Name: quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2021-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Vi vill tacka tidigare och nuvarande medlemmar av Samuelsonlaboratoriet för deras hjälp med att förfina denna metod och/eller diskussion som hjälpte till att utveckla detta manuskript. Forskning som rapporterades i denna publikation stöddes av National Institute on Aging of the National Institutes of Health under Award Numbers RF1AG062593 och R21AG064519. Innehållet är endast författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förbereda manuskriptet.

1. Beredning av reagenser
<ol><li>Välj gener av intresse som ska inaktiveras via utfodringsbaserad RNAi. Köp lager av HT115 E. coli som innehåller RNAi klon av intresse20. Alternativt, subklon cDNA av genen av intresse i multikloning platsen för L4440 plasmid. OBS: Använd HT115-stammen för att förhindra nedbrytning av dsRNA i bakterierna. Detta är en RNase III-bristfällig E. coli stam med IPTG-inducible T7 polymeras aktivitet. För proteostasstudier som inte använd...

Åldrande kännetecknas av en gradvis nedgång i proteostas. Proteostas upprätthålls av ett komplext system, det proteostatiska nätverket, för samordnad, dynamisk, stressresponsiv kontroll av proteinvikning, nedbrytning och översättning. Varför proteostas misslyckas under åldrandet är dåligt förstådd, men ett förfallet epigenom, minskande induktens av stressreaktioner och förlust av kompensatorisk korsstjäl sammanfaller alla med denna uppdelning. I C. elegans minskar transkriptionsinduktensen för...

