Name: quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-09-07T13:00:00
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Vorremmo ringraziare i membri passati e presenti del laboratorio Samuelson per la loro assistenza nel perfezionamento di questo metodo e / o discussione che ha aiutato lo sviluppo di questo manoscritto. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute on Aging del National Institutes of Health con i numeri di premio RF1AG062593 e R21AG064519. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

1. Preparazione dei reagenti
<ol><li>Selezionare i geni di interesse da inattivare tramite RNAi basato sull'alimentazione. Acquisto di azioni di HT115 E. coli contenenti il clone RNAi di interesse20. In alternativa, subclone il cDNA del gene di interesse nel sito multicloning del plasmide L4440. NOTA: Per prevenire la degradazione del dsRNA all'interno dei batteri, utilizzare il ceppo HT115. Questo è un ceppo di E. coli carente di RNasi III con attività della polimerasi T7...

L'invecchiamento è caratterizzato da un graduale declino della proteostasi. La proteostasi è mantenuta da un sistema complesso, la rete proteostatica, per il controllo coordinato, dinamico e sensibile allo stress del ripiegamento, della degradazione e della traduzione delle proteine. Il motivo per cui la proteostasi fallisce nel corso dell'invecchiamento è poco compreso, ma un epigenoma in decomposizione, una diminuzione dell'inducibilità delle risposte allo stress e la perdita di crosstalk compensatorio coincidono t...

L'omeostasi proteica (proteostasi) è definita come la capacità cellulare di mantenere il corretto funzionamento e il ripiegamento del proteoma. La sfida intrinseca alla proteostasi è garantire che tutte le proteine siano correttamente ripiegate e mantenute in una conformazione nativa, che è ulteriormente amplificata dalla varia natura delle dimensioni delle proteine, dalla composizione degli amminoacidi, dalla conformazione strutturale, dalla stabilità, dal turnover, dall'espressione, dalla compartimentazione subcellulare e dalle modifiche1. La proteostasi viene mantenuta attraverso l'azione coordinata di una grande rete proteostatica, costituita da circa 2000 proteine uniche, che regolano la corretta sintesi, ripiegamento, traffico e degradazione all'interno del proteoma2,3. I componenti cavallo di battaglia della rete proteostatica sono nove famiglie principali di chaperoni molecolari4. Ogni tessuto e tipo di cellula utilizza preferenzialmente sottoinsiemi specifici di chaperoni molecolari, presumibilmente in linea con le diverse esigenze di proteomi distinti5.
Un segno distintivo del normale invecchiamento dell'organismo è il progressivo declino e collasso della proteostasi cellulare, che si ritiene sia una base di base per l'insorgenza e la progressione di un numero crescente di malattie associate all'età. Ad esempio, il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la malattia di Huntington e la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) condividono una caratteristica comune: in ogni caso la manifestazione della neurodegenerazione è guidata da alterazioni genetiche che predispongono all'aggregazione una proteina mutante (amiloide-β/Tau, α-sinucleina, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1, rispettivamente)6,7,8,9,10 . Durante l'invecchiamento, l'integrità e l'inducibilità della rete proteostatica diminuisce, il che si traduce nell'accumulo di aggregati proteotossici che provocano disfunzione cellulare e neurodegenerazione. Da notare, le malattie conformazionali proteiche non sono uniche per i neuroni e si verificano su più tessuti, come evidenziato dal diabete di tipo II, dal mieloma multiplo e dalla fibrosi cistica11,12,13,14. Pertanto, chiarire meccanismi in grado di preservare la proteostasi faciliterà lo sviluppo di interventi mirati per il trattamento della malattia e per promuovere un invecchiamento sano.
Il piccolo nematode del suolo Caenorhabditis elegans (C. elegans) è stato determinante nella scoperta di geni e nel chiarire i percorsi che alterano la proteostasi. Molti componenti della rete proteostatica e le vie di trasduzione del segnale che regolano la proteostasi sono evolutivamente conservati. Inoltre, C. elegans ha ridotto la complessità e la ridondanza rispetto ai sistemi di vertebrati, rendendolo più suscettibile all'analisi genetica e alla scoperta di geni. Ulteriori vantaggi di C. elegans che hanno portato ad essere ampiamente utilizzato come sistema modello per studiare la proteostasi includono: potente genomica genetica e funzionale, un breve ciclo di vita (3 giorni) e durata della vita (3 settimane), un genoma compatto e ben annotato, la disponibilità di un vasto assortimento di mutanti genetici e la facilità di visualizzare i cambiamenti specifici del tessuto nella biologia cellulare utilizzando reporter fluorescenti.
Il progressivo decadimento della proteostasi durante l'invecchiamento può essere facilmente quantificato in C. elegans. Il laboratorio di Morimoto ha dimostrato per la prima volta che un'espansione di poliglutamina fusa in proteina fluorescente gialla(polyQ::YFP)potrebbe essere utilizzata per quantificare il declino proteostatico di C. elegans durante l'invecchiamento15,16,17,18. Le fusioni YFP a 35 ripetizioni di glutammina o più provocano una formazione associata all'età di focolai fluorescenti insieme a segni di patologia cellulare. Da notare, questa gamma di espansione della glutammina rispecchia la lunghezza del tratto poliglutamminico della proteina Huntingtina a cui la patologia della Malattia di Huntington inizia ad essere osservata negli esseri umani (tipicamente >35 ripetizioni CAG)19. Ceppi con espressione di polyQ::YFP all'interno di cellule muscolari, intestinali o neuronali sono stati utilizzati per confermare che il declino associato all'età della proteostasi si verifica in diversi tipi di cellule e tessuti. L'espressione poliQ::YFP muscolo-specifica (cioè unc-54p::Q35::YFP)è stata la reporter tessuto-specifica più utilizzata, poiché l'accumulo di focolai fluorescenti è facile da quantificare nei primi giorni dell'età adulta utilizzando un semplice microscopio fluorescente sezionante (Figura 1A-1B). Inoltre, gli animali diventano paralizzati durante la mezza età, poiché il proteoma all'interno del muscolo collassa a causa dell'effetto proteotossico del reporter (Figura 1C). Allo stesso modo, il declino associato all'età della proteostasi neuronale può essere seguito (rgef-1p::Q40::YFP) quantificando direttamente la formazione di focolai/aggregati e il declino associato all'età nelle curve coordinate del corpo dopo aver messo gli animali in liquido (Figura 2).
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato su come misurare la progressione dipendente dall'età dell'accumulo di aggregati proteici e la proteotossicità associata indotta dall'espressione di ripetizioni di poliglutamina all'interno del tessuto neuronale e muscolare in C. elegans. Forniamo esempi di risultati tipici generati utilizzando questi ceppi e metodi. Inoltre, mostriamo come abbiamo utilizzato questi metodi per studiare la regolazione trascrizionale della rete proteostatica. Discutiamo di ulteriori modi in cui questi reporter possono essere facilmente integrati con altri reagenti esistenti o adattati per schermi più grandi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well Culture Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#780286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#786261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin plate replicator</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-permeable plate seal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>Affymetrix/USB</td>
			<td>10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacto-peptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td>
			<td>See also Kamath et. al, Nature 2003.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td>
			<td>See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuDR (5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>160004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, CAS #26628-22-8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans

