenle, bu in vitro modelsınırlamaları dikkate alınması gerekir. İlk olarak, epitel hücrelerinin yoğunluğu büyüyen membran üzerinde bir konfluent tabaka oluşturmak için yeteneğine dayalı kurulmuştur. A549'un, epitel tip I hücrelerinin aksine, kütip formunda epitel tip II hücreyi temsil ettiğini belirtmek de önemlidir. Diğer taraftan, gerekli sayıda bağışıklık hücresi literatüre göre kurulmuş ve bu protokolde hücre numarası/yüzey alanı39,40,41olarak sunulmuştur. 400 hücre/mm2 (4 hücre/cm2)aralığındaki MdDC'lerin hücreyoğunluğu, in vivo çalışmalardan bildirilen 500-750 hücre/mm2 (5- 7 hücre/cm2)sabit durum hücre yoğunluğu ile karşılaştırılabilir39. Bu modeldeki MdM yoğunluğu insan alveolar bölgede in vivo durum40aynı aralık içindedir.
Olgun makrofaj belirteç boyama (25F9) hem apikal tarafta (MdM'lerin bulunduğu yerde) hem de bazal tarafta (yani dendritik hücrelerin yerinde) gözlendi. Membran ekler gözenekleri ile bağışıklık hücrelerinin translokasyonu mümkündür ve aynı zamanda bu model kullanılarak gözlenmiştir16, boyama yoğunlukları gözlenen farklılıkları açıklayabilir. Ancak, başka bir olası açıklama olgun makrofaj belirteci de dendritik hücrelerde ifade edilebilir, ancak ifade son derece donör özgü42. Ayrıca, 25F9 ifadesinin yoğunluğu MDM'lerde çok daha yüksektir(Şekil 7, Şekil 8). Her iki proinflamatuar uyaran (LPS ve TNF-α) her iki kokültürde pulmoner epitel bariyerin bütünlüğünü etkilemiştir(Şekil 7, Şekil 8). Bu proinflamatuar sitokinler ve bakteriyel ürünler epitel bariyerlerin bütünlüğünü bozan gösteren önceki yayınlar43,,44 dayalı bekleniyordu.
İnsan alveolar epitel 3D çok hücreli modeli, kurulan ve daha önce karakterize17, biyolojik yanıtları değerlendirmek için güçlü ve yararlı bir araç olarak hizmet vermiştir (yani, akut proinflamatuar reaksiyonlar, oksidatif stres yanıtı, parçacık dağılımı, ve hücresel iletişim) in vitro21,24,25,45. Sonuçlar, kokültür modellerinin proinflamatuar uyaranlara (burada, LPS ve TNF-α) karşılığını doğrulamaktadır. Yanıt biraz taze PBMs bağışıklık hücreleri kullanılarak artmıştır; ancak, taze vs çözülmüş PBM'ler kullanarak cocultures arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu. Ayrıca, her iki kokültür modelinin proinflamatuar reaksiyonları aynı (ALI) koşullar altında yetiştirilen epitel hücre monokültürlerinden daha yüksekti. Özetle, protokol, MDM ve MDD'lere farklılaşmak için taze veya çözülmüş PBM'ler kullanarak 3Boyutlu bir insan alveoler epitel kokültür modelinin bir araya getirin. Her iki modelin de proinflamatuar uyaranlara karşı son derece duyarlı olduğu gösterilmiştir; bu nedenle, potansiyel tehlike ve toksisite değerlendirmeleri için güçlü araçlar olarak hizmet verebilir.

In vitro akciğer hücresi kültürleri aerosollerin tehlikelerini değerlendirmek için uygun maliyetli, sağlam ve iyi kontrollü platformlar sunuyoruz1. İnsan alveoler pnömofitler için model hücre sistemi olarak, pulmoner adenokarsinomdan izole edilen epitel A549 hücre hattı genellikle2kullanılır. Bu hücreler alveolar bölgeden skuamöz tip II epitel hücreleri temsil3 ve tehlike ve toksisite değerlendirmesi için yaygın olarak kullanılan akciğer hücresi hattı1,4,5,6,7,8,9,10. A549 hücre hattı alveoler epitel tip II hücrelerinin ilgili özelliklere sahiptir, yoğun paketlenmiş fosfolipidler içeren karakteristik lamellar organların varlığı gibi3.
