Name: high-throughput method for measuring alcohol sedation time of individual drosophila melanogaster
Uploaded: 2020-04-20T13:00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud DA041613 og GM128974 fra National Institutes of Health til TFCM og RRHA.

1. Konstruktion af prøveapparaturet
<ol><li>Opret en papskabelon på størrelse med en 24-brønds cellekulturplade ved at spore rundt om pladen på pap og skære det udpegede område ud.</li>
	<li>Skær et stykke lille insektskærm mesh størrelsen af cellekulturpladen ved hjælp af papskabelonen fra trin 1.1.</li>
	<li>Forbered en 24-brønd celle kultur plade ved at placere en lille linje af varm lim omkring kanten af toppen af pladen ved hjælp af en varm lim pistol og anbringelse skærmen mesh på toppen af de åbne brønde.</li>
	<li>Fastgør et træhåndværk, der klæber til hver af tre sider af den samme cellekulturplade fra trin 1.3 ved hjælp af en varm limpistol. Den modificerede cellekulturplade skal nu ligne det pladediagram, der er vist i figur 1A, og den eksperimentelle opsætning vist i figur 2. BEMÆRK: Forbered mindst lige så mange cellekulturplader, som der er plads til i filmkamrene (se nedenfor).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61108/61108fig1.jpg"> Figur 1: Diagram over testapparatet og filmkammeret. (A) Øvre diagrammer. Henholdsvis testapparatets over- og sidevisning vises. En skærm mesh lægger fladt på toppen af en 24-brønd celle kultur plade. Træhåndværksstavene, repræsenteret ved pilespidserne, er fastgjort til tre tilstødende sider for stabilitet og justering støtte, to på siden af brøndpladen med seks brønde og en på siden af pladen med fire brønde. Alle tilbehør er varmt limet på apparatet. (B) Lavere diagrammer. Den øverste, side, og front visninger af analysen set-up er vist, henholdsvis. En slids skæres i højre side af kassen, fra åbningen for låget til bagsiden af åbningen, med bunden af slidsen niveau til den indre overflade. Hullet på toppen af kassen, overfladen parallelt med jorden, er centreret for maksimal videoeksponering. Den nedtonede boks repræsenterer videokameraet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61108/61108fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61108/61108fig2.jpg"> Figur 2: Fotografi af analysesystemet. Videokameraet er placeret oven på polystyrenkammeret, med linsen indsat i cut-out hul, illustreret i diagrammerne af figur 1B. To sæt modificerede 24-brøndcellekulturplader hviler oven på en belysningspude, der indsættes i en slids gennem siden af kammeret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61108/61108fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
2. Opførelse af filmkammeret
<ol><li>Opret et filmkammer ved at skære et hul på størrelse med videokameralinsen på siden af en polystyrenkasse. Skær en ekstra slids bredden af belysningpad i den modsatte side af polystyren boksen. Filmkammeret skal ligne det filmkammer, der er vist i figur 1B og figur 2.</li>
	<li>Gør filmkammeret klar til brug ved at sætte belysningspuden i slidsen og placere kameraet i linsehullet over belysningspuden.</li>
	<li>Placer alle materialer og udfør alle efterfølgende test i et kontrolleret miljø, helst et adfærdskammer med ca. 30% fugtighed, 25 °C temperatur, ensartet luftstrøm og støjniveauer under 65 dB.</li>
</ol>3. Fremstilling af prøveapparaturet og -fluer
<ol><li>Pipette 1 ml 100% ethanol gennem skærmen mesh i hver brønd.</li>
	<li>Tør skærmen mesh med et stykke ostelærred.</li>
	<li>Skær to stykker ostelærred dimensionerne af cellekulturpladen ved hjælp af papskabelonen, der blev skabt i trin 1.1. De anbringes oven på det tørre skærmnet på den modificerede cellekulturplade, der indeholder ethanol, fra trin 3.2.</li>
	<li>Opret et lille stykke tyndt, fleksibelt plastskærebræt ved at spore rundt om papskabelonen, der blev skabt i trin 1.1 som en generel vejledning og udvide det sporede område med 1-2 cm på en af de korte sider. Skær det udvidede sporede område ud fra det tynde, fleksible plastskærebræt. Efter skæring skal du sørge for, at plasten stadig passer mellem de tre træhåndværkspinde på testapparatet, men hænger den ene ende af med 1-2 cm.</li>
