Name: quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Vi vil takke tidligere og nåværende medlemmer av Samuelson-laboratoriet for deres hjelp til å raffinere denne metoden og/ eller diskusjonen som hjalp utviklingen av dette manuskriptet. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute on Aging of the National Institutes of Health under Award Numbers RF1AG062593 og R21AG064519. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeide manuskriptet.

1. Utarbeidelse av reagenser
<ol><li>Velg gener av interesse som skal inaktiveres via fôringsbasert RNAi. Kjøp aksjer av HT115 E. coli som inneholder RNAi klone av interesse20. Alternativt kan du subclone cDNA av genet av interesse inn i multicloning stedet av L4440 plasmid. MERK: For å forhindre nedbrytning av dsRNA i bakteriene, bruk HT115-stammen. Dette er en RNase III-mangelfull E. coli-stamme med IPTG-induserbar T7 polymeraseaktivitet. For proteostasestudier som ikke...

Aldring er preget av en gradvis nedgang i proteostase. Proteostase opprettholdes av et komplekst system, det proteostatiske nettverket, for koordinert, dynamisk, stressresponsiv kontroll av proteinfolding, nedbrytning og oversettelse. Hvorfor proteostase mislykkes i løpet av aldring er dårlig forstått, men en forfallende epigenom, avtagende inducibility av stressresponser, og tap av kompenserende krysstale sammenfaller alle med dette sammenbruddet. I C. elegans, transkripsjonell inducibility av flere former f...

Protein homeostase (proteostase) er definert som cellulær evne til å opprettholde riktig funksjon og folding av proteomet. Den iboende utfordringen med proteostase er å sikre at alle proteiner er riktig brettet og opprettholdt i en innfødt konformasjon, som forsterkes ytterligere av den varierte naturen av proteinstørrelse, aminosyresammensetning, strukturell konformasjon, stabilitet, omsetning, uttrykk, sub-cellulær oppdeling og modifikasjoner1. Proteostase opprettholdes gjennom koordinert virkning av et stort proteostatisk nettverk, bestående av ca. 2000 unike proteiner, som regulerer riktig syntese, folding, menneskehandel og nedbrytning i proteom2,3. Arbeidshestkomponentene i det proteostatiske nettverket er ni store familier av molekylære anstander4. Hvert vev og celletype bruker fortrinnsvis spesifikke undergrupper av molekylære anstander, antagelig i tråd med de forskjellige kravene til distinkte proteomer5.
Et kjennetegn på normal organisme aldring er den progressive nedgangen og sammenbruddet av cellulær proteostase, som antas å være et underliggende grunnlag for utbruddet og progresjonen av et økende antall aldersrelaterte sykdommer. For eksempel Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntingtons sykdom, og amyotrofisk lateral sklerose (ALS) deler en felles egenskap: i hvert tilfelle manifestasjon av nevrodegenerasjon er drevet av genetiske endringer som predisponerer et mutantprotein til aggregering (amyloid-β / Tau, α-synuclein, HTT, FUS / TBD-43 / SOD-1, henholdsvis)6,7,8,10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10,10 ,1 . Under aldring avtar integriteten og inducibility av det proteostatiske nettverket, noe som resulterer i opphopning av protetoksiske aggregater som resulterer i cellulær dysfunksjon og nevrodegenerasjon. Vær oppmerksom på at proteinkonformasjonssykdommer ikke er unike for nevroner, og forekommer på tvers av flere vev, som fremhevet av type II diabetes, myelomatose og cystisk fibrose11,12,13,14. Derfor vil belysende mekanismer som er i stand til å bevare proteostase lette utviklingen av målrettede intervensjoner for behandling av sykdom og for å fremme sunn aldring.
Den lille jord nematoden Caenorhabditis elegans (C. elegans) har vært medvirkende til å oppdage gener og belyse veier som endrer proteostase. Mange komponenter i det proteostatiske nettverket og signaltransduksjonsveiene som regulerer proteostase er evolusjonært bevart. Videre har C. elegans redusert kompleksitet og redundans i forhold til virveldyrsystemer, noe som gjør det mer egnet til genetisk analyse og genoppdagelse. Ytterligere fordeler med C. elegans som har ført til at det er mye brukt som et modellsystem for å studere proteostase inkluderer: kraftig genetisk og funksjonell genomikk, en kort livssyklus (3 dager) og levetid (3 uker), et kompakt og godt kommentert genom, tilgjengeligheten av et bredt utvalg av genetiske mutanter, og den enkle visualiseringen av vevsspesifikke endringer i cellebiologi ved hjelp av fluorescerende reportere.
Det progressive forfallet av proteostase under aldring kan lett kvantifiseres i C. elegans. Morimoto-laboratoriet viste først at en polyglutaminutvidelse smeltet til gult fluorescerende protein (polyQ::YFP) kunne brukes til å kvantifisere proteostatisk nedgang i C. elegans underaldring 15,16,17,18. YFP-fusjoner til 35 glutamin repetisjoner eller mer resulterer i en aldersrelatert dannelse av fluorescerende foci sammen med tegn på cellulær patologi. Vær oppmerksom på at dette spekteret av glutaminutvidelse speiler lengden på polyglutaminkanalen til Huntingtin-proteinet der Huntington sykdomspatologi begynner å bli observert hos mennesker (vanligvis >35 CAG repetisjoner)19. Stammer med uttrykk for polyQ::YFP i muskel-, tarm- eller nevronceller har blitt brukt til å bekrefte at den aldersrelaterte nedgangen av proteostase forekommer på tvers av forskjellige celle- og vevstyper. Muskelspesifikk polyQ::YFP-uttrykk (dvs. unc-54p::Q35::YFP) har vært den mest brukte vevsspesifikke reporteren, da akkumulerende fluorescerende foci er lett å kvantifisere i løpet av de første dagene av voksenlivet ved hjelp av et enkelt fluorescerende dissekeringsmikroskop (Figur 1A-1B). I tillegg blir dyr lammet i midten av livet, da proteomet i muskelen kollapser på grunn av reporterens protetoksiske effekt (figur 1C). På samme måte kan den aldersrelaterte nedgangen i nevronal proteostase følges (rgef-1p::Q40::YFP) ved direkte kvantifisering av foci/aggregert formasjon og aldersrelatert nedgang i koordinerte kroppsbøyninger etter å ha plassert dyr i væske (figur 2).
Her presenterer vi en detaljert protokoll om hvordan man måler den aldersavhengige progresjonen av protein aggregert akkumulering og tilhørende protetoksisitet indusert av uttrykket av polyglutamin repetisjoner innen nevronalt og muskelvev i C. elegans. Vi gir eksempler på typiske resultater generert ved hjelp av disse stammene og metodene. Videre viser vi hvordan vi har brukt disse metodene til å studere transkripsjonsregulering av det proteostatiske nettverket. Vi diskuterer flere måter disse reporterne enkelt kan integreres med andre eksisterende reagenser eller tilpasses større skjermer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well Culture Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#780286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#786261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin plate replicator</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-permeable plate seal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>Affymetrix/USB</td>
			<td>10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacto-peptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td>
			<td>See also Kamath et. al, Nature 2003.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td>
			<td>See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuDR (5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>160004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, CAS #26628-22-8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans

Evnen til å opprettholde riktig funksjon og folding av proteomet (protein homeostase) avtar under normal aldring, noe som letter utbruddet av et økende antall aldersrelaterte sykdommer. For eksempel er proteiner med polyglutaminutvidelser utsatt for aggregering, som eksemplifisert med huntingtinproteinet og samtidig utbrudd av Huntington sykdom. Den aldersrelaterte forverringen av proteomet har blitt studert mye gjennom bruk av transgen caenorhabditt elegans som uttrykker polyQ repetisjoner smeltet til et gult fluorescerende protein (YFP). Denne polyQ::YFP transgene dyremodellen letter direkte kvantifisering av den aldersrelaterte nedgangen i proteomet gjennom avbildning av den progressive dannelsen av fluorescerende foci (dvs. proteinaggregater) og påfølgende utbrudd av bevegelsesfeil som utvikler seg som følge av sammenbruddet av proteomet. Videre kan uttrykket av polyQ::YFP-transgene drives av vevsspesifikke promotorer, slik at vurderingen av proteostase på tvers av vev i sammenheng med en intakt multicellulær organisme. Denne modellen er svært mottagelig for genetisk analyse, og gir dermed en tilnærming til kvantifisere aldring som er komplementær til levetidsanalyser. Vi beskriver hvordan du nøyaktig måler polyQ::YFP foci dannelse i enten nevroner eller kroppsveggmuskel under aldring, og den påfølgende utbruddet av atferdsfeil. Deretter fremhever vi hvordan disse tilnærmingene kan tilpasses for høyere gjennomstrømning, og potensielle fremtidige applikasjoner ved hjelp av andre nye strategier for C. elegans genetisk analyse.