La capacità di mantenere il corretto funzionamento e il ripiegamento del proteoma (omeostasi proteica) diminuisce durante il normale invecchiamento, facilitando l'insorgenza di un numero crescente di malattie associate all'età. Ad esempio, le proteine con espansioni di poliglutamina sono inclini all'aggregazione, come esemplificato con la proteina huntingtina e l'insorgenza concomitante della malattia di Huntington. Il deterioramento associato all'età del proteoma è stato ampiamente studiato attraverso l'uso di Caenorhabditis elegans transgenici che esprimono ripetizioni polyQ fuse a una proteina fluorescente gialla (YFP). Questo modello animale transgenico polyQ::YFP facilita la quantificazione diretta del declino del proteoma associato all'età attraverso l'imaging della progressiva formazione di focolai fluorescenti (cioè aggregati proteici) e la successiva insorgenza di difetti di locomozione che si sviluppano a seguito del collasso del proteoma. Inoltre, l'espressione del transgene polyQ::YFP può essere guidata da promotori tessuto-specifici, consentendo la valutazione della proteostasi tra i tessuti nel contesto di un organismo multicellulare intatto. Questo modello è altamente suscettibile di analisi genetica, fornendo così un approccio per quantificare l'invecchiamento che è complementare ai saggi della durata della vita. Descriviamo come misurare con precisione la formazione di focolai polyQ::YFP all'interno dei neuroni o del muscolo della parete corporea durante l'invecchiamento e la successiva insorgenza di difetti comportamentali. Successivamente, evidenziamo come questi approcci possono essere adattati per una maggiore produttività e potenziali applicazioni future utilizzando altre strategie emergenti per l'analisi genetica di C. elegans.