Bu hücreler bir hava-sıvı arayüzü (ALI) kültürlü olduğunda, yüzey e-posta hücrelerinin apikal tarafında serbest bırakılır gösterilmiştir, yüzey gerilimi azaltarak11,12,13. Bu özellik özellikle nanomalzeme solunum tehlikesi ve toksisite araştırmalarında önemlidir. Bir kez solunan nanomalzemeler / toksikmaddeler alveoler bölgede birikir, ilk pulmoner sürfaktan ile etkileşim ve sulu hipofaze kuvvetleri ıslatma tarafından yerinden edilir, pulmoner hücreler ile etkileşim gerçekleşirnerede 14,15. A549 hücreleri bir monolayer oluşturmak rağmen (ALI ekili daha sonraki zaman çok katmanlı içine aşırı büyüyebilir) ve sürfaktan üretmek, bir dezavantajı düşük transepitel elektrik direnci değerleri ile sonuçlanan, ancak yine de hücreler arası (nano) parçacıklar translokasyon16karşıfonksiyonel bir bariyer sunan, 17,18.18
Akciğerlerde, fagositik ve profesyonel antijen sunan hücreler (yani makrofajlar ve dendritik hücreler) dahil olmak üzere, doğrudan hücre-hücre teması veya hücreler arası sinyal yoluyla iletişim kuranarak homeostaz'ı kontrol etmek ve sürdürmek için çeşitli bağışıklık hücresi popülasyonları vardır. Makrofajlar ve dendritik hücreler adaptif immün yanıtın kritik doğuştan gelen etkileri ve başlatıcıları19. Epiteliçinde veya altında bulunan dendritik hücreler antijenleri yakalamak için lümen epitel boyunca çıkıntılar oluşturabilir. Alveoler makrofajlar epitelin apikal yüzeyinde yer alır ve yabancı maddeye karşı ilk hücresel savunmayı temsil eden sentinel hücreler olarak hareket eder, bakteriyel, viral ve mantar enfeksiyonlarına karşı ilk hücresel savunmayı temsil eder. Onların henotypik plastisite hızla bu tür uyaranlara yanıt olarak proinflamatuar reaksiyonların indüksiyon sağlar yanı sıra anti-inflamatuar tetikleme içine kayması (yani, inhibitör) reaksiyonlar20.
İnsan alveoler epitel doku bariyerini simüle etmek için, apikal ve bazal tarafta insan kanı monosit kaynaklı makrofajlar (MdM) ve dendritik hücreler (MDDC) ile desteklenen A549 hücreleri ile üçlü bir kokültür modeli oluşturduk, sırasıyla17. ALI bu modelin Ekimi daha önce bildirilmiştir16, hatta kadar 72 h post-pozlama21. Karbon nanotüpler maruz kalma akut bağışıklık yanıtları önemli ölçüde hücre kültüründe ALI maruz olarak batık koşullara göre geliştirilmiş22. Coculture modeli, kültürlü ve ALI farklı malzemelere maruz, daha önce çinko oksit maruz kalma üzerine sitotoksisite, oksidatif stres ve inflamatuar yanıtları araştırmak için kullanılmıştır,23 grafen ile ilgili malzemeler24, altın nano tanecikleri25,26, karbon nanotüpler21, ve volkanik kül ve dizel egzoz parçacıkları27.