I C. eleganshar polyglutamin-repetisjonsmodellen vært medvirkende til identifisering av gener som regulerer det proteostatiske nettverket. For eksempel viste vi tidligere at homeodomain interagerende protein kinase (hpk-1), en transkripsjonell kofaktor, påvirker proteostase under aldring ved å regulere uttrykk for autofagi og molekylære anstander31. Vi fant at tap av hpk-1, enten ved RNAi-silencing eller i hpk-1(pk1393) nullmutantdyr, øker antall Q35::Y...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatisk nedgang er et kjennetegn på aldring, noe som letter utbruddet av nevrodegenerative sykdommer. Vi skisserer en protokoll for å kvantifiserbart måle proteostase i to forskjellige Caenorhabditis elegans vev gjennom heterologt uttrykk for polyglutamin repetisjoner smeltet til en fluorescerende reporter. Denne modellen tillater rask in vivo genetisk analyse av proteostase.

Kvantifiserende vevsspesifikk proteostatisk nedgang i caenorhabditt elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Bruken av vevsspesifikk uttrykk for polyglutamin fluorescerende reporter i C.elegans er betydelig fordi det tillater oppdagelse og karakterisering av proteostaseregulatorer i sammenheng med en intakt multicellulær organisme. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater visualisering og kvantifisering av den aldersrelaterte nedgangen i cellulær proteostase in vivo, noe som er viktig for å få dypere mekanistisk innsikt i hvordan organismer opprettholder riktig folding og funksjon av proteomet og effekten av aldring. Belysende mekanismer som er i stand til å bevare proteostase vil lette utviklingen av målrettede intervensjoner for behandling av aldrende tilknyttede sykdommer der proteostase er kompromittert og for å fremme sunn aldring.Proteostase kollaps er et massivt klinikkproblem, da det ligger til grunn for utviklingen av proteinfeilfoldingssykdommer, inkludert Alzheimers, Parkinsons, Huntington sykdom og amyotrofisk lateral sklerose. Begynn med å bruke Petri-plater med 6 centimeter diameter for å forberede fem agarplater for hver testtilstand. For eksperimenter med RNAi, induser dsRNA-produksjon i transformert HT115 E.coli og bruk RNAi agar.Bruk OP50 E.coli på standard NGM-agar for eksperimenter uten RNAi. Utvid E.coli-kulturene over natten ved 37 grader Celsius mens du rister ved 220 RPM. Neste dag, pellet bakteriene ved sentrifugering ved 2400 G i 15 til 20 minutter, deretter aspirere supernatant og suspendere pellet i en tiendedel av startvolumet av lb.Aliquot 200 mikroliter konsentrerte bakterier til hver plate og la de åpne platene tørke i et rent miljø til all væske er absorbert. For å synkronisere C.Elegans med hypokloritt behandling, vaske gravid hermafroditter to ganger med M9 buffer, deretter overføre dem til et friskt rør og inkubere i 5 milliliter hypokloritt løsning i fem minutter, rist dem hvert minutt. Etter inkubasjonen, spinn ned dyrene og vask dem tre ganger med M9 buffer.La embryoer klekkes i rør over natten i 3 milliliter M9-løsning med rotasjon ved 20 grader Celsius. Beregn tettheten av L1 dyr ved å slippe 10 mikroliter L1-løsning tre ganger på en 6 centimeter plate og telle antall L1 dyr. Bland regelmessig L1-løsningene for å forhindre at dyrene bosetter seg.Frø 50 L1 ett dyr på hver tallerken, tell og registrer antall frø, og flytt platene til en 20 grader Celsius inkubator. Alternativt, for å synkronisere dyr via egg lå, plasser fem til ti unge, gravid voksne dyr på hver tallerken i fire til seks timer og la dem legge egg til det er ca 50 egg per tallerken. Fjern alle gravide voksne og flytt platene med eggene til en 20 grader Celsius inkubator.Vokse dyrene til L4 stadium, som vil ta ca 40 timer ved 20 grader Celsius. Tilsett deretter 50 mikroliter 160 ganger FUDR. For å måle nedgang i proteostase i muskelvev, velg 20 dyr og monter dem på et mikroskop lysbilde med en 3% agarose pad og en 5 mikroliter dråpe på 10 millimolar natriumazid.Etter at alle ormer er immobilisert, kan du se for deg hele kroppene til dyrene ved hjelp av en 10 X forstørrelseslinse. Bruk et FITC- eller YFP-filter og samme