Name: quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-09-07T13:00:00
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Nous tenons à remercier les anciens et actuels membres du laboratoire Samuelson pour leur aide dans le raffinement de cette méthode et / ou de la discussion qui a aidé au développement de ce manuscrit. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le National Institute on Aging des National Institutes of Health sous les numéros d’attribution RF1AG062593 et R21AG064519. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des National Institutes of Health. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

1. Préparation des réactifs
<ol><li>Sélectionner les gènes d’intérêt à inactiver via l’ARNi basé sur l’alimentation. Acheter des stocks de HT115 E. coli contenant le clone d’ARNi d’intérêt20. Alternativement, sous-clonez l’ADNc du gène d’intérêt dans le site de multicloning du plasmide L4440. REMARQUE: Pour éviter la dégradation de l’ARNds dans les bactéries, utilisez la souche HT115. Il s’agit d’une souche d’E. coli déficiente en RNase...

Le vieillissement se caractérise par un déclin progressif de la protéostasie. La protéostasie est maintenue par un système complexe, le réseau protéostatique, pour le contrôle coordonné, dynamique et sensible au stress du repliement, de la dégradation et de la traduction des protéines. La raison pour laquelle la protéostase échoue au cours du vieillissement est mal comprise, mais un épigénome en décomposition, une diminution de l’inductibilité des réponses au stress et une perte de diaphonie compensat...

L’homéostasie protéique (protéostasie) est définie comme la capacité cellulaire à maintenir le bon fonctionnement et le repliement du protéome. Le défi inhérent à la protéostasie est de s’assurer que toutes les protéines sont correctement repliées et maintenues dans une conformation native, qui est encore amplifiée par la nature variée de la taille des protéines, de la composition en acides aminés, de la conformation structurelle, de la stabilité, du renouvellement, de l’expression, du compartimentation subcellulaire et des modifications1. La protéostasie est maintenue grâce à l’action coordonnée d’un grand réseau protéostatique, composé d’environ 2000 protéines uniques, qui régulent la synthèse, le repliement, le trafic et la dégradation appropriés dans le protéome2,3. Les composants de travail du réseau protéostatique sont neuf grandes familles de chaperons moléculaires4. Chaque type de tissu et de cellule utilise préférentiellement des sous-ensembles spécifiques de chaperons moléculaires, probablement en alignement avec les différentes exigences de protéomes distincts5.
L’une des caractéristiques du vieillissement normal de l’organisme est le déclin progressif et l’effondrement de la protéostasie cellulaire, qui est considérée comme une base sous-jacente pour l’apparition et la progression d’un nombre croissant de maladies associées à l’âge. Par exemple, la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington et la sclérose latérale amyotrophique (SLA) partagent une caractéristique commune: dans chaque cas, la manifestation de la neurodégénérescence est entraînée par des altérations génétiques qui prédisposent une protéine mutante à l’agrégation (amyloïde-β / Tau, α-synucléine, HTT, FUS / TBD-43 / SOD-1, respectivement)6,7,8,9,10 . Au cours du vieillissement, l’intégrité et l’inductibilité du réseau protéostatique diminuent, ce qui entraîne l’accumulation d’agrégats protéotoxiques qui entraînent un dysfonctionnement cellulaire et une neurodégénérescence. Il convient de noter que les maladies conformationnelles protéiques ne sont pas uniques aux neurones et se produisent dans plusieurs tissus, comme en témoignent le diabète de type II, le myélome multiple et la fibrose kystique11,12,13,14. Par conséquent, l’élucidation des mécanismes capables de préserver la protéostasie facilitera le développement d’interventions ciblées pour le traitement de la maladie et pour favoriser un vieillissement en bonne santé.
Le petit nématode du sol Caenorhabditis elegans (C. elegans) a joué un rôle déterminant dans la découverte de gènes et l’élucidation des voies qui modifient la protéostase. De nombreux composants du réseau protéostatique et les voies de transduction du signal qui régulent la protéostasie sont conservés de manière évolutionaire. En outre, C. elegans a réduit la complexité et la redondance par rapport aux systèmes vertébrés, ce qui le rend plus propice à l’analyse génétique et à la découverte de gènes. Parmi les autres avantages de C. elegans qui lui ont permis d’être largement utilisé comme système modèle pour étudier la protéostase, citons : une génomique génétique et fonctionnelle puissante, un cycle de vie court (3 jours) et une durée de vie (3 semaines), un génome compact et bien annoté, la disponibilité d’un large assortiment de mutants génétiques et la facilité de visualiser les changements spécifiques aux tissus en biologie cellulaire à l’aide de rapporteurs fluorescents.
La désintégration progressive de la protéostase au cours du vieillissement peut être facilement quantifiée chez C. elegans. Le laboratoire Morimoto a d’abord démontré qu’une expansion de polyglutamine fusionnée à une protéine fluorescente jaune (polyQ::YFP) pouvait être utilisée pour quantifier le déclin protéostatique de C. elegans au cours du vieillissement15,16,17,18. Les fusions YFP à 35 répétitions de glutamine ou plus entraînent une formation associée à l’âge de foyers fluorescents ainsi que des signes de pathologie cellulaire. Il convient de noter que cette plage d’expansion de la glutamine reflète la longueur du tractus polyglutaminique de la protéine huntingtine à laquelle la pathologie de la maladie de Huntington commence à être observée chez l’homme (généralement >35 CAG se répète)19. Des souches avec expression de polyQ::YFP dans les cellules musculaires, intestinales ou neuronales ont été utilisées pour confirmer que le déclin de la protéostase associé à l’âge se produit dans différents types de cellules et de tissus. L’expression polyQ::YFP spécifique aux muscles (c.-à-d. unc-54p::Q35::YFP) a été le rapporteur spécifique aux tissus le plus largement utilisé, car les foyers fluorescents accumulés sont faciles à quantifier au cours des premiers jours de l’âge adulte à l’aide d’un simple microscope à dissection fluorescente(Figure 1A-1B). De plus, les animaux deviennent paralysés au milieu de leur vie, car le protéome dans le muscle s’effondre en raison de l’effet protéotoxique du rapporteur(Figure 1C). De même, le déclin associé à l’âge de la protéostase neuronale peut être suivi (rgef-1p::Q40::YFP) en quantifiant directement la formation de foyers / agrégats et les déclins associés à l’âge dans les courbures corporelles coordonnées après avoir placé les animaux dans un liquide (Figure 2).
Ici, nous présentons un protocole détaillé sur la façon de mesurer la progression dépendante de l’âge de l’accumulation d’agrégats de protéines et la protéotoxicité associée induite par l’expression de répétitions de polyglutamine dans le tissu neuronal et musculaire chez C. elegans. Nous fournissons des exemples de résultats typiques générés à l’aide de ces souches et méthodes. De plus, nous montrons comment nous avons utilisé ces méthodes pour étudier la régulation transcriptionnelle du réseau protéostatique. Nous discutons d’autres façons dont ces rapporteurs peuvent être facilement intégrés à d’autres réactifs existants ou adaptés pour des écrans plus grands.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well Culture Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#780286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#786261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin plate replicator</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-permeable plate seal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>Affymetrix/USB</td>
			<td>10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacto-peptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td>
			<td>See also Kamath et. al, Nature 2003.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td>
			<td>See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuDR (5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>160004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, CAS #26628-22-8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans

