Name: quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-09-07T13:00:00
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우리는 이 원고의 개발을 도운 이 방법의 정교함 및/또는 토론에 도움을 준 새뮤얼슨 연구소의 과거와 현재 회원들에게 감사드립니다. 이 간행물에 보고된 연구는 상 번호 RF1AG062593 및 R21AG064519의 밑에 건강의 국가 학회에 의하여 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었습니다.

1. 시약 준비
<ol><li>먹이 기반 RNAi를 통해 비활성화 될 관심의 유전자를 선택합니다. HT115 E. 대장균의 주식 을 인수하여 RNAi 클론을 함유하고있다 20. 대안적으로, L4440 플라스미드의 다중 클론 부위로 관심 있는 유전자의 cDNA를 아복제한다. 참고: 박테리아 내의 dsRNA의 분해를 방지하려면 HT115 균주를 사용하십시오. 이는 IPTG 유도 T7 폴리머라제 활성을 가진 RNase III-결핍 ...

노화는 프로테오스타증의 점진적인 감소를 특징으로 합니다. 프로테오스타증은 단백질 접기, 분해 및 번역의 조정되고 역동적이며 스트레스 반응성이 뛰어난 제어를 위해 복잡한 시스템, 프로테오틱 네트워크로 유지됩니다. 왜 proteostasis 노화의 과정에서 실패 제대로 이해, 하지만 부패 후성 게놈, 스트레스 응답의 감소 유도성 감소, 그리고 보상 크로스 토크의 손실 모두이 고장과 일치. C. eleg...

단백질 항상성 (proteostasis)은 프로테오메의 적절한 기능과 접기를 유지하는 세포 능력으로 정의됩니다. 프로테오스타증에 대한 내재된 과제는 모든 단백질이 단백질 크기, 아미노산 조성, 구조적 형태, 안정성, 회전율, 발현, 서브 셀룰러 구획화 및 변형1의다양한 특성에 의해 더욱 증폭되는 토착 형태에서 제대로 접혀 유지되도록 하는 것이다. 프로테오스타증은 프로테오메2,3내에서 적절한 합성, 접기, 인신 매매 및 분해를 조절하는 약 2,000개의 고유 단백질로 구성된 대형 프로테온성 네트워크의 조정된 작용을 통해 유지된다. 프로테오톤 네트워크의 주력 성분은 분자 샤페론4의9개 주요 패밀리입니다. 모든 조직 및 세포 유형은 분자 보호자의 특정 하위 집합을 우선적으로 활용하며, 아마도 뚜렷한프로테옴(5)의 다른 요구와 일치한다.
정상적인 유기체 노화의 한 가지 특징은 세포 프로테오스타증의 점진적 쇠퇴와 붕괴이며, 이는 점점 더 많은 연령 관련 질병의 발병 및 진행을 위한 근본적인 기초로 여겨진다. 예를 들어, 알츠하이머 병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증(ALS)은 공통적인 특성을 공유합니다: 각 경우 신경변성 증상은 돌연변이 단백질을 응집(아밀로이드-β/타우, α-시뉴클레인, HTT,FUS/TBD/1, 10, 10, 10, 10, 73/ SOD, 10, SOD/10) . 노화 하는 동안, 무결성 및 프로 테 오 정성 네트워크의 유도 감소, 세포 기능 장애 및 신경 변성을 초래 하는 proteotoxic 집계의 축적 결과. 참고, 단백질 형성 질환은 뉴런에 만전지지 않으며, 타입 II 당뇨병, 다발성 골수종 및낭포성 섬유증(11,12,13,14)에의해 강조되는 바와 같이 여러 조직에 걸쳐 발생합니다. 따라서, 프로테오스타증을 보존할 수 있는 해명기들은 질병의 치료를 위한 표적 개입의 개발을 용이하게 하고 건강한 노화를 촉진할 것이다.
작은 토양 선충 천골 Caenorhabditis elegans (C. elegans)는유전자를 발견하고 proteostasis를 변경하는 경로를 해명하는 데 중요한 역할을하고있다. 프로테오스타시스를 조절하는 프로테오스테아시스의 많은 구성 요소와 신호 변환 경로는 진화적으로 보존된다. 더욱이, C. elegans는 척추 동물 시스템에 비해 복잡성과 중복성을 감소시켜 유전자 분석 및 유전자 발견에 더 많은 의무를 다합니다. 프로테오스타증을 연구하기 위한 모델 시스템으로 널리 사용되는 C. elegans의 추가 장점은 다음과 같습니다: 강력한 유전 및 기능적 유전체학, 짧은 수명 주기(3일) 및 수명 기간(3주), 작고 잘 기름부음게놈, 유전 돌연변이의 넓은 구색의 가용성, 및 세포 생물학을 이용한 시각적 조직 별 변화의 용이성 등이 있습니다.
노화 중 프로테오스타증의 점진적 붕괴는 C. 엘레간에서 쉽게 정량화될 수 있다. 모리모토 연구소는 먼저 노란 형광 단백질(polyQ::YFP)에융합된 폴리글루타민 팽창이 노화15,16,17,18동안 C. 예르간에서 프로티온성 감소를 정량화하는 데 사용될 수 있음을 입증하였다. 35글루타민반복에 YFP 융합은 세포 병리학의 표시와 더불어 형광 포시의 나이 관련 형성귀착됩니다. 참고, 글루타민 팽창의 이 범위는 헌팅턴병 병리학이 인간에서 관찰되기 시작하는 헌팅틴 단백질의 폴리글루타민 관의 길이를 반영한다(일반적으로 >35 CAG 반복)19. polyQ의 발현을 가진 긴장: 근육 내의 YFP, 장, 또는 신경 세포는 proteostasis의 나이 관련 쇠퇴가 다른 세포 및 조직 모형에 걸쳐 생기는다는 것을 확인하기 위하여 이용되었습니다. 근육별 폴리Q::YFP 발현(즉, unc-54p:Q35::YFP)은형광포를 축적하는 것이 단순 형광 해부 현미경(그림 1A-1B)을사용하여 성인기의 처음 며칠 동안 정량화하기쉽기 때문에 가장 널리 사용되는 조직별 기자입니다. 또한, 동물은 중년 동안 마비되고, 근육 내의 프로테오메가리포터(도 1C)의프로테오독성 효과로 인해 붕괴된다. 유사하게, 뉴런 프로테오스타증의 연령과 관련된 쇠퇴는 동물을 액체로 배치한 후 조정된 신체 굽힘에서 포시/골재 형성 및 연령과 관련된 감소를 직접 정량화함으로써 따를 수있다(그림2).
여기서, 우리는 C. elegans내뉴런 및 근육 조직 내에서 폴리글루타민 반복의 발현에 의해 유도된 단백질 골집 축적 및 관련 프로테오독성의 연령 의존적 진행을 측정하는 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이러한 균주와 방법을 사용하여 생성된 일반적인 결과의 예를 제공합니다. 또한, 우리는 우리가 프로테오틱 네트워크의 전사 적 규제를 연구하기 위해 이러한 방법을 활용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 이러한 기자가 다른 기존 시약과 쉽게 통합되거나 더 큰 화면에 적응 할 수있는 추가 방법에 대해 논의합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well Culture Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#780286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#786261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin plate replicator</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-permeable plate seal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>Affymetrix/USB</td>
			<td>10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacto-peptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td>
			<td>See also Kamath et. al, Nature 2003.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td>
			<td>See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuDR (5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>160004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, CAS #26628-22-8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans

프로테오메(단백질 항상성)의 적절한 기능과 접이식 기능을 유지하는 능력은 정상적인 노화 시 감소하여 점점 증가하는 연령 관련 질병의 발병을 용이하게 합니다. 예를 들어, 폴리글루타민 팽창을 가진 단백질은 헌팅턴 병의 헌팅틴 단백질과 수반되는 발병으로 예시되는 것처럼 응집되기 쉽습니다. 프로테오메의 노화와 관련된 악화는 황색 형광 단백질(YFP)에 융합된 폴리Q 반복을 발현하는 트랜스제닉 Caenorhabditis elegans의 사용을 통해 널리 연구되고 있다. 이러한 폴리Q:YFP 형질형 동물 모델은 형광 포시의 점진적 형성(즉, 단백질 골재)의 점진적 형성과 프로테오메의 붕괴로 인해 발생하는 운동 결함의 후속 개시를 이미징을 통해 프로테오메의 노화와 관련된 쇠퇴의 직접적인 정량화를 용이하게 한다. 또한, polyQ:YFP 트랜스진의 발현은 조직별 프로모터에 의해 구동될 수 있으며, 손상되지 않은 다세포 유기체의 맥락에서 조직 전반에 걸친 프로테오스타시스의 평가를 허용한다. 이 모델은 유전 분석에 매우 적합하므로 수명 분석에 보완되는 노화를 정량화하는 접근 법을 제공합니다. 우리는 정확하게 polyQ를 측정하는 방법을 설명합니다: YFP foci 형성 중 뉴런 또는 노화 중 신체 벽 근육, 그리고 행동 결함의 후속 개시. 다음으로, 우리는 이 접근이 더 높은 처리량, 및 C. elegans 유전 분석을 위한 그밖 신흥 전략을 사용하여 잠재적인 미래 응용을 위해 어떻게 적응될 수 있는지 강조합니다.