	<li>(Valgfrit) Hvis der skal oprettes en aspirator, skal der samles en aspirator som den, der er vist i figur 3, ved først at skære en P1000 pipettespids i halve. Indsæt stykket med en større diameter i den ene ende af en ~ 30 cm stykke fleksibel slange til at tjene som et mundstykke.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61108/61108fig3.jpg"> Figur 3: En flueaspirator, hvor fluer opsamles med et udskifteligt mundstykke fastgjort til fleksible slanger og en bred bar serologisk pipette med en bomuldsgazeprop. Operatøren kan aspirere en enkelt flue ind i pipetten til overførsel uden anæstesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61108/61108fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<ol start="6"><li>(Valgfrit) For at fuldføre aspirator samling, dække den brede ende af en 10 cm stykke serologisk pipette med gaze for at forhindre fluer i at komme ind i slangen og indsætte pipette, gaze først, i den åbne ende af slangen til at tjene som en flue kammer. Aspireren skal ligne den, der er vist i figur 3.</li>
	<li>Ved hjælp af en aspirator (Figur 3, trin 3,5 og 3,6), aspirerer en flue pr. brønd i en separat cellekulturplade med 24 brønde. Brug den fleksible plast til at dække brønde, der indeholder tidligere indsugningsfluer. Optag brøndpositionen og eventuelle relevante genotype- eller fænotypeoplysninger for hver flue.</li>
	<li>Hold den fleksible plast flugt med toppen af cellekulturpladen, der indeholder fluerne for at forhindre deres flugt og vende pladen på toppen af den modificerede cellekulturplade med ethanol. Arket af fleksibel plast skal hvile oven på pladerne af ostelærred. Juster den omvendte cellekulturplade, der indeholder fluer ved hjælp af håndværkspinde, for at sikre, at hver brønd med ethanol flugter med hver brønd, der indeholder en flue.</li>
	<li>Den eksperimentelle opsætning skal ligne figur 2.</li>
</ol>4. Test af fluer
<ol><li>Sørg for, at belysningspuden lyser ved fuld lysstyrke for at opnå maksimal visuel kontrast. Begynd at optage med videokameraet.</li>
	<li>For at udsætte fluerne for ethanol skal du forsigtigt fjerne plasten fra mellem brøndpladen og testapparatet, idet du skal passe på ikke at løsne ostelærredet.</li>
	<li>Afslut videooptagelsen, når alle fluer har mistet postural kontrol. Når der er mistanke om, at alle fluer har mistet postural kontrol, skal du trykke fast i midten af pladen for at sikre, at alle fluer har fuldstændig tab af postural kontrol. Hvis der er bevægelse, skal du fortsætte med at optage. Fortsæt med at trykke regelmæssigt (hver 1-2 min), indtil ingen bevægelse opstår.</li>
	<li>(Valgfrit) For hurtigt at genvinde fluerne, skal du kun fjerne toppladen fra testapparatet, afslører bedøvede fluer hvilende på ostelærredet. Aspirate enkelte flyver ind i udvalgte beholdere til nyttiggørelse.</li>
	<li>Ethanolen udskiftes i de modificerede cellekulturplader med 1 ml frisk 100 % ethanol mindst 1 x hver time for at kontrollere forfordampning og befugtning af ethanolen og for at opretholde en ensartet ethanoleksponering under hele analysen. Tør skærmmasken med ostelærred.</li>
	<li>Gentag for så mange prøver som ønsket. BEMÆRK: For højeste gennemløb, aspirat den næste runde af fluer i nye celle kultur plader under videooptagelse. Protokollen kan sættes på pause her, da videooptagelsen kan gennemgås senere.</li>
</ol>5. Bestemmelse af flyvesedationstid
<ol><li>Optag sedation tid for hver enkelt flyve ved at se videooptagelse. Sedation tid er defineret som det øjeblik en flue mister fuldstændig postural kontrol og bevægelsesevne. Det anbefales at se filmen i bakgear og optage det tidspunkt, hvor fluen begynder at bevæge sig for at sikre nøjagtighed.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Heath, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+differences+in+alcohol+sensitivity+and+the+inheritance+of+alcoholism+risk.">Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk.</a> Psychological Medicine. 29 (5), 1069-1081 (1999).