Name: quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-09-07T13:00:00
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Gostaríamos de agradecer aos membros passados e presentes do laboratório Samuelson por sua assistência no refinamento deste método e/ou discussão que auxiliou no desenvolvimento deste manuscrito. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Envelhecimento dos Institutos Nacionais de Saúde sob os Números de Premiação RF1AG062593 e R21AG064519. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou elaboração do manuscrito.

1. Preparação de reagentes
<ol><li>Selecione genes de interesse para serem inativados através de RNAi baseados em alimentação. Comprar ações da HT115 E. coli contendo o clone RNAi de interesse20. Alternativamente, subclone o cDNA do gene de interesse no local multicloning do plasmídeo L4440. NOTA: Para evitar a degradação do dsRNA dentro da bactéria, use a cepa HT115. Esta é uma cepa E. coli deficiente RNase III com atividade de polimerase T7 indutível pelo IPTG...

O envelhecimento é caracterizado por um declínio gradual da proteostase. A proteostase é mantida por um sistema complexo, a rede proteostática, para o controle coordenado, dinâmico e responsivo do estresse do dobrável, degradação e tradução de proteínas. Por que a proteostase falha no curso do envelhecimento é mal compreendida, mas um epigenome em decomposição, a induibilidade em declínio das respostas ao estresse e a perda de conversa cruzada compensatória coincidem com esse colapso. Em C. elegans,</...