Proteinhomeostas (proteostas) definieras som cellulär förmåga att upprätthålla korrekt funktion och vikning av proteomet. Den inneboende utmaningen för proteostas är att se till att alla proteiner viks och underhålls ordentligt i en inhemsk konformation, vilket förstärks ytterligare av den varierade karaktären av proteinstorlek, aminosyrakomposition, strukturell konformation, stabilitet, omsättning, uttryck, subcellulär uppdelning och modifieringar1. Proteostas upprätthålls genom samordnad verkan av ett stort proteostiskt nätverk, bestående av cirka 2000 unika proteiner, som reglerar korrekt syntes, vikning, handel och nedbrytning inom proteom2,3. Arbetshästkomponenterna i det proteostiska nätverket är nio stora familjer av molekylära förkläden4. Varje vävnad och celltyp använder företrädesvis specifika undergrupper av molekylära förkläden, förmodligen i linje med de olika kraven på distinkta proteomer5.
Ett kännetecken för normala organismal åldrande är den progressiva nedgången och kollapsen av cellulära proteostas, som tros vara en underliggande grund för uppkomsten och progressionen av ett växande antal åldersrelaterade sjukdomar. Till exempel har Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, Huntingtons sjukdom och amyotrofisk lateral skleros (ALS) en gemensam egenskap: i varje enskilt fall är manifestation av neurodegeneration driven av genetiska förändringar som predisponerar ett mutantt protein för aggregering (amyloid-β/Tau, α-synuklein, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1, respektive)6,7,8,9,1 . Under åldrandet minskar integriteten och induktiliteten hos det proteostatiska nätverket, vilket resulterar i ackumulering av proteotoxiska aggregat som resulterar i cellulär dysfunktion och neurodegeneration. Observera att proteinkonformationella sjukdomar inte är unika för nervceller och förekommer över flera vävnader, vilket markeras av typ II-diabetes, multipelt myelom och cystisk fibros11,12,13,14. Därför kommer klargörande mekanismer som kan bevara proteostas att underlätta utvecklingen av riktade interventioner för behandling av sjukdom och för att främja hälsosamt åldrande.
Den lilla jordnematoden Caenorhabditis elegans (C. elegans) har varit avgörande för att upptäcka gener och klargörande vägar som förändrar proteostas. Många komponenter i det proteostatiska nätverket och signaltransduktionsvägarna som reglerar proteostas bevaras evolutionärt. Dessutom har C. elegans minskat komplexiteten och redundansen i förhållande till ryggradsdjurssystem, vilket gör det mer mottagligt för genetisk analys och genupptäckt. Ytterligare fördelar med C. elegans som har lett till att det används i stor utsträckning som ett modellsystem för att studera proteostas inkluderar: kraftfull genetisk och funktionell genomik, en kort livscykel (3 dagar) och livslängd (3 veckor), ett kompakt och väl kommenterat genom, tillgången till ett brett sortiment av genetiska mutanter och hur lätt det är att visualisera vävnadsspecifika förändringar i cellbiologi med hjälp av fluorescerande reportrar.
Det progressiva sönderfallet av proteostas under åldrandet kan lätt kvantifieras i C. elegans. Morimoto-laboratoriet visade först att en polyglutaminexpansion smält till gult fluorescerande protein(polyQ::YFP)kunde användas för att kvantifiera proteostatisk nedgång i C. elegans under åldrande15,16,17,18. YFP fusioner till 35 glutamin upprepas eller mer resulterar i en åldersrelaterad bildning av fluorescerande högborgar tillsammans med tecken på cellulär patologi. Observera att detta intervall av glutaminexpansion speglar längden på polyglutaminkanalen i Huntingtin-proteinet där Huntingtons sjukdom patologi börjar observeras hos människor (vanligtvis >35 CAG upprepas)19. Stammar med uttryck för polyQ::YFP inom muskel-, tarm- eller neuronala celler har använts för att bekräfta att den åldersrelaterade minskningen av proteostas förekommer över olika cell- och vävnadstyper. Muskelspecifik polyQ::YFP-uttryck (dvs. unc-54p::Q35::YFP)har varit den mest använda vävnadsspecifika reportern, eftersom det är lätt att kvantifiera fluorescerande högborgar under de första dagarna av vuxenlivet med hjälp av ett enkelt fluorescerande dissekerande mikroskop (figur 1A-1B). Dessutom blir djur förlamade under mitten av livet, eftersom proteomet i muskeln kollapsar på grund av reporterns proteotoxiska effekt (figur 1C). På samma sätt kan den åldersrelaterade minskningen av neuronal proteostas följas (rgef-1p::Q40::YFP) genom att direkt kvantifiera foci/ aggregerad bildning och åldersrelaterade minskningar i samordnade kroppsböjningar efter att ha placerat djur i vätska(figur 2).
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll om hur man mäter den åldersberoende progressionen av proteinaggregat ackumulering och den associerade proteotoxicitet som framkallas av uttrycket av polyglutaminrepetitioner inom neuronal och muskelvävnad i C. elegans. Vi ger exempel på typiska resultat som genereras med hjälp av dessa stammar och metoder. Vidare visar vi hur vi har använt dessa metoder för att studera transkriptionell reglering av det proteostiska nätverket. Vi diskuterar ytterligare sätt som dessa reportrar enkelt kan integreras med andra befintliga reagenser eller anpassas för större skärmar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well Culture Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#662102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#780286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L 96-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#786261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-pin plate replicator</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>250520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-permeable plate seal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>Affymetrix/USB</td>
			<td>10906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacto-peptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90000-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td>
			<td>See also Kamath et. al, Nature 2003.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal</td>
			<td>Source Bioscience</td>
			<td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td>
			<td>See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FuDR (5-Fluoro-2&#39;-deoxyuridine)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L16497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>160004-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>12481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide, CAS #26628-22-8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>unknown</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying tissue-specific proteostatic decline in caenorhabditis elegans

Förmågan att upprätthålla korrekt funktion och vikning av proteom (proteinhomeostas) minskar under normalt åldrande, vilket underlättar uppkomsten av ett växande antal åldersrelaterade sjukdomar. Till exempel är proteiner med polyglutaminexpansioner benägna att aggregeras, vilket exemplifieras med huntingtinproteinet och samtidig uppkomsten av Huntingtons sjukdom. Den åldersrelaterade försämringen av proteomet har studerats allmänt genom användning av transgen Caenorhabditis elegans uttrycker polyQ repetitioner smält till ett gult fluorescerande protein (YFP). Denna polyQ::YFP transgena djurmodell underlättar direkt kvantifiering av proteomets åldersrelaterade nedgång genom att avbilda den progressiva bildandet av fluorescerande foci (dvs. proteinaggregat) och efterföljande uppkomst av rörelsefel som utvecklas som ett resultat av proteomets kollaps. Vidare kan uttrycket av polyQ::YFP transgene drivas av vävnadsspecifika promotorer, vilket möjliggör bedömning av proteostas över vävnader i samband med en intakt multicellulär organism. Denna modell är mycket mottaglig för genetisk analys, vilket ger ett tillvägagångssätt för att kvantifiera åldrande som kompletterar livslängdsanalyser. Vi beskriver hur man korrekt mäta polyQ::YFP foci bildas inom antingen nervceller eller kroppsvägg muskel under åldrande, och efterföljande uppkomsten av beteendemässiga defekter. Därefter belyser vi hur dessa metoder kan anpassas för högre genomströmning och potentiella framtida tillämpningar med andra framväxande strategier för C. elegans genetisk analys.

