Name: quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить бывших и нынешних членов лаборатории Самуэльсона за их помощь в совершенствовании этого метода и / или обсуждении, которое помогло разработке этой рукописи. Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом по проблемам старения Национальных институтов здравоохранения под номерами RF1AG062593 и R21AG064519. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Спонсоры не имели никакого значения в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

1. Подготовка реагентов
<ol><li>Выберите гены, представляющие интерес, для инактивации с помощью РНК-систем на основе питания. Покупайте акции HT115 E. coli, содержащие РНКи-клон интереса20. Альтернативно, субклонирует кДНК интересующего гена в мультиклонитный участок плазмид?...

Старение характеризуется постепенным снижением протеостаза. Протеостаз поддерживается сложной системой, протеостатической сетью, для скоординированного, динамического, стресс-реагирующего контроля сворачивания, деградации и трансляции белка. Почему протеостаз терпит неудачу в про...

Белковый гомеостаз (протеостаз) определяется как клеточная способность поддерживать правильную функцию и сворачивание протеома. Неотъемлемая проблема протеостаза заключается в обеспечении того, чтобы все белки были должным образом свернуты и поддерживались в нативной конформации, которая дополнительно усиливается разнообразной природой размера белка, аминокислотного состава, структурной конформации, стабильности, оборота, экспрессии, субклеточной компартментализации и модификаций1. Протеостаз поддерживается благодаря скоординированному действию большой протеостатической сети, состоящей примерно из 2000 уникальных белков, которые регулируют правильный синтез, сворачивание, торговлю и деградацию в протеоме2,3. Компонентами рабочей лошадки протеостатической сети являются девять основных семейств молекулярных шаперонов4. Каждая ткань и тип клеток преимущественно используют специфические подмножества молекулярных шаперонов, по-видимому, в соответствии с различными требованиями различных протеомов5.
Одним из отличительных признаков нормального старения организма является прогрессирующее снижение и коллапс клеточного протеостаза, который считается основной основой для возникновения и прогрессирования растущего числа возрастных заболеваний. Например, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона и боковой амиотрофический склероз (БАС) имеют общую характеристику: в каждом случае проявление нейродегенерации обусловлено генетическими изменениями, которые предрасполагают мутантный белок к агрегации (амилоид-β/тау, α-синуклеин, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1, соответственно)6,7,8,9,10 . Во время старения целостность и индуцируемость протеостатической сети снижается, что приводит к накоплению протеотоксических агрегатов, что приводит к клеточной дисфункции и нейродегенерации. Следует отметить, что белковые конформационные заболевания не являются уникальными для нейронов и происходят в нескольких тканях, как подчеркивается диабетом II типа, множественной миеломой и муковисцидозом11,12,13,14. Таким образом, выяснение механизмов, способных сохранить протеостаз, будет способствовать разработке целенаправленных вмешательств для лечения заболеваний и содействия здоровому старению.
Маленькая почвенная нематода Caenorhabditis elegans (C. elegans)сыграла важную роль в обнаружении генов и выяснении путей, которые изменяют протеостаз. Многие компоненты протеостатической сети и сигнальные пути трансдукции, которые регулируют протеостаз, эволюционно сохраняются. Кроме того, C. elegans снизил сложность и избыточность по сравнению с системами позвоночных, что делает его более поддается генетическому анализу и открытию генов. Дополнительные преимущества C. elegans, которые привели к его широкому использованию в качестве модельной системы для изучения протеостаза, включают: мощную генетическую и функциональную геномику, короткий жизненный цикл (3 дня) и продолжительность жизни (3 недели), компактный и хорошо аннотированный геном, наличие широкого ассортимента генетических мутантов и простоту визуализации тканеспецифических изменений в клеточной биологии с помощью флуоресцентных репортеров.
Прогрессирующий распад протеостаза во время старения может быть легко количественно определен в C. elegans. Лаборатория Моримото впервые продемонстрировала, что расширение полиглутамина, слитое с желтым флуоресцентным белком(polyQ::YFP),может быть использовано для количественной оценки протеостатического снижения C. elegans во время старения15,16,17,18. Слияние YFP до 35 и более глутаминов приводит к возрастному образованию флуоресцентных очагов наряду с признаками клеточной патологии. Следует отметить, что этот диапазон расширения глютамина отражает длину полиглутаминового тракта белка Гентингтина, при котором патология болезни Гентингтона начинает наблюдаться у людей (обычно >35 ЦАГ-повторов)19. Штаммы с экспрессией polyQ::YFP в мышечных, кишечных или нейрональных клетках были использованы для подтверждения того, что возрастное снижение протеостаза происходит в разных типах клеток и тканей. Мышечно-специфическая экспрессия polyQ::YFP (т.е. unc-54p::Q35::YFP)была наиболее широко используемым тканеспецифическим репортером, поскольку накапливающиеся флуоресцентные очаги легко поддаются количественной оценке в течение первых нескольких дней взрослой жизни с помощью простого флуоресцентного рассекающего микроскопа(рисунок 1A-1B). Кроме того, животные становятся парализованными в середине жизни, так как протеом внутри мышцы разрушается из-за протеотоксического эффекта репортера(рисунок 1C). Аналогичным образом, возрастное снижение нейронального протеостаза можетсопровождаться (rgef-1p::Q40::YFP)путем непосредственной количественной оценки образования очагов/агрегатов и возрастного снижения скоординированных изгибов тела после помещения животных в жидкость(рисунок 2).
Здесь мы представляем подробный протокол о том, как измерить возрастную прогрессию накопления белковых агрегатов и связанную с ней протеотоксичность, индуцированную экспрессией полиглутаминных повторов в нейронной и мышечной ткани у C. elegans. Мы приведем примеры типичных результатов, полученных с использованием этих штаммов и методов. Кроме того, мы показываем, как мы использовали эти методы для изучения транскрипционной регуляции протеостатической сети. Мы обсуждаем дополнительные способы, которыми эти репортеры могут быть легко интегрированы с другими существующими реагентами или адаптированы для больших экранов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well Culture Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#780286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#786261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin plate replicator</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-permeable plate seal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>Affymetrix/USB</td>
			<td>10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacto-peptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td>
			<td>See also Kamath et. al, Nature 2003.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td>
			<td>See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuDR (5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>160004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, CAS #26628-22-8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans

