Name: quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-09-07T13:00:00
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Nos gustaría agradecer a los miembros pasados y presentes del laboratorio Samuelson por su ayuda en el refinamiento de este método y / o discusión que ayudó al desarrollo de este manuscrito. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio RF1AG062593 y R21AG064519. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

1. Preparación de reactivos
<ol><li>Seleccionar genes de interés para ser inactivados a través de RNAi basado en la alimentación. Comprar existencias de HT115 E. coli que contengan el clon de ARNi de interés20. Alternativamente, subclone el ADNc del gen de interés en el sitio multiclonación del plásmido L4440. NOTA: Para prevenir la degradación de dsRNA dentro de las bacterias, use la cepa HT115. Se trata de una cepa de E. coli deficiente en RNasa III con actividad ...

El envejecimiento se caracteriza por una disminución gradual de la proteostasis. La proteostasis es mantenida por un sistema complejo, la red proteostática, para el control coordinado, dinámico y sensible al estrés del plegamiento, la degradación y la traducción de proteínas. Por qué la proteostasis falla en el curso del envejecimiento es poco conocida, pero un epigenoma en descomposición, la disminución de la inducibilidad de las respuestas al estrés y la pérdida de diafonía compensatoria coinciden con esta...

La homeostasis proteica (proteostasis) se define como la capacidad celular para mantener la función adecuada y el plegamiento del proteoma. El desafío inherente a la proteostasis es garantizar que todas las proteínas se plieguen y mantengan adecuadamente en una conformación nativa, que se amplifica aún más por la naturaleza variada del tamaño de la proteína, la composición de aminoácidos, la conformación estructural, la estabilidad, la renovación, la expresión, la compartimentación subcelular y las modificaciones1. La proteostasis se mantiene a través de la acción coordinada de una gran red proteostática, que consta de aproximadamente 2000 proteínas únicas, que regulan la síntesis adecuada, el plegamiento, el tráfico y la degradación dentro del proteoma2,3. Los componentes del caballo de batalla de la red proteostática son nueve familias principales de chaperonas moleculares4. Cada tejido y tipo de célula utiliza preferentemente subconjuntos específicos de chaperonas moleculares, presumiblemente en alineación con las diferentes demandas de distintos proteomas5.
Un sello distintivo del envejecimiento normal del organismo es la disminución progresiva y el colapso de la proteostasis celular, que se cree que es una base subyacente para la aparición y progresión de un número creciente de enfermedades asociadas a la edad. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) comparten una característica común: en cada caso, la manifestación de la neurodegeneración es impulsada por alteraciones genéticas que predisponen a una proteína mutante a la agregación (amiloide-β / Tau, α-sinucleína, HTT, FUS / TBD-43 / SOD-1, respectivamente)6,7,8,9,10 . Durante el envejecimiento, la integridad y la inducibilidad de la red proteostática disminuyen, lo que resulta en la acumulación de agregados proteotóxicos que resultan en disfunción celular y neurodegeneración. Cabe destacar que las enfermedades conformacionales de proteínas no son exclusivas de las neuronas y ocurren en múltiples tejidos, como lo destacan la diabetes tipo II, el mieloma múltiple y la fibrosis quística11,12,13,14. Por lo tanto, dilucidar mecanismos capaces de preservar la proteostasis facilitará el desarrollo de intervenciones específicas para el tratamiento de la enfermedad y para promover un envejecimiento saludable.
El pequeño nematodo del suelo Caenorhabditis elegans (C. elegans) ha sido fundamental en el descubrimiento de genes y vías de elucidación que alteran la proteostasis. Muchos componentes de la red proteostática y las vías de transducción de señales que regulan la proteostasis se conservan evolutivamente. Además, C. elegans ha reducido la complejidad y la redundancia en relación con los sistemas de vertebrados, lo que lo hace más susceptible al análisis genético y al descubrimiento de genes. Las ventajas adicionales de C. elegans que lo han llevado a ser ampliamente utilizado como un sistema modelo para estudiar la proteostasis incluyen: una poderosa genómica genética y funcional, un ciclo de vida corto (3 días) y una vida útil (3 semanas), un genoma compacto y bien anotado, la disponibilidad de una amplia variedad de mutantes genéticos y la facilidad de visualizar cambios específicos de tejidos en la biología celular utilizando reporteros fluorescentes.
La desintegración progresiva de la proteostasis durante el envejecimiento se puede cuantificar fácilmente en C. elegans. El laboratorio Morimoto demostró por primera vez que una expansión de poliglutamina fusionada con la proteína fluorescente amarilla(polyQ::YFP)podría usarse para cuantificar la disminución proteostática en C. elegans durante el envejecimiento15,16,17,18. Las fusiones de YFP a 35 repeticiones de glutamina o más resultan en una formación asociada a la edad de focos fluorescentes junto con signos de patología celular. Cabe destacar que este rango de expansión de glutamina refleja la longitud del tracto de poliglutamina de la proteína Huntingtina en la que la patología de la enfermedad de Huntington comienza a observarse en humanos (típicamente >35 repeticiones CAG)19. Se han utilizado cepas con expresión de polyQ::YFP dentro de las células musculares, intestinales o neuronales para confirmar que la disminución de la proteostasis asociada a la edad ocurre en diferentes tipos de células y tejidos. La expresión de poliQ::YFP específica del músculo (es decir, unc-54p::Q35::YFP)ha sido el reportero específico de tejido más utilizado, ya que los focos fluorescentes acumulados son fáciles de cuantificar durante los primeros días de la edad adulta utilizando un microscopio de disección fluorescente simple(Figura 1A-1B). Además, los animales se paralizan durante la mediana edad, ya que el proteoma dentro del músculo colapsa debido al efecto proteotóxico del reportero(Figura 1C). Del mismo modo, la disminución asociada a la edad en la proteostasis neuronal puede ser seguida (rgef-1p::Q40::YFP) cuantificando directamente la formación de focos/agregados y las disminuciones asociadas a la edad en las curvas coordinadas del cuerpo después de colocar a los animales en líquido(Figura 2).
Aquí, presentamos un protocolo detallado sobre cómo medir la progresión dependiente de la edad de la acumulación de agregados proteicos y la proteotoxicidad asociada inducida por la expresión de repeticiones de poliglutamina dentro del tejido neuronal y muscular en C. elegans. Proporcionamos ejemplos de resultados típicos generados utilizando estas cepas y métodos. Además, mostramos cómo hemos utilizado estos métodos para estudiar la regulación transcripcional de la red proteostática. Discutimos formas adicionales en que estos reporteros pueden integrarse fácilmente con otros reactivos existentes o adaptarse para pantallas más grandes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well Culture Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#780286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#786261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin plate replicator</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-permeable plate seal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>Affymetrix/USB</td>
			<td>10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacto-peptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td>
			<td>See also Kamath et. al, Nature 2003.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td>
			<td>See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuDR (5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>160004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, CAS #26628-22-8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans

La capacidad de mantener la función adecuada y el plegamiento del proteoma (homeostasis de proteínas) disminuye durante el envejecimiento normal, lo que facilita la aparición de un número creciente de enfermedades asociadas a la edad. Por ejemplo, las proteínas con expansiones de poliglutamina son propensas a la agregación, como se ejemplifica con la proteína huntingtina y la aparición concomitante de la enfermedad de Huntington. El deterioro del proteoma asociado a la edad ha sido ampliamente estudiado mediante el uso de Caenorhabditis elegans transgénicos que expresan repeticiones poliQ fusionadas a una proteína fluorescente amarilla (YFP). Este modelo animal transgénico polyQ::YFP facilita la cuantificación directa de la disminución asociada a la edad del proteoma a través de imágenes de la formación progresiva de focos fluorescentes (es decir, agregados de proteínas) y la posterior aparición de defectos de locomoción que se desarrollan como resultado del colapso del proteoma. Además, la expresión del transgén polyQ::YFP puede ser impulsada por promotores específicos del tejido, lo que permite la evaluación de la proteostasis a través de los tejidos en el contexto de un organismo multicelular intacto. Este modelo es altamente susceptible de análisis genético, proporcionando así un enfoque para cuantificar el envejecimiento que es complementario a los ensayos de vida útil. Describimos cómo medir con precisión la formación de focos poliQ::YFP dentro de las neuronas o el músculo de la pared corporal durante el envejecimiento, y la posterior aparición de defectos de comportamiento. A continuación, destacamos cómo estos enfoques se pueden adaptar para un mayor rendimiento y posibles aplicaciones futuras utilizando otras estrategias emergentes para el análisis genético de C. elegans.