I C. eleganshar polyglutaminrepetitionsmodellen varit avgörande för identifiering av gener som reglerar det proteostiska nätverket. Till exempel visade vi tidigare att homeodomain interagerar proteinkinas (hpk-1), en transkriptionell kofaktor, påverkar proteostas under åldrande genom att reglera uttryck för autofagi och molekylära förkläden31. Vi fann att förlust av hpk-1, antingen genom RNAi-ljuddämpning eller i hpk-1 (pk1393) null mutanta djur, öka...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatisk nedgång är ett kännetecken för åldrande, vilket underlättar uppkomsten av neurodegenerativa sjukdomar. Vi skissera ett protokoll för att kvantifiera proteostas i två olika Caenorhabditis elegans vävnader genom heterologous uttryck av polyglutamin repetitioner smält till en fluorescerande reporter. Denna modell möjliggör snabb in vivo genetisk analys av proteostas.

Kvantifiering av vävnadsspecifik proteostatisk nedgång i caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Användningen av vävnad-specifika uttryck av polyglutamin fluorescerande reporter i C.elegans är betydande eftersom det tillåter upptäckt och karakterisering av proteostas regulatorer i samband med en intakt multicellulär organism. Den största fördelen med denna teknik är att den möjliggör visualisering och kvantifiering av den åldersrelaterade nedgången i cellulär proteostas in vivo, vilket är viktigt för att få djupare mekanistisk insikt i hur organismer upprätthåller korrekt vikning och funktion av proteomet och effekterna av åldrande. Klargörande mekanismer som kan bevara proteostas kommer att underlätta utvecklingen av riktade insatser för behandling av åldrande associerade sjukdomar där proteostas äventyras och för att främja ett hälsosamt åldrande.Proteostas kollaps är ett massivt klinikproblem, eftersom det ligger till grund för utvecklingen av proteinfelveckande sjukdomar, inklusive Alzheimers, Parkinsons, Huntingtons sjukdom och amyotrofisk lateral skleros. Börja med att använda Petriplattor med diametern 6 centimeter för att förbereda fem agarplattor för varje testtillstånd. För experiment med RNAi, inducera dsRNA-produktion i transformerad HT115 E.coli och använd RNAi agar.Använd OP50 E.coli på standard NGM-agar för experiment utan RNAi. Odla E.coli-kulturerna över natten vid 37 grader Celsius medan du skakar vid 220 RPM. Nästa dag, pellet bakterierna genom centrifugering vid 2 400 G i 15 till 20 minuter, aspirera sedan supernatanten och suspendera pelleten i en tiondel av startvolymen av lb.Aliquot 200 mikroliter av koncentrerade bakterier till varje tallrik och låt de öppna plattorna torka i en ren miljö tills all vätska har absorberats. För att synkronisera C.Elegans med hypokloritbehandling, tvätta gravid hermafroditer två gånger med M9-buffert, överför dem sedan till ett nytt rör och inkubera i 5 milliliter hypokloritlösning i fem minuter och skaka dem varje minut. Efter inkubationen, snurra ner djuren och tvätta dem tre gånger med M9-buffert.Låt embryon kläckas i rör över natten i 3 milliliter M9-lösning med rotation vid 20 grader Celsius. Beräkna tätheten hos L1-djur genom att släppa 10 mikroliter L1-lösning tre gånger på en 6 centimeters tallrik och räkna antalet L1-djur. Blanda regelbundet L1-lösningarna för att förhindra att djuren sätter sig.Frö 50 L1 ett djur på varje tallrik, räkna och registrera antalet sådda och flytta plattorna till en 20 grader Celsius inkubator. Alternativt, för att synkronisera djur via äggläggning, placera fem till tio unga, gravida vuxna djur på varje tallrik i fyra till sex timmar och låt dem lägga ägg tills det finns cirka 50 ägg per tallrik. Ta bort alla gravida vuxna och flytta plattorna med äggen till en 20 grader Celsius inkubator.Odla djuren till L4-scenen, vilket tar cirka 40 timmar vid 20 grader Celsius. Tillsätt sedan 50 mikroliter på 160 gånger FUDR. För att mäta nedgången i proteostas i muskelvävnad, välj 20 djur och montera dem på en mikroskopbild med en 3% agarose pad och en 5 mikroliter droppe av 10 millimolar natrium azid.När alla maskar är immobiliserade, föreställ hela djurens kroppar med en 10 X förstoringslins. Använd ett FITC- eller YFP-filter och samma exponering för varje djur. När bilderna är klara ignoreras bilderna.Räkna antalet högborgar i hela djurets kroppsväggsmuskler. Foci är ljusare punkterade signaler som