C. elegans에서,폴리 글루타민 반복 모델은 전립선 네트워크를 조절하는 유전자의 식별에 중요한 역할을하고있다. 예를 들어, 이전에는 동종 도메인상호작용 단백질 키나아제(hpk-1),전사 적 공동인이 노화 중 프로테오스타증에 영향을 미치는 것으로나타났다. 우리는 HPK-1의손실, RNAi 침묵 또는 hpk-1 (pk1393) null 돌연변이 동물의 손실, 노화 하는 동안 축적 <em...

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Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

전립선성 감소는 노화의 특징입니다, 신경 퇴행성 질환의 발병을 촉진. 우리는 형광 기자에게 융합 된 폴리 글루타민 반복의 이종 발현을 통해 두 가지 다른 Caenorhabditis elegans 조직에서 프로테오스타시스를 정량적으로 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 프로테오스타증의 생체 내 유전 적 분석을 빠르게 허용합니다.

Caenorhabditis 예인단에서 조직 특정 전립선 성 감소를 정량화

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

C.elegans에서 폴리글루타민 형광 기자의 조직 별 발현의 사용은 그대로 다세포 유기체의 맥락에서 프로테오스타증 조절기의 발견과 특성화를 허용하기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내에서 세포 프로테오스타증의 노화와 관련된 쇠퇴의 시각화 및 정량화를 허용한다는 것입니다. 프로테오스타증을 보존할 수 있는 유능메커니즘은 프로테오스타증이 손상된 노화 관련 질환의 치료를 위한 표적 개입의 개발을 용이하게 하고 건강한 노화를 촉진할 것이다.프로테오스타증 붕괴는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증 을 포함한 단백질 오접기 질환의 발병의 근간을 뒷받침하기 때문에 대규모 클리닉 문제입니다. 먼저 6센티미터 직경의 페트리 플레이트를 사용하여 각 테스트 조건에 대해 5개의 한천 판을 준비합니다. RNAi를 사용한 실험을 위해 변형된 HT115 E.coli에서 dsRNA 생산을 유도하고 RNAi 한천을 사용하십시오.RNAi없이 실험에 대한 표준 NGM 한고에 OP50 대장균을 사용합니다. 220 RPM에서 흔들면서 하룻밤 사이에 대장균 문화를 섭씨 37도에서 성장시다. 다음 날, 15~20분 동안 2, 400G에서 원심분리로 박테리아를 펠릿한 다음, 수퍼나탄을 흡인하고 골릿을 lb의 시작 량의 10분의 1에서 다시 중단시합니다.Aliquot 200 마이크로리터의 농축 된 박테리아는 각 플레이트에 모든 액체가 흡수 될 때까지 깨끗한 환경에서 열면 플레이트를 건조 할 수 있습니다. C.Elegans와 하이포클로라이트 트리트먼트를 동기화하려면 중력 헤르마프로디트를 M9 버퍼와 두 번 세척한 다음 신선한 튜브로 옮기고 5밀리리터의 하이포클로라이트 용액을 5밀리리터로 배양하여 매 분마다 흔들어 보냅니다. 인큐베이션 후, 동물을 스핀 다운하고 M9 버퍼로 세 번 세척합니다.배아는 섭씨 20도에서 회전하는 M9 용액 3 밀리리터에서 하룻밤 동안 튜브에서 부화할 수 있도록 합니다. L1 용액 10마이크로리터를 6센티미터 플레이트에 세 번 떨어뜨리고 L1 동물의 수를 계산하여 L1 동물의 밀도를 계산합니다. 주기적으로 L1 솔루션을 혼합하여 동물이 정착하지 못하도록 합니다.씨앗 50 L1 각 접시에 하나의 동물을, 카운트 및 시드 번호를 기록하고, 20섭씨 인큐베이터로 판을 이동합니다. 또는, 계란 누워를 통해 동물을 동기화하려면, 4 ~ 6 시간 동안 각 접시에 5 ~ 10 젊은, 중력 성인 동물을 배치하고 접시 당 약 50 계란이있을 때까지 계란을 낳을 수 있도록. 모든 중력 성인을 제거하고 계란과 접시를 20섭씨 인큐베이터로 이동합니다.섭씨 20도에서 약 40시간이 걸리는 L4 단계까지 동물을 키우십시오. 그런 다음 FUDR의 160배의 50마이크로리터를 추가합니다. 근육 조직에서 프로테오스타증의 감소를 측정하려면 20마리의 동물을 선택하고 3%의 아가로즈 패드와 10밀리올라 나트륨 아지드의 5 마이크로리터 드롭을 장착한 현미경 슬라이드에 장착하십시오.모든 웜이 고정된 후 10 X 배율 렌즈를 사용하여 동물의 몸 전체를 이미지합니다. FITC 또는 YFP 필터와 모든 동물에 대해 동일한 노출을 사용합니다. 완료되면 슬라이드를 폐기합니다.전체 동물의 신체 벽 근육에 있는 foci의 수를 계산합니다. Foci는 백그라운드의 조광 용해 신호와 차별화될 수 있는 더 밝은 구두점 신호입니다. 점수 매기기 일에, 동물과 접시를보고 마비 동물의 수를 기록 한 다음 접시에서 마비 된 동물을 제거합니다.실험이 완료되면 각 상태에 대한 마비 속도를 계산하고 마비 진행을 플롯합니다. 신경 조직에서 프로테오스타증의 감소를 측정하기 위해, 이전에 설명한 대로 슬라이드에 벌레를 장착하고 40 X 배율 렌즈를 사용하여 복합 현미경에 동물의 머리의 Z 스택 이미지를 가져 가라. 