En C. elegans,el modelo de repetición de poliglutamina ha sido fundamental para la identificación de genes que regulan la red proteostática. Por ejemplo, anteriormente demostramos que la proteína quinasa que interactúa con el homeodominio(hpk-1),un cofactor transcripcional, influye en la proteostasis durante el envejecimiento al regular la expresión de la autofagia y las chaperonas moleculares31. Encontramos que la pérdida de hpk-1,ya sea por silenciamiento de ARN...

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Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

El deterioro proteostático es un sello distintivo del envejecimiento, que facilita la aparición de enfermedades neurodegenerativas. Esbozamos un protocolo para medir cuantificablemente la proteostasis en dos tejidos diferentes de Caenorhabditis elegans a través de la expresión heteróloga de repeticiones de poliglutamina fusionadas a un reportero fluorescente. Este modelo permite un rápido análisis genético in vivo de la proteostasis.

Cuantificación de la disminución proteostática específica del tejido en Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

El uso de la expresión tisular específica del reportero fluorescente de poliglutamina en C.elegans es significativo porque permite el descubrimiento y la caracterización de reguladores de la proteostasis en el contexto de un organismo multicelular intacto. La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización y cuantificación de la disminución asociada a la edad en la proteostasis celular in vivo, lo cual es esencial para obtener una visión mecanicista más profunda de cómo los organismos mantienen el plegamiento y la función adecuados del proteoma y los efectos del envejecimiento. Elucidar mecanismos capaces de preservar la proteostasis facilitará el desarrollo de intervenciones dirigidas para el tratamiento de enfermedades asociadas al envejecimiento en las que la proteostasis está comprometida y para promover un envejecimiento saludable.El colapso de la proteostasis es un problema clínico masivo, ya que subyace al desarrollo de enfermedades de plegamiento erróneo de proteínas, como el Alzheimer, el Parkinson, la enfermedad de Huntington y la esclerosis lateral amiotrófica. Comience usando placas de Petri de 6 centímetros de diámetro para preparar cinco placas de agar para cada condición de prueba. Para experimentos con RNAi, inducir la producción de dsRNA en HT115 E. coli transformada y usar agar RNAi.Utilice OP50 E.coli en el agar NGM estándar para experimentos sin ARNi. Cultive los cultivos de E. coli durante la noche a 37 grados Celsius mientras tiembla a 220 RPM. Al día siguiente, peletizar las bacterias por centrifugación a 2, 400 G durante 15 a 20 minutos, luego aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en una décima parte del volumen inicial de lb.Alícuota 200 microlitros de bacterias concentradas en cada placa y permita que las placas abiertas se sequen en un ambiente limpio hasta que todo el líquido haya sido absorbido. Para sincronizar los C.Elegans con el tratamiento con hipoclorito, lave los hermafroditas grávidos dos veces con tampón M9, luego transfiéralos a un tubo fresco e incube en 5 mililitros de solución de hipoclorito durante cinco minutos, sacudiéndolos cada minuto. Después de la incubación, gire hacia abajo a los animales y lávelos tres veces con el tampón M9.Permita que los embriones eclosionen en tubos durante la noche en 3 mililitros de solución M9 con rotación a 20 grados centígrados. Calcule la densidad de los animales L1 dejando caer 10 microlitros de solución L1 tres veces sobre una placa de 6 centímetros y contando el número de animales L1. Periódicamente, mezcle las soluciones L1 para evitar que los animales se asienten.Sembr 50 L1 un animal en cada placa, contar y registrar el número de semillas, y mover las placas a una incubadora de 20 grados Centígrados. Alternativamente, para sincronizar a los animales a través de la puesta de huevos, coloque de cinco a diez animales adultos jóvenes y grávidos en cada plato durante cuatro a seis horas y permítales poner huevos hasta que haya aproximadamente 50 huevos por plato. Retire todos los adultos grávidos y mueva las placas con los huevos a una incubadora de 20 grados centígrados.Cultive los animales hasta la etapa L4, que tomará aproximadamente 40 horas a 20 grados centígrados. Luego agregue 50 microlitros de 160 veces FUDR. Para medir la disminución de la proteostasis en el tejido muscular, elija 20 