Name: quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-09-07T13:00:00
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我们要感谢萨缪尔森实验室过去和现在的成员，感谢他们在完善这种方法和/或讨论方面提供的帮助，这些讨论有助于本文的开发。本出版物中报告的研究得到了美国国立卫生研究院国家老龄化研究所的支持，其奖项编号为RF1AG062593和R21AG064519。内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。资助者在研究设计，数据收集和分析，出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

1. 试剂的制备
<ol><li>选择要通过基于喂养的RNAi灭活的目标基因。购买含有感兴趣的RNAi克隆的HT115 大肠杆菌 库存20。或者，将目的基因的cDNA亚克隆到L4440质粒的多克隆位点中。 注意：为了防止细菌内dsRNA的降解，请使用HT115菌株。这是一种RNase III缺陷 大肠杆菌 菌株，具有IPTG诱导的T7聚合酶活性。对于不使用基于喂养的RNAi的蛋白质稳态研究，可以使用标准NGM板上?...

衰老的特征是蛋白质稳态逐渐下降。蛋白质稳态由一个复杂的系统（蛋白质静力学网络）维持，用于蛋白质折叠、降解和翻译的协调、动态、应激响应控制。为什么蛋白质稳态在衰老过程中会失败尚不清楚，但表观基因组的衰变，应激反应的可诱导性下降以及代偿性串扰的丧失都与这种崩溃相吻合。在秀丽隐杆线虫中，由于在应激位点2，34，35处形成抑制?...

蛋白质稳态（蛋白质稳态）被定义为维持蛋白质组正常功能和折叠的细胞能力。蛋白质稳态的固有挑战是确保所有蛋白质都正确折叠并保持在天然构象中，其通过蛋白质大小，氨基酸组成，结构构象，稳定性，周转，表达，亚细胞区室化和修饰的不同性质进一步放大1。蛋白质平衡是通过由大约2000种独特蛋白质组成的大型蛋白质的协调作用来维持的，这些蛋白质调节蛋白质组内的适当合成，折叠，运输和降解2，3。蛋白质静膜网络的主力成分是分子伴侣的九个主要家族4。每种组织和细胞类型都优先利用分子伴侣的特定亚群，可能符合不同蛋白质组的不同需求5。
正常有机体衰老的一个标志是细胞蛋白质平衡的进行性下降和崩溃，这被认为是越来越多的年龄相关疾病发作和进展的根本基础。例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化症（ALS）都有一个共同的特征：在每种情况下，神经变性的表现都是由遗传改变驱动的，这些改变使突变蛋白易聚集（淀粉样蛋白β/Tau，α突触核蛋白，分别是HTT，FUS / TBD - 43 / SOD-1） 6，7，8，9，10.在衰老过程中，蛋白质静剂网络的完整性和诱导性下降，这导致蛋白质毒性聚集体的积累，导致细胞功能障碍和神经变性。值得注意的是，蛋白质构象疾病不是神经元独有的，并且发生在多个组织中，如II型糖尿病，多发性骨髓瘤和囊性纤维化11，12，13，14所示。因此，阐明能够保持蛋白质平衡的机制将有助于开发有针对性的干预措施来治疗疾病并促进健康老龄化。
小土壤线虫秀丽隐杆线虫（C. elegans）在发现改变蛋白质稳态的基因和阐明途径方面发挥了重要作用。蛋白质静力学网络的许多组成部分和调节蛋白质稳态的信号转导途径在进化上是保守的。此外，秀丽隐杆线虫降低了相对于脊椎动物系统的复杂性和冗余性，使其更适合遗传分析和基因发现。秀丽隐杆线虫的其他优点导致它被广泛用作研究蛋白质稳态的模型系统，包括：强大的遗传和功能基因组学，较短的生命周期（3天）和寿命（3周），紧凑且注释良好的基因组，各种遗传突变体的可用性，以及使用荧光报告程序可视化细胞生物学中组织特异性变化的容易程度。
衰老过程中蛋白质稳态的进行性衰变可以很容易地在秀丽隐杆线虫中量化。森本实验室首先证明，融合到黄色荧光蛋白（polyQ：：YFP）的聚谷氨酰胺扩增可用于量化秀丽隐杆线虫在衰老过程中的蛋白质静力下降15，16，17，18。YFP 融合至 35 个谷氨酰胺重复序列或更多次可导致与年龄相关的荧光病灶形成以及细胞病理学体征。值得注意的是，这种谷氨酰胺扩增的范围反映了亨廷顿蛋白的聚谷氨酰胺束的长度，亨廷顿舞蹈症的病理学开始在人类中观察到（通常>35 CAG重复）19。在肌肉、肠或神经元细胞中表达polyQ：：YFP的菌株已被用于证实与年龄相关的蛋白质稳态下降发生在不同的细胞和组织类型中。肌肉特异性polyQ：：YFP表达（即unc-54p：：Q35：：YFP）一直是使用最广泛的组织特异性报告基因，因为在成年期的头几天，使用简单的荧光解剖显微镜很容易量化累积的荧光病灶（图1A-1B）。此外，动物在中年时会瘫痪，因为肌肉内的蛋白质组由于报告者的蛋白质毒性作用而塌陷（图1C）。类似地，神经元蛋白平衡的年龄相关下降可以通过直接量化将动物放入液体后协调体弯曲的病灶/聚集体形成和年龄相关下降来跟踪（rgef-1p：：Q40：：YFP）（图2）。
在这里，我们提出了一个详细的方案，说明如何测量蛋白质聚集体积累的年龄依赖性进展以及秀 丽隐杆线虫中神经元和肌肉组织中多谷氨酰胺重复表达诱导的相关蛋白质毒性。我们提供了使用这些菌株和方法产生的典型结果的示例。此外，我们展示了我们如何利用这些方法来研究蛋白质静力学网络的转录调控。我们讨论了这些报告器可以与其他现有试剂轻松集成或适应更大屏幕的其他方法。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well Culture Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#780286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#786261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin plate replicator</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-permeable plate seal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>Affymetrix/USB</td>
			<td>10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacto-peptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td>
			<td>See also Kamath et. al, Nature 2003.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td>
			<td>See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuDR (5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>160004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, CAS #26628-22-8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans

在正常衰老过程中，维持蛋白质组（蛋白质稳态）的正常功能和折叠的能力下降，促进了越来越多的年龄相关疾病的发作。例如，具有聚谷氨酰胺扩增的蛋白质容易聚集，例如亨廷顿蛋白和伴随亨廷顿舞蹈症的发作。通过使用转基因 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans） 与年龄相关的蛋白质组恶化已被广泛研究，这些秀丽隐杆线虫表达polyQ重复序列融合到黄色荧光蛋白（YFP）中。该 polyQ：：YFP 转基因动物模型通过成像荧光病灶（即蛋白质聚集体）的进行性形成以及随后由于蛋白质组塌陷而产生的运动缺陷的发作，促进了蛋白质组年龄相关衰退的直接定量。此外 ，polyQ：：YFP 转基因的表达可以由组织特异性启动子驱动，从而可以在完整的多细胞生物体的背景下评估组织内的蛋白质平衡。该模型非常适合遗传分析，因此提供了一种量化衰老的方法，与寿命测定相辅相成。我们描述了如何在衰老过程中准确测量神经元或体壁肌肉内的 polyQ：：YFP 病灶形成，以及随后行为缺陷的发作。接下来，我们将重点介绍如何使这些方法适应更高的通量，以及使用其他新兴策略进行 秀丽隐杆线虫 遗传分析的潜在未来应用。

在秀丽隐杆线虫中，聚谷氨酰胺重复模型在鉴定调节蛋白质静膜网络的基因方面起到了重要作用。例如，我们之前表明，同源域相互作用蛋白激酶（hpk-1）是一种转录辅因子，通过调节自噬和分子伴侣的表达来影响衰老过程中的蛋白质稳态31。我们发现，hpk-1的损失，无论是通过RNAi沉默还是在hpk-1（pk1393）空突变动物中，都会增加衰老过程中积累的Q35...

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Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

蛋白质静力学下降是衰老的标志，促进神经退行性疾病的发作。我们概述了一种方案，通过融合到荧光报告基因的多谷氨酰胺重复序列的异源表达来量化两种不同 秀丽隐杆线虫 组织中的蛋白质稳态。该模型允许对蛋白质稳态进行快速体内遗传分析。