Ayrıca, bir in vitro insan akciğer modelinde bağışıklık efektörü hücreleri olarak makrofajlar ve dendritik hücrelerin önemli rolü teyit edilmiştir. Özellikle, modelde artmış proinflamatuar yanıt monokültür sistemlerine göre sadece bağışıklık hücrelerinin varlığında gözlenmiştir7. Birincil monosit tentüretilen bağışıklık hücrelerinin kullanımının olası sakıncaları, PBM'lerin sınırlı erişilebilirliğinin yanı sıra donör-donör varyasyonudur. Bu potansiyel dezavantajları bir çözüm olarak, burada sunulan hücre kültürü modeli derleme için taze izole PBMs28 kriyopreservation tanıtan bir protokoldür. Bu çalışmanın amacı, PBM'lerin insan buffy coats'tan izolasyonu da dahil olmak üzere 3Boyutlu insan alveolar epitel doku modeli montajını göstermektir. Proinflamatuar uyaranlara duyarlılık, yeni PBM'lerden farklı olan veya dondurulmuş/çözülmüş PBM'lerden farklı olan MDM ve MDDC'lerden oluşan modelle karşılaştırılır.
Test edilmemiş insan kanı örnekleri ile çalışmak, HIV (insan immün yetmezlik virüsü), hepatit B ve hepatit C gibi bulaşıcı hastalıkların potansiyel bulaşmasını önlemek için özel bakım gerektirir. Bu nedenle, eldiven, önlük, maske ve göz koruması gibi kişisel koruyucu önlemlerin kullanımı çok önemlidir ve iyi laboratuvar uygulama ilkelerine uygun olmalıdır. Bu korumalar, cilt veya mukoza zarlarının potansiyel olarak enfeksiyöz sıvılara maruz kalma riskini azaltır. Buna ek olarak, buffy coats ve PBM'lerin kullanımında çalışanlar için hepatit B virüsüne karşı aşılama zorunludur ve anti-hepatit B antikorlarının kan titrek düzeyleri 100 IU/L'nin üzerinde olmalıdır (ülkeye özgü yasal gerekliliklerin ele alınması gerekmektedir). Buna ek olarak, tüm çalışmalar biyogüvenlik seviyesi 2 laboratuvarlarında yapılmalıdır (ülkeye özel yasal gerekliliklerin ele alınması gerekmektedir). Tüm protokolü yürütürken, laboratuvar ortamında çalışmak ve atıkların işlenmesi de dahil olmak üzere memeli hücre kültürünün işlenmesiile ilgili standart sağlık ve güvenlik önlemleri benimsenmelidir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Benchmark microplate reader</td>
			<td>does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Incubator</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell freezing container (for example Mr. Frosty)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>does not have to be specific, for example</td>
			<td>Zeiss LSM 710 meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatocytometer, or automatic cell counter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar bio-safety hood class II</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStand Macs (Macs Cell Separator)</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast inverted light microscope</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette boy, pipettors (different volumes)</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable small equipment/glassware</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353046 and 353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 &#956;m pore size</td>
			<td>Falcon, Switzerland</td>
			<td>353181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapper</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass autoclaved Petri Dishes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 &#956;m pore size</td>
			<td>does not have to be specific, for example VWR, Switzerland</td>
			<td>10040-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL)</td>
			<td>does not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>do not have to be specific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>A7030-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MicroBeads human - magnetic beads</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-097-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium Lymphoprep</td>
			<td>Alere Technologies AS, Norway</td>
			<td>1114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td>D5879_1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>E6758-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-093-864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-095-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade</td>
			<td>Miltenyi, Germany</td>
			<td>130-096-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>4524-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>31870-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI)</td>