In C. elegans,il modello di ripetizione della poliglutamina è stato determinante per l'identificazione dei geni che regolano la rete proteostatica. Ad esempio, abbiamo precedentemente dimostrato che l'omeodominio che interagisce con la proteina chinasi (hpk-1), un cofattore trascrizionale, influenza la proteostasi durante l'invecchiamento regolando l'espressione di autofagia e chaperoni molecolari31. Abbiamo scoperto che la perdita di hpk-1,sia per silenziamento RNAi ch...

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Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Il declino proteostatico è un segno distintivo dell'invecchiamento, facilitando l'insorgenza di malattie neurodegenerative. Delineiamo un protocollo per misurare in modo quantificabile la proteostasi in due diversi tessuti di Caenorhabditis elegans attraverso l'espressione eterologa di ripetizioni di poliglutamina fuse a un reporter fluorescente. Questo modello consente una rapida analisi genetica in vivo della proteostasi.

Quantificazione del declino proteostatico tessuto-specifico nella Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

L'uso dell'espressione tessuto-specifica di reporter fluorescente poliglutamina in C.elegans è significativo perché consente la scoperta e la caratterizzazione di regolatori di proteostasi nel contesto di un organismo multicellulare intatto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la visualizzazione e la quantificazione del declino associato all'età della proteostasi cellulare in vivo, che è essenziale per ottenere una visione meccanicistica più profonda di come gli organismi mantengono il corretto ripiegamento e la funzione del proteoma e gli effetti dell'invecchiamento. Chiarire meccanismi in grado di preservare la proteostasi faciliterà lo sviluppo di interventi mirati per il trattamento delle malattie associate all'invecchiamento in cui la proteostasi è compromessa e per promuovere un invecchiamento sano.Il collasso della proteostasi è un enorme problema clinico, in quanto è alla base dello sviluppo di malattie da misfolding proteico, tra cui Alzheimer, Parkinson, malattia di Huntington e sclerosi laterale amiotrofica. Inizia usando piastre di Petri da 6 centimetri di diametro per preparare cinque piastre di agar per ogni condizione di prova. Per gli esperimenti con RNAi, indurre la produzione di dsRNA in HT115 E.coli trasformato e utilizzare RNAi agar.Utilizzare OP50 E.coli su agar NGM standard per esperimenti senza RNAi. Coltivare le colture di E.coli durante la notte a 37 gradi Celsius mentre si scuote a 220 RPM. Il giorno successivo, pellettiamo i batteri per centrifugazione a 2.400 G per 15-20 minuti, quindi aspirare il surnatante e sospendere nuovamente il pellet in un decimo del volume iniziale di lb.Aliquota 200 microlitri di batteri concentrati su ogni piastra e lasciare asciugare le piastre aperte in un ambiente pulito fino a quando tutto il liquido non è stato assorbito. Per sincronizzare i C.Elegans con il trattamento con ipoclorito, lavare due volte gli ermafroditi gravidi con tampone M9, quindi trasferirli in un tubo fresco e incubare in 5 millilitri di soluzione di ipoclorito per cinque minuti, agitandoli ogni minuto. Dopo l'incubazione, girare verso il basso gli animali e lavarli tre volte con il tampone M9.Permettere agli embrioni di schiudersi in tubi durante la notte in 3 millilitri di soluzione M9 con rotazione a 20 gradi Celsius. Calcola la densità degli animali L1 facendo cadere 10 microlitri di soluzione L1 tre volte su una piastra di 6 centimetri e contando il numero di animali L1. Periodicamente, mescolare le soluzioni L1 per evitare che gli animali si depositino.Semina 50 L1 un animale su ogni piatto, conta e registra il numero di semi e sposta le piastre in un incubatore a 20 gradi Celsius. In alternativa, per sincronizzare gli animali tramite la deposizione delle uova, posizionare da cinque a dieci giovani animali adulti gravidi su ciascun piatto per quattro-sei ore e consentire loro di depostare le uova fino a quando non ci sono circa 50 uova per piatto. Rimuovere tutti gli adulti gravidi e spostare le piastre con le uova in un'incubatrice a 20 gradi Celsius.Far crescere gli animali fino allo stadio L4, che richiederà circa 40 ore a 20 gradi Celsius. Quindi aggiungere 50 microlitri