Способность поддерживать правильную функцию и сворачивание протеома (белкового гомеостаза) снижается во время нормального старения, способствуя возникновению растущего числа возрастных заболеваний. Например, белки с полиглутаминными расширениями склонны к агрегации, как по примеру белка гентингтина и сопутствующего начала болезни Гентингтона. Возрастное ухудшение протеома было широко изучено с помощью трансгенных Caenorhabditis elegans, экспрессирующих повторы polyQ, слитые с желтым флуоресцентным белком (YFP). Эта трансгенная модель животных polyQ::YFP облегчает прямую количественную оценку возрастного снижения протеома путем визуализации прогрессирующего образования флуоресцентных очагов (т.е. белковых агрегатов) и последующего возникновения дефектов локомоции, которые развиваются в результате коллапса протеома. Кроме того, экспрессия трансгена polyQ::YFP может управляться тканеспецифическими промодерами, что позволяет оценить протеостаз через ткани в контексте интактного многоклеточного организма. Эта модель очень поддается генетическому анализу, обеспечивая тем самым подход к количественной оценке старения, который дополняет анализы продолжительности жизни. Мы описываем, как точно измерить образование фокусов polyQ::YFP в нейронах или мышцах стенки тела во время старения и последующего возникновения поведенческих дефектов. Далее мы расскажем, как эти подходы могут быть адаптированы для более высокой пропускной способности и потенциальных будущих применений с использованием других новых стратегий генетического анализа C. elegans.