animales y móntelos en un portaobjetos de microscopio con una almohadilla de agarosa al 3% y una gota de 5 microlitros de azida de sodio de 10 milimolares.Después de que todos los gusanos estén inmovilizados, imagine todo el cuerpo de los animales usando una lente de aumento de 10 X. Use un filtro FITC o YFP y la misma exposición para cada animal. Cuando haya terminado, deseche las diapositivas.Cuente el número de focos en los músculos de la pared del cuerpo de todo el animal. Los focos son señales puntuadas más brillantes que se pueden diferenciar de la señal soluble de atenuación en el fondo. En los días de puntuación, mire las placas con los animales y registre el número de animales paralizados, luego retire los animales paralizados de la placa.Al finalizar el experimento, calcule la tasa de parálisis para cada afección y trace la progresión de la parálisis. Para medir la disminución de la proteostasis en el tejido neuronal, monte los gusanos en una diapositiva como se describió anteriormente y tome imágenes de la pila Z de la cabeza de los animales en un microscopio compuesto utilizando una lente de aumento de 40 X. Deseche las diapositivas después de la obtención de imágenes.Después de adquirir las imágenes, aplana las pilas Z y utilíceslas para cuantificar el número de focos en las neuronas ubicadas en el área del anillo nervioso. Trazar la progresión de la acumulación de focos de YFP desde los días 4, 6, 8 y 10. En el segundo día de la edad adulta, recoja 10 animales sincronizados de la placa y colóquelos en una gota de 10 microlitros de tampón M9 en un portaobjetos de microscopio.Repita este paso al menos cuatro veces para obtener una muestra de 40 o más animales. Grabe en video el movimiento de los animales durante un período de 30 segundos en un microscopio estéreo con una cámara con capacidad de video. Una vez grabados todos los vídeos con los animales a analizar, reproduce el vídeo y puntúa las curvas corporales de cada animal.Traza el número de curvas del cuerpo para cada animal en un gráfico de columnas, donde cada punto representa el número de curvas del cuerpo en 30 segundos en el eje Y y las diferentes condiciones probadas en el eje X. El modelo de repetición de poliglutamina ha sido fundamental para la identificación de genes que regulan la red proteostática. La expresión de poliQ-YFP específica del músculo da como resultado la acumulación de focos fluorescentes que son fáciles de cuantificar bajo un microscopio de disección fluorescente simple.Los animales se paralizan durante la mediana edad, ya que el proteoma dentro del músculo colapsa debido al efecto proteotóxico del reportero. La disminución asociada a la edad en la proteostasis neuronal puede ser seguida por la cuantificación directa de la formación de agregados y la disminución en las curvas coordinadas del cuerpo después de colocar a los animales en líquido. Este método se ha utilizado para demostrar que la proteína quinasa que interactúa con el dominio homeo, un cofactor transcripcional, influye en la proteostasis durante el envejecimiento mediante la regulación de la expresión de la autofagia y las chaperonas moleculares.La pérdida de HPK-1 aumenta el número de agregados Q35-YFP que se acumulan durante el envejecimiento. Los animales de control mostraron un promedio de 18 agregados, mientras que los animales tratados con hpk1 null mutant y HPK1 RNAi mostraron un promedio de 28 y 26 agregados, respectivamente. Para el octavo día de la edad adulta, del 77 al 78% de los animales deficientes en HPK1 estaban paralizados, en comparación con solo el 50% del control.Además, se demostró que la sobreexpresión de HPK1 regula la formación de agregados de proteínas y protege a los animales envejecidos de la parálisis asociada a Q35-YFP durante el envejecimiento. Este método mide la disminución general del proteoma dentro de un tipo de célula. Existen muchos métodos para evaluar los cambios en componentes específicos de la red prostática.Juntos, proporcionan una imagen completa. La disminución de la proteostasis es un sello distintivo del envejecimiento. Este enfoque permite a los investigadores cuantificar esta disminución.Cuando se combina con el análisis genético, es una herramienta poderosa para el descubrimiento.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

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El aislamiento y la In vitro La activación de Caenorhabditis elegans El esperma

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