La capacité de maintenir le bon fonctionnement et le repliement du protéome (homéostasie des protéines) diminue au cours du vieillissement normal, facilitant l’apparition d’un nombre croissant de maladies associées à l’âge. Par exemple, les protéines avec des expansions de polyglutamine sont sujettes à l’agrégation, comme en témoigne la protéine huntingtine et l’apparition concomitante de la maladie de Huntington. La détérioration du protéome associée à l’âge a été largement étudiée grâce à l’utilisation de Caenorhabditis elegans transgénique exprimant des répétitions polyQ fusionnées à une protéine fluorescente jaune (YFP). Ce modèle animal transgénique polyQ::YFP facilite la quantification directe du déclin du protéome associé à l’âge en imageant la formation progressive de foyers fluorescents (c.-à-d. les agrégats de protéines) et l’apparition subséquente de défauts de locomotion qui se développent à la suite de l’effondrement du protéome. De plus, l’expression du transgène polyQ::YFP peut être entraînée par des promoteurs spécifiques aux tissus, ce qui permet d’évaluer la protéostase à travers les tissus dans le contexte d’un organisme multicellulaire intact. Ce modèle se prête très bien à l’analyse génétique, fournissant ainsi une approche pour quantifier le vieillissement qui est complémentaire aux tests de durée de vie. Nous décrivons comment mesurer avec précision la formation de foyers polyQ::YFP dans les neurones ou les muscles de la paroi corporelle pendant le vieillissement, et l’apparition ultérieure de défauts de comportement. Ensuite, nous soulignons comment ces approches peuvent être adaptées pour un débit plus élevé et des applications futures potentielles en utilisant d’autres stratégies émergentes pour l’analyse génétique de C. elegans.