A homeostase proteica (proteostase) é definida como a capacidade celular de manter a função adequada e a dobra do proteome. O desafio inerente à proteostase é garantir que todas as proteínas sejam devidamente dobradas e mantidas em uma conformação nativa, que é ainda mais amplificada pela natureza variada do tamanho da proteína, composição de aminoácidos, conformação estrutural, estabilidade, rotatividade, expressão, compartimentação subcelular e modificações1. A proteostase é mantida através da ação coordenada de uma grande rede proteostática, composta por aproximadamente 2000 proteínas únicas, que regulam a síntese adequada, dobramento, tráfico e degradação dentro do proteome2,3. Os componentes do cavalo de trabalho da rede proteostática são nove grandes famílias de acompanhantes moleculares4. Cada tipo de tecido e célula utiliza preferencialmente subconjuntos específicos de acompanhantes moleculares, presumivelmente em alinhamento com as diferentes demandas de proteomes distintos5.
Uma marca registrada do envelhecimento organismo normal é o declínio progressivo e o colapso da proteostase celular, que é considerada uma base subjacente para o início e progressão de um número crescente de doenças associadas à idade. Por exemplo, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, e a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) compartilham uma característica comum: em cada caso, a manifestação da neurodegeneração é impulsionada por alterações genéticas que predispõem uma proteína mutante à agregação (amilóide-β/Tau, α-sinucleína, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1,respectivamente) 6,7,8, 8,9,10 . Durante o envelhecimento, a integridade e induibilidade da rede proteostática diminui, o que resulta no acúmulo de agregados proteotóxicos que resultam em disfunção celular e neurodegeneração. Note-se que as doenças conformais proteicas não são exclusivas dos neurônios, e ocorrem em múltiplos tecidos, como destacado pelo diabetes tipo II, mieloma múltiplo e fibrose cística11,12,13,14. Portanto, a elucidação de mecanismos capazes de preservar a proteostase facilitará o desenvolvimento de intervenções direcionadas para o tratamento da doença e promoverá o envelhecimento saudável.
O pequeno nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) tem sido fundamental na descoberta de genes e caminhos elucidadores que alteram a proteostase. Muitos componentes da rede proteostática e as vias de transdução de sinal que regulam a proteostase são evolutivamente conservados. Além disso, C. elegans reduziu a complexidade e a redundância em relação aos sistemas de vertebrados, tornando-o mais agradável à análise genética e à descoberta genética. Outras vantagens de C. elegans que o levaram a ser amplamente utilizado como um sistema modelo para estudar proteostase incluem: genômica genética e funcional poderosa, um ciclo de vida curto (3 dias) e vida útil (3 semanas), um genoma compacto e bem anotado, a disponibilidade de uma ampla variedade de mutantes genéticos, e a facilidade de visualizar mudanças específicas de tecido na biologia celular usando repórteres fluorescentes.
A decadência progressiva da proteostase durante o envelhecimento pode ser facilmente quantificada em C. elegans. O laboratório de Morimoto demonstrou pela primeira vez que uma expansão de poliglutamina fundida à proteína fluorescente amarela(polyQ::YFP) poderia ser usada para quantificar o declínio proteostático em C. elegans durante o envelhecimento15,16,17,18. As fusões de YFP a 35 repetições de glutamina ou mais resultam em uma formação associada à idade de focos fluorescentes, juntamente com sinais de patologia celular. Note-se que esta gama de expansão da glutamina reflete o comprimento do trato de poliglutamina da proteína Huntingtin na qual a patologia da Doença de Huntington começa a ser observada em humanos (tipicamente >35 CAG repete)19. Cepas com expressão de polq::YFP dentro de células musculares, intestinais ou neuronais têm sido utilizadas para confirmar que o declínio associado à idade da proteostase ocorre em diferentes tipos de células e tecidos. PoliQ específico para músculos::YFP expressão (i.e., unc-54p::Q35::YFP) tem sido o repórter mais amplamente utilizado como tecido específico, pois os focos fluorescentes acumulados são fáceis de quantificar nos primeiros dias da vida adulta usando um simples microscópio de dissecação fluorescente(Figura 1A-1B). Além disso, os animais ficam paralisados durante a meia-idade, pois o proteome dentro do músculo entra em colapso devido ao efeito proteotóxico do repórter(Figura 1C). Da mesma forma, o declínio associado à idade na proteostase neuronal pode ser seguido(rgef-1p::Q40::YFP) quantificando diretamente a formação de focos/agregados e declínios associados à idade em curvas corporais coordenadas após a colocação de animais em líquido(Figura 2).
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado sobre como medir a progressão dependente da idade do acúmulo agregado de proteínas e a proteotoxicidade associada induzida pela expressão de poliglutamina repetida dentro do tecido neuronal e muscular em C. elegans. Fornecemos exemplos de resultados típicos gerados usando essas cepas e métodos. Além disso, mostramos como utilizamos esses métodos para estudar a regulação transcricional da rede proteostática. Discutimos maneiras adicionais de esses repórteres serem facilmente integrados com outros reagentes existentes ou adaptados para telas maiores.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well Culture Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#780286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#786261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin plate replicator</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-permeable plate seal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>Affymetrix/USB</td>
			<td>10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacto-peptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td>
			<td>See also Kamath et. al, Nature 2003.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td>
			<td>See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuDR (5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>160004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, CAS #26628-22-8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans

A capacidade de manter a função adequada e o dobrável do proteome (proteína homeostase) diminui durante o envelhecimento normal, facilitando o aparecimento de um número crescente de doenças associadas à idade. Por exemplo, proteínas com expansões de poliglutamina são propensas à agregação, como exemplificado com a proteína de huntingtina e o aparecimento concomitante da doença de Huntington. A deterioração associada à idade do proteome tem sido amplamente estudada através do uso de caenorhabditis elegans transgênicos expressando repetições de polq fundidas a uma proteína fluorescente amarela (YFP). Este modelo animal transgênico poliQ::YFP facilita a quantificação direta do declínio associado à idade do proteome através da imagem da formação progressiva de focos fluorescentes (ou seja, agregados proteicos) e subsequente aparecimento de defeitos de locomoção que se desenvolvem como resultado do colapso do proteome. Além disso, a expressão do transgênico polyQ::YFP pode ser impulsionada por promotores específicos do tecido, permitindo a avaliação da proteostase entre tecidos no contexto de um organismo multicelular intacto. Este modelo é altamente receptivo à análise genética, proporcionando assim uma abordagem para quantificar o envelhecimento que é complementar aos ensaios de vida útil. Descrevemos como medir com precisão a formação de focos de polq::YFP dentro de neurônios ou músculos da parede corporal durante o envelhecimento, e o subsequente aparecimento de defeitos comportamentais. Em seguida, destacamos como essas abordagens podem ser adaptadas para maior rendimento e potenciais aplicações futuras usando outras estratégias emergentes para a análise genética de C. elegans.