У C. elegansмодель повтора полиглутамина сыграла важную роль в идентификации генов, которые регулируют протеостатическую сеть. Например, ранее мы показали, что гомеодомайн, взаимодействующий с протеинкиназой(hpk-1),транскрипционный кофактор, влияет на протеостаз во время старения,...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Снижение протеостата является отличительной чертой старения, способствуя возникновению нейродегенеративных заболеваний. Мы описываем протокол количественного измерения протеостаза в двух разных тканях Caenorhabditis elegans посредством гетерологичной экспрессии полиглутаминных повторов, слитых с флуоресцентным репортером. Эта модель позволяет проводить экспресс-анализ протеостаза in vivo.

Количественная оценка тканеспецифического снижения протеостатического снижения caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Использование тканеспецифической экспрессии флуоресцентного репортера полиглутамина в C.elegans имеет большое значение, поскольку позволяет обнаружить и охарактеризовать регуляторы протеостаза в контексте интактного многоклеточного организма. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет визуализировать и количественно оценивать возрастное снижение клеточного протеостаза in vivo, что необходимо для получения более глубокого механистического понимания того, как организмы поддерживают правильное сворачивание и функцию протеома и эффекты старения. Выяснение механизмов, способных сохранить протеостаз, будет способствовать разработке целенаправленных вмешательств для лечения заболеваний, связанных со старением, при которых протеостаз скомпрометирован, и для содействия здоровому старению.Коллапс протеостаза является огромной клинической проблемой, поскольку он лежит в основе развития заболеваний, неправильно сворачивающих белок, включая болезнь Альцгеймера, Паркинсона, болезнь Хантингтона и боковой амиотрофический склероз. Начните с использования пластин Петри диаметром 6 сантиметров, чтобы подготовить пять агаровых пластин для каждого условия испытания. Для экспериментов с РНКи индуцируйте продукцию дцРНК в трансформированной HT115 E.coli и используйте РНК-агар.Используйте OP50 E.coli на стандартном агарове NGM для экспериментов без RNAi. Выращивайте культуры E.coli в течение ночи при 37 градусах Цельсия, встряхивая при 220 оборотах в минуту. На следующий день гранулируют бактерии центрифугированием при 2 400 г в течение 15-20 минут, затем аспирируют супернатант и повторно приостанавливают гранулу в одной десятой от начального объема фунта.Aliquot 200 микролитров концентрированных бактерий на каждую пластину и позволяет открытым пластинам высыхать в чистой среде до тех пор, пока вся жидкость не впитается. Чтобы синхронизировать C.Elegans с обработкой гипохлоритом, дважды промыть гравидные гермафродиты буфером М9, затем перенести их в свежую трубку и инкубировать в 5 миллилитрах раствора гипохлорита в течение пяти минут, встряхивая их каждую минуту. После инкубации открутите животных и трижды вымойте их буфером М9.Дайте эмбрионам вылупиться в трубках на ночь в 3 миллилитрах раствора М9 с вращением при 20 градусах Цельсия. Рассчитайте плотность животных L1, опустив 10 микролитров раствора L1 три раза на 6-сантиметровую пластину и подсчитав количество животных L1. Периодически смешивайте растворы L1, чтобы животные не осетели.Посейте 50 L1 одного животных на каждую тарелку, подсчитайте и запишите количество посеянных и переместите пластины в инкубатор с 20 градусами Цельсия. В качестве альтернативы, чтобы синхронизировать животных через яйцекладку, поместите от пяти до десяти молодых, гравидных взрослых животных на каждую тарелку в течение четырех-шести часов и позвольте им отложить яйца, пока на тарелку не будет примерно 50 яиц. Удалите всех взрослых особей и переместите тарелки с яйцами в инкубатор при 20 градусах Цельсия.Выращивайте животных до стадии L4, что займет примерно 40 часов при 20 градусах Цельсия. Затем добавьте 50 микролитров в 160 раз больше FUDR. Чтобы измерить снижение протеостаза в мышечной ткани, выберите 20 животных и установите их на слайд микроскопа с 3% агарозной прокладкой и 5-микролитровой каплей 10-миллимолярного азида натрия.После того, как все черви обездвижены, визуализируем все тела животных с помощью 10-кратной увеличителяемой линзы. Используйте фильтр FITC или YFP и одинаковую экспозицию для каждого животного. По завершении отбросьте слайды.