			<td>Gibco, Switzerland</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution (0.4%)</td>
			<td>Sigma Aldrich, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>11343015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity Detection Kit (LDH)</td>
			<td>Roche, Switzerland</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA</td>
			<td>R&#38;D, Biotechne, Switzerland</td>
			<td>DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 &#956;g/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Switzerland</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 &#956;g/mL</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab150115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 &#956;g/mL</td>
			<td>Agrisera, Sweden</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 &#956;g/mL</td>
			<td>eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland</td>
			<td>14-0115-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 &#181;M</td>
			<td>Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution</td>
			<td>Abcam, UK</td>
			<td>ab244204</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multicellular human alveolar model composed of epithelial cells and primary immune cells for hazard assessment

Alveoler hücre kokültür modeli burada alveoler epitel tip II hücreleri ve iki tip bağışıklık hücrelerinden oluşan alveoler epitel doku bariyerinin simülasyonu için tanımlanmıştır (yani, insan monosit kaynaklı makrofajlar [MDM] ve dendritik hücreler [MDCs]). Çok hücreli modeli birleştirmek için bir protokol sağlanır. Alveolar epitel hücreleri (A549 hücre hattı) iki odalı kuyularda geçirilebilir ekler üzerinde batık koşullar altında yetiştirilen ve farklılaştırılmış koşullar altında, daha sonra farklılaşmış MdM ve MdDCs ile birlikte. Son olarak, hücreler birkaç gün boyunca bir hava-sıvı arayüzüne maruz kalırlar. İnsan birincil bağışıklık hücrelerinin insan buffy kat izole edilmesi gerektiğinden, bağışıklık hücreleri ya taze ya da çözülmüş monositler farklılaştırılan deneysel ihtiyaçlarına dayalı yöntemi uyarlamak için karşılaştırılır. Taze izole edilmiş veya çözülmüş monosit türevi bağışıklık hücreleri ile alveolar hücrelerden oluşan üç boyutlu modeller, tedavi edilmeyen hücrelere göre proinflamatuar uyaranlara (lipopoplysaccharide ve tümör nekroz faktörü α) maruz kalındığında sitokin (interlökinler 6 ve 8) salınımında istatistiksel olarak anlamlı bir artış göstermektedir. Diğer taraftan, kokültürlerde gözlenen sitokin salınımı arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktur. Bu, sunulan modelin taze veya çözülmüş periferik kan monositlerinden (PBM) farklılaşan MdM ve MdDC'lerin varlığında proinflamatuar uyaranlara yanıt verdiğini göstermektedir. Bu nedenle, aerosolize ilaçlar veya nanomalzemeler de dahil olmak üzere farklı maddelere akut biyolojik tepki araştırmaları için güçlü bir araçtır.

Alveoler epitel hücreleri ve bağışıklık hücrelerinden oluşan insan akciğer kokültür modelleri, taze veya dondurulmuş MKH'lerden ve MdM progenitorlarından (burada, insan periferik kan kaynaklı monositler) bir araya getirildi. Şekil 1'desunulduğu gibi, A549 hücreleri monosit izolasyonu/erimeiçeren ilk bölümden 3 gün sonra tohumlandı. 6 günlük farklılaşmadan sonra, farklılaştırılmış MKH'ler yuvarlak şekilli olarak ortaya çıkmış, MdC'ler ise gözlemlenebilir çıkıntılarla daha uzun bir şekil oluşturmuştur. Ayrıca özellikle taze monositlerden ayırt edildiğinde aglomera olarak ortaya çıktılar (Şekil 2, Şekil 3). Epitel hücreleri, kokültürler bir araya getirildiğinde membran uçlarında 3 günlük büyümeden sonra yoğun bir hücre hücresi oluşturmuştur(Şekil 4). 24 saat montaj ve 24 saat ali koşullarına maruz kaldıktan sonra, kokültürler pozlama için hazırlandı.
3D hücre kültürü modellerinin duyarlılığı, daha önce29olarak açıklandığı gibi, sözde ALI yaklaşımı kullanılarak bilinen proinflamatuar uyaranlara maruz kalındığında araştırılmıştır. Proinflamatuar uyaranlar, LPS ve TNF-α, düşük hacimlerde (100 μL) hava maruz hücre modelinin apikal yüzeyine eklendi. Buna paralel olarak, sitotoksisitenin bir ölçüsü olarak membran rüptürü yokluğu LDH tsay ile değerlendirildi. Bazal kompartmanın CCM'sinde LDH salınımında önemli bir artış membran rüptürü için pozitif kontrole maruz kalındığında gözlendi, triton-x 100 deterjanı(Şekil 5). Bu sonuçlar modelin sitotoksik bir maddeye duyarlılığını kanıtlarken, TNF-α veya LPS ile apikal stimülasyon da LDH salınımında bir artış gözlenmedi.