kan skiljas från dimmerlöslig signal i bakgrunden. På poängdagar, titta på plattorna med djuren och registrera antalet förlamade djur och ta sedan bort förlamade djur från plattan.Vid slutförandet av experimentet beräknar du förlamningshastigheten för varje tillstånd och plottar förlamningsprogressionen. För att mäta nedgången i proteostas i neuronal vävnad, montera maskarna på en bild som tidigare beskrivits och ta Z stack bilder av djurens huvud på ett sammansatt mikroskop med hjälp av en 40 X förstoringslins. Ignorera bilderna efter avbildning.Efter att ha förvärvat bilderna, platta Z-staplarna och använd dem för att kvantifiera antalet högborgar i nervceller som ligger på nervringområdet. Plotta utvecklingen av YFP-foci ackumulering från dag 4, 6, 8 och 10. På dag två av vuxen ålder, plocka 10 synkroniserade djur från plattan och placera dem på en 10 mikroliter droppe M9-buffert på en mikroskopbild.Upprepa detta steg minst fyra gånger för att få ett prov på 40 eller fler djur. Video spelar in djurens rörelse under en period av 30 sekunder på ett stereomikroskop med en videokompatibla kamera. När alla videor med djuren som ska analyseras spelas in, spela videon och poängsätta kroppsböjningarna hos varje djur.Rita upp antalet kroppsböjningar för varje djur i ett kolumndiagram, där varje punkt representerar antalet kroppsböjningar på 30 sekunder på Y-axeln och de olika förhållanden som testas på X-axeln. Polyglutamin upprepa modellen har varit avgörande för identifiering av gener som reglerar det proteostiska nätverket. Muskelspecifik polyQ-YFP uttryck resulterar i ackumulering av fluorescerande högborgar som är lätta att kvantifiera under ett enkelt fluorescerande dissekerande mikroskop.Djuren blir förlamade under medelåldern, eftersom proteomet i muskeln kollapsar på grund av reporterns proteotoxiska effekt. Den åldersrelaterade nedgången i neuronal proteostas kan följas av direkt kvantifiering av aggregerad bildning och minskningar i samordnade kroppsböjningar efter att ha placerat djur i vätska. Denna metod har använts för att visa att homeo domänen interagerar proteinkinas, en transkriptionell kofaktor, påverkar proteostas under åldrande genom att reglera uttryck av autofagi och molekylära förkläden.Förlusten av HPK-1 ökar antalet Q35-YFP-aggregat som ackumuleras under åldrandet. Kontrolldjur uppvisade i genomsnitt 18 aggregat, medan de behandlade djuren HPK1 null och HPK1 RNAi uppvisade i genomsnitt 28 respektive 26 aggregat. Dag åtta i vuxen ålder var 77 till 78% av HPK1 bristfälliga djur förlamade, jämfört med endast 50% av kontrollen.Dessutom visades överuttryck av HPK1 att reglera protein aggregerad bildandet och skydda åldrande djur från Q35-YFP tillhörande förlamning under åldrande. Denna metod mäter allmän nedgång av proteomet inom en celltyp. Det finns många metoder för att bedöma förändringar i specifika komponenter i det prostatiska nätverket.Tillsammans ger de en heltäckande bild. Minskande proteostas är ett kännetecken för åldrande. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för forskare att kvantifiera denna nedgång.I kombination med genetisk analys är det ett kraftfullt verktyg för upptäckt.

Research

JoVE Journal

Biology

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolering och In vitro Aktivering av Caenorhabditis elegans Spermier

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-baserade dietrestriktioner i Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Mikroskopi av tidig embryogenesen i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basisk<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering och miljöövervakning

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraktion och analys i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Kosttillskott av fleromättade fettsyror i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

odling av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensioner i laboratoriet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Kombinerade nukleotid och Protein extraktioner i Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mätning av syre förbrukning i intakt Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Använda Caenorhabditis elegans för att screena för vävnadsspecifika förkläde interaktioner

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...