이미징 후 슬라이드를 삭제합니다.이미지를 수집 한 후 Z 스택을 평평하게하고 신경 링 영역에있는 뉴런의 포시 수를 정량화하는 데 사용합니다. 4일, 6일, 8일, 10일부터 YFP 포치 축적의 진행을 플롯한다. 성인기 둘째 날에는 접시에서 동기화된 동물 10마리를 선택하고 현미경 슬라이드에 M9 버퍼 10마이크로리터 드롭에 놓습니다.40개 이상의 동물의 샘플을 얻으려면 이 단계를 적어도 4번 반복하십시오. 비디오는 비디오 지원 카메라와 스테레오 현미경에 30 초 동안 동물의 움직임을 기록합니다. 분석할 동물과 함께 모든 비디오가 녹화되면 비디오를 재생하고 각 동물의 신체 굴곡을 점수.각 점이 Y 축에서 30초 만에 구부러지는 수와 X 축에서 테스트된 다른 조건을 나타내는 컬럼 그래프에서 각 동물의 바디 굽힘 수를 플롯합니다. 폴리글루타민 반복 모델은 전립선 성 네트워크를 조절하는 유전자의 식별에 중요한 역할을하고있다. 근육별 polyQ-YFP 발현은 단순한 형광 해부 현미경하에서 정량화하기 쉬운 형광 포시의 축적을 초래합니다.동물은 중년 도중 마비되고, 근육 내의 프로테오메는 기자의 프로테오독성 효과때문에 붕괴됩니다. 신경 프로테오스타증의 노화와 관련된 감소는 동물을 액체로 배치한 후 조정된 신체 굴곡에서 직접 골재 형성및 감소를 정량화하는 것으로 이어질 수 있습니다. 이 방법은 동종 도메인상호작용 단백질 키나아제, 전사 공동인자, 자가식 및 분자 보호자의 발현을 조절하여 노화 시 프로테오스타증에 영향을 미친다는 것을 보여주기 위해 사용되어 왔다.HPK-1의 손실은 노화 시 축적되는 Q35-YFP 집계 수를 증가시킵니다. 대조군 동물은 평균 18개의 응집체를 표시했으며, HPK1 널 돌연변이및 HPK1 RNAi 처리동물은 각각 평균 28및 26개의 골재를 표시했습니다. 성인 8일째까지 HPK1 결핍 동물의 77~78%가 마비되었으며, 대조군의 50%에 불과했습니다.또한, HPK1의 과발현은 노화 중 Q35-YFP 관련 마비로부터 단백질 골재 형성을 조절하고 노화동물을 보호하는 것으로 나타났다. 이 방법은 세포 유형 내에서 프로테오메의 일반적인 감소를 측정합니다. 프정성 네트워크의 특정 구성 요소의 변경 사항을 평가하기 위한 많은 방법이 존재합니다.함께, 그들은 포괄적 인 그림을 제공합니다. 프로테오스타증 감소는 노화의 특징입니다. 이 접근은 연구원이 이 쇠퇴를 정량화하는 것을 허용합니다.유전자 분석과 결합하면 발견을위한 강력한 도구입니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

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분리 및 체외에서</em의> 활성화 Caenorhabditis 엘레간스 정자

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

연구

생물학

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

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솔리드 플레이트 기반식이 제한에 Caenorhabditis 엘레간스</em

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상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

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Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

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에서 프로스타글란딘 추출 및 분석<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

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Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

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The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

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결합 된 뉴클레오티드와 꼬마 선 충 의 단백질 추출

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

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그대로 꼬마 선 충 에 산소 소비 속도의 측정

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

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조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...