Taze veya önceden dondurulmuş PBM'lerle birleştirilmiş numunelerde LDH'nin farklı ölçülen değerlerinin olası bir nedeni numune depolamasına atfedilebilir. Taze PBM'lerden alınan numuneler -80 °C'de daha uzun süre saklandı; bu nedenle LDH enziminin aktivitesi düşebilir. Özellikle, LDH CCM sadece 4 gün için istikrarlı; bu nedenle, supernatants topladıktan sonra en son 2 gün tayini gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Alternatif olarak, toplama dan sonra doğrudan supernatants dondurmak mümkündür. Ancak, donma LDH enzimatik aktivitesini azaltabilir dikkate almak önemlidir.
Proinflamatuar mediatörlerin (burada TNF-α ve interlökin6 [IL-6] ve 8 [IL-8]) bazal CCM'ye salgıları ELISA ile ölçüldü. Il-6 ve IL-8 salınımında istatistiksel olarak anlamlı (p < 0.05, tek yönlü ANOVA) artışlar, hem LPS hem de TNF-α- tedavi edilen örneklerde, tedavi edilmeyen hücrelere göre ve her iki PBM kaynağından toplanan hücre kültürü modellerinde gözlendi (Şekil 6). Bazal CCM'de test edilen tüm sitokinlerin konsantrasyonları (pg/mL) taze PBM'lerden oluşan kokültürlerde daha yüksek olmasına rağmen, iki kokültür ve monokültür arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı değildi (p > 0.05)(Şekil 6). 2D epitel hücre kültürüne göre kokültür modellerinin katma değerini doğrulamak için, A549 monokültürleri de LPS veya TNF-α'ya maruz kalmıştır. Beklendiği gibi, A549 monokültürlerinden araştırılan tüm arabulucuların serbest bırakılması her iki ortak kültür modeline göre daha düşüktü; ancak aralarındaki fark istatistiksel olarak anlamlı değildi (p > 0.05, tek yönlü ANOVA).
3Boyutlu insan alveoler epitel doku bariyerinin hücresel morfolojisi konfokal lazer tarama mikroskopisi (LSM) ile değerlendirildi. Her modelin bileşimini görselleştirmek için, coculture modelleri (MDM) içindeki makrofajlar olgun makrofaj belirteci 25F9 ile boyanmıştır. MDDC'ler CD83 ile boyandı, hangi aktif dendritik hücreler için önemli bir belirteçtir30. Hücresel morfoloji ile ilgili olarak, çözülmüş PBM kullananlara göre taze PBM'lerden MDM ve MdDC kullanan kokültür modelleri arasında fark gözlenmemiştir. LpS- ve TNF-α-maruz kokültürlerde, her ikisi de taze ve dondurulmuş bağışıklık hücrelerinden oluşan, LSM görüntülerinde bozulmuş epitel tabakası gözlendi, ki bu tedavi edilmeyen hücrelerde durum böyle değildi(Şekil 7, Şekil 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig01.jpg"> Şekil 1: Protokolün şematik zaman çizelgesi. 3D coculture modeli hazırlama, montaj ve uygulama sunumu (test edilmiş bir maddeye maruz kalma). ALI = hava-sıvı arabirimi, MDDCs = monosit kaynaklı dendritik hücreler, MDM = monosit kaynaklı makrofajlar, PBM = periferik kan monositleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig02.jpg"> Şekil 2: MDM'ler ve MDDC'ler taze PBM'lerden ayırt edilir. Farklılaştırılmış (A) MDM'lerin faz-kontrast mikroskobu görüntüsü ve (B) MDDK'lar taze PBM'lerden (hücre izolasyonundan 6 gün sonra). MKH'ler yuvarlak