Chez C. elegans, le modèle de répétition de la polyglutamine a joué un rôle déterminant dans l’identification des gènes qui régulent le réseau protéostatique. Par exemple, nous avons précédemment montré que la protéine kinase interagissant avec l’homéodomaine(hpk-1),un cofacteur transcriptionnel, influence la protéostase au cours du vieillissement en régulant l’expression de l’autophagie et des chaperons moléculaires31. Nous avons constaté que la perte ...

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Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Le déclin protéostatique est une caractéristique du vieillissement, facilitant l’apparition de maladies neurodégénératives. Nous décrivons un protocole pour mesurer quantifiablement la protéostase dans deux tissus différents de Caenorhabditis elegans par l’expression hétérologue de répétitions de polyglutamine fusionnées à un rapporteur fluorescent. Ce modèle permet une analyse génétique in vivo rapide de la protéostasie.

Quantification du déclin protéostatique spécifique aux tissus chez Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

L’utilisation de l’expression tissulaire spécifique du rapporteur fluorescent polyglutamine chez C.elegans est importante car elle permet la découverte et la caractérisation de régulateurs de protéostase dans le contexte d’un organisme multicellulaire intact. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de visualiser et de quantifier le déclin de la protéostasie cellulaire associé à l’âge in vivo, ce qui est essentiel pour obtenir une compréhension mécaniste plus approfondie de la façon dont les organismes maintiennent un repliement et une fonction appropriés du protéome et des effets du vieillissement. L’élucidation des mécanismes capables de préserver la protéostasie facilitera le développement d’interventions ciblées pour le traitement des maladies associées au vieillissement dans lesquelles la protéostase est compromise et pour favoriser un vieillissement en bonne santé.L’effondrement de la protéostase est un problème clinique massif, car il sous-tend le développement de maladies de mauvais repliement des protéines, y compris la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington et la sclérose latérale amyotrophique. Commencez par utiliser des plaques de Petri de 6 centimètres de diamètre pour préparer cinq plaques de gélose pour chaque condition d’essai. Pour les expériences avec l’ARNi, induire la production d’ARNd dans HT115 E.coli transformé et utiliser une gélose ARNi.Utilisez OP50 E.coli sur une gélose NGM standard pour des expériences sans ARNi. Cultivez les cultures d’E. coli pendant la nuit à 37 degrés Celsius tout en secouant à 220 tr / min. Le lendemain, aumumez les bactéries par centrifugation à 2 400 G pendant 15 à 20 minutes, puis aspirez le surnageant et ress suspendez la pastille dans un dixième du volume de départ de lb.Aliquote 200 microlitres de bactéries concentrées dans chaque plaque et laisser sécher les plaques ouvertes dans un environnement propre jusqu’à ce que tout le liquide ait été absorbé. Pour synchroniser le C.Elegans avec le traitement à l’hypochlorite, lavez les hermaphrodites gravides deux fois avec un tampon M9, puis transférez-les dans un tube frais et incubez-les dans 5 millilitres de solution d’hypochlorite pendant cinq minutes, en les agitant toutes les minutes. Après l’incubation, faites tourner les animaux et lavez-les trois fois avec un tampon M9.Laisser les embryons éclore dans des tubes pendant la nuit dans 3 millilitres de solution de M9 avec une rotation à 20 degrés Celsius. Calculez la densité des animaux L1 en déposant 10 microlitres de solution L1 trois fois sur une plaque de 6 centimètres et en comptant le nombre d’animaux L1. Mélangez périodiquement les solutions L1 pour empêcher les animaux de s’installer.Ensemencez 50 L1 un animal sur chaque plaque, comptez et enregistrez le nombre d’animaux ensemencés, et déplacez les plaques dans un incubateur de 20 degrés Celsius. Alternativement, pour synchroniser les animaux via la ponte, placez cinq à dix jeunes animaux adultes gravides sur chaque assiette pendant quatre à six heures et laissez-les pondre jusqu’à ce qu’il y ait environ 50 œufs par assiette. Retirez tous les adultes gravides et déplacez les assiettes avec les œufs dans un incubateur de 20 degrés Celsius.Cultivez les animaux jusqu’au stade L4, ce qui prendra environ 40 heures à 20 degrés Celsius. Ajoutez ensuite 50 microlitres de 160 fois FUDR. Pour mesurer le