Em C. elegans,o modelo de repetição de poliglutamina tem sido fundamental para a identificação de genes que regulam a rede proteostática. Por exemplo, mostramos anteriormente que a quinase proteica interativa de homeodomina (hpk-1),um cofator transcricional, influencia a proteostase durante o envelhecimento, regulando a expressão da autofagia e dos acompanhantes moleculares31. Descobrimos que a perda de hpk-1, seja por silenciamento RNAi ou em animais mutantes nulo...

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Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

O declínio proteostático é uma marca do envelhecimento, facilitando o aparecimento de doenças neurodegenerativas. Delineamos um protocolo para medir quantificadamente a proteostase em dois tecidos elegans caenorhabditis diferentes através da expressão heteróloga de repetições de poliglutamina fundidas a um repórter fluorescente. Este modelo permite uma rápida análise genética in vivo da proteostase.

Quantificando o declínio proteostático específico do tecido em elegans caenorhabditis

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

O uso de expressão específica do tecido de repórter fluorescente de poliglutamina em C.elegans é significativo porque permite a descoberta e caracterização de reguladores de proteostase no contexto de um organismo multicelular intacto. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a visualização e quantificação do declínio associado à idade na proteostase celular in vivo, o que é essencial para obter uma visão mecanicista mais profunda sobre como os organismos mantêm a dobra adequada e a função do proteome e os efeitos do envelhecimento. Mecanismos elucidantes capazes de preservar a proteostase facilitarão o desenvolvimento de intervenções direcionadas para o tratamento de doenças associadas ao envelhecimento em que a proteostase está comprometida e promoverá o envelhecimento saudável.O colapso da proteostase é um problema clínico massivo, pois está por trás do desenvolvimento de doenças de dobra de proteína, incluindo Alzheimer, Parkinson, doença de Huntington e esclerose lateral amiotrófica. Comece usando placas de Petri de 6 centímetros de diâmetro para preparar cinco placas de ágar para cada condição de teste. Para experimentos com RNAi, induza a produção de dsRNA em HT115 E.coli transformado e use ágar RNAi.Use OP50 E.coli no ágar NGM padrão para experimentos sem RNAi. Cresça as culturas E.coli durante a noite a 37 graus Celsius enquanto treme a 220 RPM. No dia seguinte, pelotar as bactérias por centrifugação a 2.400 G por 15 a 20 minutos, em seguida, aspirar o supernante e suspender novamente a pelota em um décimo do volume inicial de lb.Alíquota de 200 microliters de bactérias concentradas em cada placa e permite que as placas abertas sequem em um ambiente limpo até que todo o líquido tenha sido absorvido. Para sincronizar os C.Elegans com tratamento de hipoclorito, lave hermafroditas áridas duas vezes com tampão M9, depois transfira-os para um tubo fresco e incubar em 5 mililitros de solução hipoclorito por cinco minutos, sacudindo-os a cada minuto. Após a incubação, gire os animais e lave-os três vezes com tampão M9.Permita que os embriões eclodam em tubos durante a noite em 3 mililitros de solução M9 com rotação a 20 graus Celsius. Calcule a densidade de animais L1 soltando 10 microlitadores de solução L1 três vezes em uma placa de 6 centímetros e contando o número de animais L1. Periodicamente, misture as soluções L1 para evitar que os animais se instalem.Semente 50 L1 um animal em cada prato, conte e regise o número semeado, e mova as placas para uma incubadora de 20 graus Celsius. Alternativamente, para sincronizar os animais através de ovo lay, coloque cinco a dez animais adultos jovens e gravid em cada prato por quatro a seis horas e permita que eles coloquem ovos até que haja aproximadamente 50 ovos por prato. Remova todos os adultos gravid e mova as placas com os ovos para uma incubadora de 20 graus Celsius.Cresça os animais até a etapa L4, que levará aproximadamente 40 