şekilliyken, MKH'ler genellikle aglomera olarak gözlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig03.jpg"> Şekil 3: MDM'ler ve MDDC'ler dondurulmuş PBM'lerden ayırt edilir. Çözülmüş PBM'lerden(A)MDM'lerin ve (B)MDDC'lerinin faz-kontrast mikroskobu görüntüsü (çözülmeden 6 gün sonra). MDM'ler yuvarlak şekillidir, ancak bazı uzamış hücreler gözlemlenebilir. MDC'ler de çıkıntılarla yuvarlak şekilli görünür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig04.jpg"> Şekil 4: Membran uçlarında epitel hücreleri büyüme. Faz kontrastlı mikroskopi görüntüsü confluent A549 bir membran eklemek üzerinde büyüyen 4 gün tohumlama dan sonra, hücrelerin yoğun bir tabaka oluşturan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig05.jpg"> Şekil 5: Membran rüptürü esaslı (LDH) tahkikat ile incelenen sitotoksisite sonuçları. Veriler işlenmemiş hücrelere göre kat artış olarak sunulur (ortalama ± SD, n = 3, yıldız işareti işlenmemiş hücrelere göre istatistiksel olarak anlamlı bir artışı gösterir, **p < 0.01, ****p < 0.0001). Yeşil modellerde yeni PBM'lerden MdM'ler ve MdDC'ler temsil edilir ve çözülmüş PBM'lerden monte edilen mor modellerde temsil edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig06.jpg"> Şekil 6: Kokültürlerde ve monokültürlerde proinflamatuar reaksiyonlar. Proinflamatuar mediatörler (TNF-α, IL-6 ve IL-8) LPS veya TNF-α ile 24 saat meydan okuma üzerine konik lerde serbest. Veriler işlenmemiş hücrelere göre sunulur (ortalama ± SD, n = 3, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001). Yeşil modellerde yeni PBM'lerden MdM'ler ve MdDC'ler temsil edilir ve çözülmüş PBM'lerden monte edilen mor modellerde temsil edilir. Gri, A549 monokültürlerini temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig07.jpg"> Şekil 7: Taze bağışıklık hücrelerinden oluşan kokültürlerin morfolojisi. Yeni PBM'lerden MDM ve MDD'ler kullanarak modelin apikal kenarlarının xz projeksiyonları ile kokültür modelinin apikal ve bazal yanlarının LSM görüntüleri. Beyaz ok MDM'yi, yeşil ok ise MDDC'yi gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61090/61090fig08.jpg"> Şekil 8: Donmuş bağışıklık hücrelerinden oluşan kokültürlerin morfolojisi. Kokültür modelinin apikal tarafının lsm görüntüleri karşılık gelen xz projeksiyonları ile ve çözülmüş PBM'lerden MDM ve MDD'ler kullanarak modelin bazal tarafı. Beyaz ok MDM'yi, yeşil ok ise MDDC'yi gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61090/61090fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment at JoVE.com

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

Burada sunulan birincil insan kanı monosit izolasyon yanı sıra makrofajlar ve dendritik hücreler ve çok hücreli insan akciğer modeli içine epitel hücreleri ile montaj içine farklılaşma için bir protokoldür. Proinflamatuar uyaranlara maruz kalındığında, taze izole edilmiş veya çözülmüş monositlerden farklı bağışıklık hücrelerinden oluşan kokültürlerin biyolojik yanıtları karşılaştırılır.