Подсчитайте количество очагов в мышцах стенки тела всего животного. Фокусы представляют собой более яркие прерывистые сигналы, которые можно отличить от более тусклого растворимого сигнала в фоновом режиме. В дни подсчета очков посмотрите на тарелки с животными и запишите количество парализованных животных, а затем извлеките парализованных животных из тарелки.По завершении эксперимента рассчитайте частоту паралича для каждого состояния и постройте график прогрессирования паралича. Чтобы измерить снижение протеостаза в нейронной ткани, установите червей на слайд, как описано ранее, и сделайте Z-образные изображения головы животных на составном микроскопе с использованием линзы с увеличением 40 X. Удалите слайды после создания изображения.После получения изображений сглаживайте Z-стеки и используйте их для количественной оценки количества очагов в нейронах, расположенных на области нервного кольца. График прогрессирования накопления очагов YFP с 4, 6, 8 и 10 дней. На второй день взрослой жизни выберите 10 синхронизированных животных из тарелки и поместите их на 10-микролитровую каплю буфера M9 на слайде микроскопа.Повторите этот шаг по крайней мере четыре раза, чтобы получить образец из 40 или более животных. Видеозапись движения животных в течение 30 секунд на стереомикроскопе с видеокамерой. После того, как все видео с животными, которые будут проанализированы, будут записаны, воспроизвести видео и забить изгибы тела каждого животного.Отрисуйте количество изгибов тела для каждого животного в столбцовом графике, где каждая точка представляет количество изгибов тела за 30 секунд по оси Y и различные условия, протестированные на оси X. Модель повторения полиглутамина сыграла важную роль в идентификации генов, которые регулируют протеостатическую сеть. Мышечно-специфическая экспрессия polyQ-YFP приводит к накоплению флуоресцентных очагов, которые легко поддаются количественной оценке с помощью простого флуоресцентного рассекающего микроскопа.Животные становятся парализованными в среднем возрасте, так как протеом внутри мышцы разрушается из-за протеотоксического эффекта репортера. Возрастное снижение нейронного протеостаза может сопровождаться непосредственной количественной оценкой образования агрегатов и снижения скоординированных изгибов тела после помещения животных в жидкость. Этот метод был использован, чтобы показать, что гомео-домен, взаимодействующий с протеинкиназой, транскрипционным кофактором, влияет на протеостаз во время старения, регулируя экспрессию аутофагии и молекулярных шаперонов.Потеря HPK-1 увеличивает количество агрегатов Q35-YFP, которые накапливаются во время старения. Контрольные животные показали в среднем 18 агрегатов, в то время как животные, обработанные нулевым мутантом HPK1 и HPK1 RNAi, показали в среднем 28 и 26 агрегатов соответственно. К восьмому дню взрослой жизни от 77 до 78% животных с дефицитом HPK1 были парализованы, по сравнению с 50% контрольной группы.Кроме того, было продемонстрировано, что сверхэкспрессия HPK1 регулирует образование белковых агрегатов и защищает стареющих животных от паралича, связанного с Q35-YFP, во время старения. Этот метод измеряет общее снижение протеома в пределах типа клеток. Существует множество методов оценки изменений в конкретных компонентах простатической сети.Вместе они дают всеобъемлющую картину. Снижение протеостаза является отличительной чертой старения. Этот подход позволяет исследователям количественно оценить это снижение.В сочетании с генетическим анализом это мощный инструмент для открытий.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Выделение и В пробирке Активация Caenorhabditis Элеганс Сперма

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Покадровый Микроскопия раннего эмбриогенеза в Caenorhabditis Элеганс

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Основной<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Методы синхронизации и наблюдения

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Добыча простагландинов и анализа в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Диетических добавок полиненасыщенных жирных кислот в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Выращивание<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; В трех измерениях в лаборатории

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Комбинированные нуклеотидов и экстракции белка в Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Измерение коэффициентов потребления кислорода в неповрежденной Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Использование Caenorhabditis elegans для скрининга тканеспецифических взаимодействий шаперонов

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...