déclin de la protéostasie dans le tissu musculaire, choisissez 20 animaux et montez-les sur une lame de microscope avec un tampon d’agarose à 3% et une goutte de 5 microlitres d’azide de sodium de 10 millimolaires.Une fois tous les vers immobilisés, imagez le corps entier des animaux à l’aide d’une lentille de grossissement de 10 X. Utilisez un filtre FITC ou YFP et la même exposition pour chaque animal. Lorsque vous avez terminé, ignorez les diapositives.Comptez le nombre de foyers dans les muscles de la paroi corporelle de l’animal entier. Les foyers sont des signaux ponctués plus lumineux qui peuvent être différenciés du signal soluble plus faible en arrière-plan. Les jours de pointage, regardez les plaques avec les animaux et enregistrez le nombre d’animaux paralysés, puis retirez les animaux paralysés de l’assiette.À la fin de l’expérience, calculez le taux de paralysie pour chaque condition et tracez la progression de la paralysie. Pour mesurer le déclin de la protéostase dans le tissu neuronal, montez les vers sur une lame comme décrit précédemment et prenez des images de la pile Z de la tête des animaux sur un microscope composé à l’aide d’une lentille de grossissement 40 X. Ignorez les diapositives après l’imagerie.Après avoir acquis les images, aplatissez les piles Z et utilisez-les pour quantifier le nombre de foyers dans les neurones situés sur la zone de l’anneau nerveux. Tracez la progression de l’accumulation de foyers YFP à partir des jours 4, 6, 8 et 10. Le deuxième jour de l’âge adulte, choisissez 10 animaux synchronisés dans la plaque et placez-les sur une goutte de 10 microlitres de tampon M9 sur une lame de microscope.Répétez cette étape au moins quatre fois pour obtenir un échantillon de 40 animaux ou plus. Enregistrez le mouvement des animaux pendant une période de 30 secondes sur un stéréomicroscope avec une caméra vidéo. Une fois que toutes les vidéos avec les animaux à analyser sont enregistrées, lisez la vidéo et notez les courbes du corps de chaque animal.Tracez le nombre de courbures du corps pour chaque animal dans un graphique à colonnes, où chaque point représente le nombre de courbures du corps en 30 secondes sur l’axe Y et les différentes conditions testées sur l’axe X. Le modèle de répétition de la polyglutamine a joué un rôle déterminant dans l’identification des gènes qui régulent le réseau protéostatique. L’expression de polyQ-YFP spécifique au muscle entraîne une accumulation de foyers fluorescents faciles à quantifier sous un simple microscope à dissection fluorescente.Les animaux deviennent paralysés au milieu de la vie, car le protéome dans le muscle s’effondre en raison de l’effet protéotoxique du rapporteur. Le déclin associé à l’âge de la protéostase neuronale peut être suivi d’une quantification directe de la formation d’agrégats et du déclin des courbures corporelles coordonnées après avoir placé les animaux dans un liquide. Cette méthode a été utilisée pour montrer que la protéine kinase interagissant dans le domaine homéo, un cofacteur transcriptionnel, influence la protéostasie pendant le vieillissement en régulant l’expression de l’autophagie et des chaperons moléculaires.La perte de HPK-1 augmente le nombre d’agrégats Q35-YFP qui s’accumulent pendant le vieillissement. Les animaux témoins présentaient en moyenne 18 agrégats, tandis que les animaux traités par le mutant nul HPK1 et l’ARNi HPK1 présentaient en moyenne 28 et 26 agrégats, respectivement. Au huitième jour de l’âge adulte, 77 à 78 % des animaux déficients en HPK1 étaient paralysés, comparativement à seulement 50 % des animaux témoins.De plus, il a été démontré que la surexpression de HPK1 régule la formation d’agrégats protéiques et protège les animaux vieillissants de la paralysie associée au Q35-YFP pendant le vieillissement. Cette méthode mesure le déclin général du protéome au sein d’un type cellulaire. De nombreuses méthodes existent pour évaluer les changements dans des composants spécifiques du réseau prostatique.Ensemble, ils fournissent une image complète. Le déclin de la protéostase est une caractéristique du vieillissement. Cette approche permet aux chercheurs de quantifier ce déclin.Lorsqu’il est combiné avec l’analyse génétique, c’est un outil puissant pour la découverte.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

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L&#39;isolement et la In vitro Activation des Caenorhabditis elegans Sperme

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