Tehlike Değerlendirmesi İçin Epitel Hücreleri ve Primer İmmün Hücrelerden Oluşan Çok Hücreli İnsan Alveoler Modeli

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Bu bireysel insan ses modeli nanomalzemeler ve bilgi ilaçları da dahil olmak üzere maddelerin akut bağışıklık yanıtı tahmin etmek için güçlü bir araç olarak ilgili bağışıklık hücreleri kullanır. Bu tıbbi bu özel reaksiyonları değerlendirmek için insan epitel hücreleri ve insan birincil bağışıklık hücreleri birleştirir. Taze ve dondurulmuş monositlerin kullanımı deney planı için esneklik sağlar.Çok sayıda çalışma, bu modelin bir davranış duygusu ve bağışıklık duygusu arasındaki yıldızlararası iletişim içine bir fikir sağlayabilir göstermiştir. Bu gösteri, modeli hücre kültüründe kişisel bir özellik, denemeleri çoğaltmak için görsel talimatlar çivileme için tüm önemli ayrıntıları içerir. Mesane protokolünde birkaç adım karmaşık ve özel kullanım gerektirir.Bu nedenle kolayca takip edilebilen tüm gerekli ayrıntılarla gösterilirler. Insan Buffy kat periferik kan monositizolasyon için, 250 mililitre konik tüpler arasında eşit hasat Buffy ceket çanta içeriğini bölünmüş. Dikkatle PBS ile her tüp 250 mililitre toplam hacmi getirmek ve üç nazik inversions ile tüpler karıştırın.Sonra dört yeni 50 mililitre tüpler arasında eşit Buffy kat PBS çözüm bölünmüş, sonra CD 14 pozitif manyetik boncuklar 10 mikrolitre tüp yedinci toplam hücreleri ekleyin ve pipetleme tarafından iyice karıştırın. Doldurduktan sonra pipeti pipetten ayırın ve pipetin üst açıklığı hemen bir başparmakla takılır ve dolu pipeti bir tüpün altına yerleştirin ve yoğunluk gradyan ortamının boru nun altından yavaşça akmasını sağlamak için pipet infilakını çekin, tabuketin içinde bir mililitre yoğunluk gradyan ortamı kalana kadar. Yoğunluk gradyan orta aynı şekilde her tüp eklendiğinde yoğunluk gradyan santrifüj ile hücreleri ayırmak ve plazma ve yoğunluk gradyan orta katmanları arasında beyaz 2-3 milimetre kalınlığında periferik kan mononükleer hücre tabakası toplamak için serolojik bir pipet kullanın.Katmanı bağlamanın en iyi yolu önce plazmayı çıkarmak ve sonra da hücreleri toplamak için mantıksal pipetlerimizi bastırmaktır. Periferik kan mononükleer hücrelerini iki tüpten her bir tüpten yeni bir 50 mililitrelik tüpe çekin ve hücreleri yıkama başına toplam 50 mililitre taze PBS hacmiyle iki kez yıkayın. Sonra supernatant atın ve taze PBS beş mililitre her pipet resuspend ve sayma için tek bir tüp içine hücre süspansiyonları havuz.Sayma sonra, hücreleri tekrar santrifüj ve yedinci hücrelere katılmak başına manyetik ayırma tampon 80 mililitre pelette resuspend. Sonra cd 14 pozitif manyetik boncuk başına 10 mikrolitre ekleyin tüp için yedinci toplam hücreleri katılmak ve pipetleme tarafından iyice karıştırın. Dört santigrat derecede 15 dakikalık bir kuluçkadan sonra üç mililitre manyetik ayırma tamponuyla manyetik bir kolon durulayın ve hücreleri kolona ekleyin.Sütunu yıkama başına üç mililitrelik tampon hacmiyle üç kez yıkayın ve kolonu bir mililitre taze manyetik ayırma tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Sonra tüp içine CD 14 pozitif hücreleri floş için dalgıç ve tampon beş mililitre kullanın. Manyetik boncuk izole CD 14 pozitif hücrelerin farklılaşması nı neden musunuz.