di 160 volte FUDR. Per misurare il declino della proteostasi nel tessuto muscolare, scegli 20 animali e montali su un vetrino per microscopio con un tampone di agarose al 3% e una goccia di 5 microlitri di 10 millimolari di azide di sodio.Dopo che tutti i vermi sono immobilizzati, immagina tutti i corpi degli animali usando una lente di ingrandimento 10 X. Utilizzare un filtro FITC o YFP e la stessa esposizione per ogni animale. Al termine, scartare le diapositive.Conta il numero di fuochi nei muscoli della parete corporea dell'intero animale. I fuochi sono segnali punteggiati più luminosi che possono essere differenziati dal segnale solubile dimmer sullo sfondo. Nei giorni di punteggio, guarda le piastre con gli animali e registra il numero di animali paralizzati, quindi rimuovi gli animali paralizzati dal piatto.Al completamento dell'esperimento, calcolare il tasso di paralisi per ogni condizione e tracciare la progressione della paralisi. Per misurare il declino della proteostasi nel tessuto neuronale, montare i vermi su un vetrino come descritto in precedenza e scattare immagini Z stack della testa degli animali su un microscopio composto utilizzando una lente di ingrandimento 40 X. Scartare le diapositive dopo l'imaging.Dopo aver acquisito le immagini, appiattire le pile Z e utilizzarle per quantificare il numero di focolai nei neuroni situati nell'area dell'anello nervoso. Traccia la progressione dell'accumulo di focolai YFP dai giorni 4, 6, 8 e 10. Il secondo giorno dell'età adulta, scegli 10 animali sincronizzati dalla piastra e posizionali su una goccia di 10 microliti di tampone M9 su un vetrino del microscopio.Ripeti questo passaggio almeno quattro volte per ottenere un campione di 40 o più animali. Il video registra il movimento degli animali per un periodo di 30 secondi su uno stereomicroscopio con una videocamera capace. Una volta registrati tutti i video con gli animali da analizzare, riproduci il video e segna le curve del corpo di ciascun animale.Traccia il numero di piegature del corpo per ogni animale in un grafico a colonne, dove ogni punto rappresenta il numero di piegature del corpo in 30 secondi sull'asse Y e le diverse condizioni testate sull'asse X. Il modello di ripetizione della poliglotamina è stato determinante per l'identificazione dei geni che regolano la rete proteostatica. L'espressione di polyQ-YFP muscolo-specifica provoca l'accumulo di focolai fluorescenti che sono facili da quantificare sotto un semplice microscopio fluorescente di dissezione.Gli animali diventano paralizzati durante la mezza età, poiché il proteoma all'interno del muscolo collassa a causa dell'effetto proteotossico del reporter. Il declino associato all'età della proteostasi neuronale può essere seguito quantificando direttamente la formazione aggregata e il declino delle curve coordinate del corpo dopo aver messo gli animali in liquido. Questo metodo è stato utilizzato per dimostrare che la proteina chinasi interagente del dominio omeo, un cofattore trascrizionale, influenza la proteostasi durante l'invecchiamento regolando l'espressione di autofagia e chaperoni molecolari.La perdita di HPK-1 aumenta il numero di aggregati Q35-YFP che si accumulano durante l'invecchiamento. Gli animali di controllo hanno mostrato una media di 18 aggregati, mentre gli animali trattati con HPK1 null mutant e HPK1 RNAi hanno mostrato una media di 28 e 26 aggregati, rispettivamente. All'ottavo giorno dell'età adulta, dal 77 al 78% degli animali carenti di HPK1 erano paralizzati, rispetto al solo 50% del controllo.Inoltre, è stato dimostrato che la sovraespressione di HPK1 regola la formazione di aggregati proteici e protegge gli animali che invecchiano dalla paralisi associata a Q35-YFP durante l'invecchiamento. Questo metodo misura il declino generale del proteoma all'interno di un tipo di cellula. Esistono molti metodi per valutare i cambiamenti in componenti specifici della rete prostatica.Insieme, forniscono un quadro completo. La proteostasi in declino è un segno distintivo dell'invecchiamento. Questo approccio consente ai ricercatori di quantificare questo declino.Se combinato con l'analisi genetica, è un potente strumento per la scoperta.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

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