量化秀丽隐杆线虫中组织特异性蛋白静剂下降

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

在秀丽隐杆线虫中使用聚谷氨酰胺荧光报告基因的组织特异性表达非常重要，因为它允许在完整的多细胞生物体的背景下发现和表征蛋白质稳态调节因子。该技术的主要优点是，它允许可视化和量化体内细胞蛋白质平衡的年龄相关下降，这对于更深入地了解生物体如何保持蛋白质组的适当折叠和功能以及衰老的影响至关重要。阐明能够保存蛋白质平衡的机制将有助于开发有针对性的干预措施，以治疗蛋白质平衡受损的衰老相关疾病，并促进健康衰老。蛋白质稳态塌陷是一个巨大的临床问题，因为它是蛋白质错误折叠疾病发展的基础，包括阿尔茨海默氏症，帕金森氏症，亨廷顿舞蹈症和肌萎缩性侧索硬化症。首先使用直径为6厘米的培养皿为每种测试条件准备五个琼脂板。对于RNAi实验，诱导转化的HT115大肠杆菌中dsRNA的产生，并使用RNAi琼脂。在标准NGM琼脂上使用OP50大肠杆菌进行无RNAi的实验。在37摄氏度下将大肠杆菌培养过夜，同时以220 RPM振荡。第二天，通过以2， 400 G离心15至20分钟沉淀细菌，然后吸出上清液并将沉淀重新悬浮在起始体积的十分之一lb中。将200微升的浓缩细菌等分到每个板上，并让打开的板在干净的环境中干燥，直到所有液体都被吸收。为了使秀丽隐杆线虫与次氯酸盐处理同步，用M9缓冲液洗涤妊娠雌雄同体两次，然后将它们转移到新鲜管中，在5毫升次氯酸盐溶液中孵育5分钟，每分钟摇动一次。孵育后，将动物旋转下来，用M9缓冲液清洗三次。让胚胎在3毫升M9溶液中在管中孵化过夜，并在20摄氏度下旋转。通过将10微升L1溶液滴到6厘米的板上三次并计数L1动物的数量来计算L1动物的密度。定期混合L1溶液以防止动物沉降。将50 L1一只动物种到每个盘子上，计数并记录播种的数量，并将盘子移动到20摄氏度的培养箱中。或者，为了通过产卵同步动物，将五到十只年轻的，怀孕的成年动物放在每个盘子上四到六个小时，让它们产卵，直到每个盘子大约有50个卵。取出所有受肉质的成虫，并将装有卵的盘子移动到20摄氏度的孵化器中。将动物培养到L4阶段，在20摄氏度下大约需要40个小时。然后加入50微升160倍FUDR。为了测量肌肉组织中蛋白质平衡的下降，选择20只动物并将其安装在显微镜载玻片上，其中有3%琼脂糖垫和5微升10毫摩尔叠氮化钠。在所有蠕虫固定后，使用10 X放大镜对动物的整个身体进行成像。使用 FITC 或 YFP 滤镜，并对每只动物进行相同的曝光。完成后，丢弃幻灯片。数一数整个动物体壁肌肉中的病灶数量。焦点是较亮的标点信号，可以与背景中较暗的可溶性信号区分开来。在得分日，用动物看盘子并记录瘫痪动物的数量，然后从盘子中取出瘫痪的动物。实验完成后，计算每种情况的麻痹率并绘制麻痹进展图。为了测量神经元组织中蛋白质稳态的下降，如前所述将蠕虫安装在载玻片上，并使用40 X放大镜在复合显微镜上拍摄动物头部的Z堆叠图像。成像后丢弃载玻片。获取图像后，将Z堆栈变平并使用它们来量化位于神经环区域的神经元中的病灶数量。绘制YFP病灶从第4天、第6天、第8天和第10天开始的积累进展。在成年期的第二天，从板中挑选10只同步的动物，并将它们放在显微镜载玻片上的10微升M9缓冲液上。重复此步骤至少四次，以获得40个或更多动物的样本。使用具有视频功能的相机在体视显微镜上视频记录动物的运动30秒。录制所有要分析的动物的视频后，播放视频并对每只动物的身体弯曲进行评分。在柱形图中绘制每只动物的身体弯曲次数，其中每个点表示 Y 轴上 30 秒内的身体弯曲次数，以及在 X 轴上测试的不同条件。聚戊胺重复模型有助于鉴定调节蛋白质静膜网络的基因。肌肉特异性polyQ-YFP表达导致荧光病灶的积累，这些荧光病灶在简单的荧光解剖显微镜下易于定量。动物在中年时会瘫痪，因为肌肉内的蛋白质组由于报告者的蛋白质毒性作用而崩溃。与年龄相关的神经元蛋白平衡下降之后，可以直接量化将动物放入液体后聚集体形成和协调身体弯曲的下降。该方法已用于表明同源结构域相互作用蛋白激酶（一种转录辅因子）通过调节自噬和分子伴侣的表达来影响衰老过程中的蛋白质稳态。HPK-1的损失增加了在老化过程中积累的Q35-YFP聚集体的数量。对照动物平均显示18个聚集体，而HPK1空突变体和HPK1 RNAi处理动物平均分别显示28个和26个聚集体。到成年期的第八天，77%至78%的HPK1缺陷动物瘫痪，而对照组只有50%。此外，HPK1的过表达被证明可以调节蛋白质聚集体的形成，并保护衰老的动物在衰老过程中免受Q35-YFP相关的瘫痪。该方法测量细胞类型内蛋白质组的一般下降。存在许多方法来评估前列腺网络特定组件的变化。它们共同提供了一幅全面的画面。蛋白质平衡下降是衰老的标志。这种方法使研究人员能够量化这种下降。当与基因分析相结合时，它是发现的强大工具。

Research

JoVE Journal

Biology

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

分离和<em在体外激活线虫精子

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

科研

生物学

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

实心板为基础的饮食限制在线虫</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

时间推移显微镜早期胚胎发育线虫

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

基本的<em&gt;线虫</em&gt;方法：同步和观察

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

前列腺素的提取与分析<em&gt;线虫</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

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多不饱和脂肪酸的膳食补充剂<em&gt;秀丽隐杆线虫</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

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栽培<em&gt;秀丽隐杆线虫</em&gt;在三个维度实验室

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

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Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

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Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

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使用 卡诺哈布迪炎埃莱甘斯 筛选组织特异性查佩龙相互作用

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