İlk olarak, bir kez hücre kültürü ortamda mililitre konsantrasyonu başına altı hücre katılmak hücreleri bir kez resuspend. Veya MDDC farklılaşma, ve tüp granula site makrofaj koloni uyarıcı faktör başına 10 nanogram ekleyin ve altı iyi hücre kültür plaka her kuyuya hücrelerin üç mililitre eklemek, ya da MDM farklılaşma hücreleri ve plaka hücreleri için makrofaj koloni uyarıcı faktör mililitre başına 10 nanogram ekleyin ve sadece gösterildiği gibi hücreleri plaka. Bir insan alveolar epitel hücre dokusu üçlü hücre li-kültür modeli kurmak için, ilk transfer 1.5 pre-sıcak hücre kültürü orta 12 kuyu plaka Wells uygun sayıda ve her kuyu içine bir hücre kültürü eklemek yerleştirin.Sonraki her kesici uç apikal tarafına mililitre başına beşinci hücrelere beş kat 10 yoğunlukta epitel hücre süspansiyon 500 mikrolitre ekleyin ve hücre kültürü kuluçka dört günlük kuluçka için plaka kapağı. Veya MDDC tohumlama, MDDC farklılaşması için kullanılan altı kuyu plakasının Wells'inden süpernatant'ın yerini alır, bir mililitre taze sıcak hücre kültürü ortamı ile ve her kuyudaki yapışma hücrelerini ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanır. Her kuyuyu üç kez supernate ile ve her kuyuda yıkayın ve tüm hücre çözümlerini tek bir santrifüj tüpünde birleştirin.Santrifüj ve steril cımbız ile hasat MDDC steril petri çanak baş aşağı 12 kuyu plakaları ekler yerleştirmek için. Kesici uç basal tarafında herhangi bir epitel hücreleri kazıyın ve taze hücre kültürü orta MdDCs resuspend mililitre başına bu hücrelerin 4.2 kat 10 konsantrasyon yapmak. Daha sonra her kesici uç üzerine 150 mikrolitre hücre ekleyin, böylece sınamanın tüm bazal yüzeyi kabarcıklar olmadan sıvı ile eşit olarak kaplanır.MDDM'ler için gösterildiği gibi farklılaştırılmış MDDM'ler hasat edildikten sonra MDDM tohumlama için, hücreleri taze hücre kültürü orta konsantrasyonunun mililitrebaşına dört hücreye 2,5 kat 10'a seyreltin ve her epitel hücresinin duvarına 500 mikrolitre hücre ekleyin ve hücre kültürü eklemeyi içeren MDDC'nin duvarına ekleyin, sonra kapağı tabağa yerleştirin ve plakayı 24 saat boyunca bir hücre kültürüne yerleştirin. Ertesi gün her hücre kültürü eklemek ve Wells hem apikal ve bazal alanlardan supernatant aspire. Sonra Wells ekler kaldırmak ve her kuyuya hücre kültürü orta taze prewarm 600 mikrolitre eklemek için cımbız sterilize.Altı günlük farklılaşmadan sonra, MDM'ler şekil olarak yuvarlak görünürken, MDDC'ler daha uzun bir şekil ve gözlemlenebilir çıkıntılara sahip hücrelerden oluşan kümeler oluşturur. Membran uçlarında üç günlük büyümeden sonra epitel hücreleri yoğun bir laktat dehidrogenaz salınımında belirgin bir artış oluşturur Bazal kompartmanın hücre kültür ortamında membran rüptürü için pozitif bir kontrole maruz kalındığında, modelin sitotoksik bir maddeye duyarlılığını kanıtlamaktadır. TNF alfa veya LPS ile apikal stimülasyon ile ölçülen laktat dehidrogenaz salınımında artış yoktur.Il6 ve IL8 salınımında istatistiksel olarak anlamlı artışlar hem LPS hem de TNF alfa tedavi örneklerinde tedavi edilmeyen hücreleri kontrol etmeye göre gözlenmiştir. LpS ve TNF alfa maruzko-kültürde çözülmüş hücreleri kullananlara göre taze periferik kan monositlerinden MDDM ve MdD'ler kullanılarak ko-kültür modelleri arasında hücre morfolojisinde fark gözlenmemiş, bozulmuş epitel tabakası gözlenmiştir. Hava yolu veya bronşiyolar hücreler gibi insan hücrelerinin diğer türleri kullanmak mümkündür, diğer uç noktaları da analiz edilebilir.Esas olarak araştırmacılar kurmak için benzer ama farklı hücre tipleri ile bu teknik esinlenilmiştir.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

Tissues of the Human Body

SCIENTISTS IN ACTION

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Eksplantlar gelen Yetiştirilen İlköğretim İnsan Bronşiyal Epitel Hücreleri

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Kültür İlköğretim İnsan Fallop Tüp Epitel Hücreleri

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Primer Tümörler gelen Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Optimal lentivirüs üretimi ve Hücre Kültürü Koşullar Gerekli Başarıyla transduce İlköğretim İnsan Bronş Epitel Hücreleri

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...