horas a 20 graus Celsius. Em seguida, adicione 50 microliters de 160 vezes FUDR. Para medir o declínio da proteostase no tecido muscular, escolha 20 animais e monte-os em um slide de microscópio com uma almofada de 3% de agarose e uma queda de 5 microliter de 10 milimilas de azida de sódio.Depois que todos os vermes são imobilizados, imagem de todos os corpos dos animais usando uma lente de ampliação de 10 X. Use um filtro FITC ou YFP e a mesma exposição para cada animal. Quando terminar, descarte os slides.Conte o número de focos nos músculos da parede do corpo de todo o animal. Os focos são sinais pontuados mais brilhantes que podem ser diferenciados do sinal solúvel de dimmer no fundo. Nos dias de pontuação, olhe as placas com os animais e regise o número de animais paralisados, em seguida, remova animais paralisados da placa.Ao final do experimento, calcule a taxa de paralisia de cada condição e plote a progressão da paralisia. Para medir o declínio da proteostase no tecido neuronal, monte os vermes em um slide como descrito anteriormente e leve imagens da cabeça dos animais em um microscópio composto usando uma lente de ampliação de 40 X. Descarte os slides após a imagem.Depois de adquirir as imagens, achate as pilhas Z e use-as para quantificar o número de focos em neurônios localizados na área do anel nervoso. Traçar a progressão do acúmulo de focos YFP dos dias 4, 6, 8 e 10. No segundo dia da vida adulta, escolha 10 animais sincronizados da placa e coloque-os em uma queda de 10 microliter de tampão M9 em um slide de microscópio.Repita esta etapa pelo menos quatro vezes para obter uma amostra de 40 ou mais animais. O vídeo registra o movimento dos animais por um período de 30 segundos em um microscópio estéreo com uma câmera capaz de vídeo. Uma vez que todos os vídeos com os animais a serem analisados são gravados, reprodumente o vídeo e marque as curvas do corpo de cada animal.Plote o número de curvas corporais para cada animal em um gráfico de coluna, onde cada ponto representa o número de curvas do corpo em 30 segundos no eixo Y e as diferentes condições testadas no eixo X. O modelo de repetição de poliglutamina tem sido fundamental para a identificação de genes que regulam a rede proteostática. A expressão poliQ-YFP específica do músculo resulta no acúmulo de focos fluorescentes que são fáceis de quantificar sob um microscópio de dissecação fluorescente simples.Os animais ficam paralisados durante a meia-idade, pois o proteome dentro do músculo entra em colapso devido ao efeito proteotóxico do repórter. O declínio associado à idade na proteostase neuronal pode ser seguido por quantificação direta da formação agregada e declínios em curvas corporais coordenadas após a colocação de animais em líquido. Este método tem sido usado para mostrar que o domínio homeo interagindo proteína quinase, um cofator transcricional, influencia a proteostase durante o envelhecimento, regulando a expressão de autofagia e acompanhantes moleculares.A perda de HPK-1 aumenta o número de agregados Q35-YFP que se acumulam durante o envelhecimento. Os animais de controle apresentaram uma média de 18 agregados, enquanto os animais tratados com HPK1 e HPK1 RNAi apresentaram uma média de 28 e 26 agregados, respectivamente. No oitavo dia da idade adulta, 77 a 78% dos animais deficientes do HPK1 estavam paralisados, em comparação com apenas 50% do controle.Além disso, a superexpressão do HPK1 foi demonstrada para regular a formação de proteínas agregadas e proteger animais envelhecidos da paralisia associada ao Q35-YFP durante o envelhecimento. Este método mede o declínio geral do proteome dentro de um tipo de célula. Existem muitos métodos para avaliar mudanças em componentes específicos da rede prostática.Juntos, eles fornecem uma imagem abrangente. A proteostase em declínio é uma marca do envelhecimento. Essa abordagem permite que os pesquisadores quantifiquem esse declínio.Quando combinado com a análise genética, é uma ferramenta poderosa para a descoberta.

Research

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