eksponering for hvert dyr. Når du er ferdig, forkaster du lysbildene.Tell antall foci i kroppsveggmuskulaturen til hele dyret. Foci er lysere punkterte signaler som kan skilles fra dimmerløselig signal i bakgrunnen. På scoringsdager, se på platene med dyrene og registrer antall lammede dyr, og fjern deretter lammede dyr fra platen.Når eksperimentet er fullført, beregner du lammelsesraten for hver tilstand og plotter lammelsesprogresjonen. For å måle nedgang i proteostase i nevronalt vev, monter ormene på et lysbilde som tidligere beskrevet og ta Z-stakkbilder av dyrenes hode på et sammensatt mikroskop ved hjelp av en 40 X forstørrelseslinse. Forkast lysbildene etter bildebehandling.Etter å ha anskaffet bildene, flat Z-stablene og bruk dem til å kvantifisere antall foci i nevroner som ligger på nerveringområdet. Plott progresjonen av YFP foci akkumulering fra dag 4, 6, 8 og 10. På dag to av voksen alder, velg 10 synkroniserte dyr fra platen og legg dem på en 10 mikroliter dråpe M9 buffer på et mikroskop lysbilde.Gjenta dette trinnet minst fire ganger for å få en prøve på 40 eller flere dyr. Video ta opp bevegelsen av dyrene i en periode på 30 sekunder på et stereomikroskop med et videokompatibelt kamera. Når alle videoene med dyrene som skal analyseres er spilt inn, spiller du av videoen og scorer kroppsbøyene til hvert dyr.Plott antall kroppsbøyninger for hvert dyr i en kolonnegraf, hvor hver prikk representerer antall kroppsbøyninger på 30 sekunder på Y-aksen og de forskjellige forholdene som er testet på X-aksen. Polyglutamin-repetisjonsmodellen har vært medvirkende til identifisering av gener som regulerer det proteostatiske nettverket. Muskelspesifikk polyQ-YFP-uttrykk resulterer i akkumulering av fluorescerende foci som er enkle å kvantifisere under et enkelt fluorescerende dissekeringsmikroskop.Dyrene blir lammet under midtlivet, da proteomet i muskelen kollapser på grunn av reporterens protetotoksiske effekt. Den aldersrelaterte nedgangen i nevronal proteostase kan etterfølges av direkte kvantifisering av aggregert formasjon og nedgang i koordinerte kroppsbøyninger etter å ha plassert dyr i væske. Denne metoden har blitt brukt til å vise at homeo-domenet som samhandler proteinkinase, en transkripsjonell kofaktor, påvirker proteostase under aldring ved å regulere uttrykk for autofagi og molekylære anstander.Tapet av HPK-1 øker antall Q35-YFP-aggregater som akkumuleres under aldring. Kontrolldyr viste i gjennomsnitt 18 aggregater, mens HPK1 null mutant og HPK1 RNAi-behandlede dyr viste et gjennomsnitt på henholdsvis 28 og 26 aggregater. Ved dag åtte av voksen alder ble 77 til 78% av HPK1 mangelfulle dyr lammet, sammenlignet med bare 50% av kontrollen.I tillegg ble overekspressering av HPK1 demonstrert for å regulere proteinaggregatdannelse og beskytte aldrende dyr fra Q35-YFP assosiert lammelse under aldring. Denne metoden måler generell nedgang i proteomet i en celletype. Det finnes mange metoder for å vurdere endringer i spesifikke komponenter i det prostatiske nettverket.Sammen gir de et omfattende bilde. Avtagende proteostase er et kjennetegn på aldring. Denne tilnærmingen gjør det mulig for forskere å kvantifisere denne nedgangen.Når det kombineres med genetisk analyse, er det et kraftig verktøy for oppdagelse.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grunnleggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og observasjon

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Utvinning og analyse i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Tilskudd av flerumettede fettsyrer i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

dyrking av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensjoner i laboratoriet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Kombinert Nucleotide og Protein utdrag i Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Måling av oksygen inntak priser på intakt Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Bruke Caenorhabditis elegans til å screene for vevsspesifikke chaperone interaksjoner

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...