</li><li>Schuckit, M. A., Smith, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationships+of+a+family+history+of+alcohol+dependence,+a+low+level+of+response+to+alcohol+and+six+domains+of+life+functioning+to+the+development+of+alcohol+use+disorders.">The relationships of a family history of alcohol dependence, a low level of response to alcohol and six domains of life functioning to the development of alcohol use disorders.</a> Journal of Studies on Alcohol. 61 (6), 827-835 (2000).</li><li>Trim, R. S., Schuckit, M. A., Smith, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationships+of+the+level+of+response+to+alcohol+and+additional+characteristics+to+alcohol+use+disorders+across+adulthood:+a+discrete-time+survival+analysis.">The relationships of the level of response to alcohol and additional characteristics to alcohol use disorders across adulthood: a discrete-time survival analysis.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33 (9), 1562-1570 (2009).</li><li>Schuckit, M. A., Smith, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+and+course+of+alcoholism+over+25+years+in+middle+class+men.">Onset and course of alcoholism over 25 years in middle class men.</a> Drug and Alcohol Dependence. 113 (1), 21-28 (2011).</li><li>Morozova, T. V., Mackay, T. F. C., Anholt, R. R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+genomics+of+alcohol+sensitivity.">Genetics and genomics of alcohol sensitivity.</a> Molecular Genetics and Genomics. 289 (3), 253-269 (2014).</li><li>Heberlein, U., Wolf, F. W., Rothenfluh, A., Guarnieri, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+analysis+of+ethanol+intoxication+in+Drosophila+melanogaster.">Molecular genetic analysis of ethanol intoxication in Drosophila melanogaster.</a> Integrative and Comparative Biology. 44 (4), 269-274 (2004).</li><li>Engel, G. L., Taber, K., Vinton, E., Crocker, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+alcohol+use+disorder+using+Drosophila+melanogaster+in+the+era+of+'Big+Data'.">Studying alcohol use disorder using Drosophila melanogaster in the era of 'Big Data'.</a> Behavioral and Brain Functions. 15 (1), 7 (2019).</li><li>Singh, C. M., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+acute+ethanol-induced+behaviors+in+Drosophila.">Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 24 (8), 1127-1136 (2000).</li><li>Mackay, T. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel.">The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel.</a> Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+genome+architecture+among+205+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel+lines.">Natural variation in genome architecture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines.</a> Genome Research. 24 (7), 1193-1208 (2014).</li><li>Morozova, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cyclin+E+centered+genetic+network+contributes+to+alcohol-induced+variation+in+Drosophila+development.">A Cyclin E centered genetic network contributes to alcohol-induced variation in Drosophila development.</a> G3. 8 (8), 2643-2653 (2018).</li><li>Morozova, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphisms+in+early+neurodevelopmental+genes+affect+natural+variation+in+alcohol+sensitivity+in+adult+drosophila.">Polymorphisms in early neurodevelopmental genes affect natural variation in alcohol sensitivity in adult drosophila.</a> BMC Genomics. 16, 865 (2015).</li><li>Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ethanol+tolerance+in+Drosophila.">Functional ethanol tolerance in Drosophila.</a> Neuron. 28 (1), 261-271 (2000).</li><li>Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+chronic:+two+distinct+forms+of+ethanol+tolerance+in+Drosophila.">Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 28 (10), 1469-1480 (2004).</li><li>Morozova, T. V., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+to+alcohol+exposure+in+Drosophila+melanogaster.">Transcriptional response to alcohol exposure in Drosophila melanogaster.</a> Genome Biology. 7 (10), 95 (2006).</li><li>Weber, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apparatus+for+measurement+of+resistance+to+gas-phase+agents.">An apparatus for measurement of resistance to gas-phase agents.</a> Drosophila Information Service. 67, 91-93 (1988).</li><li>Weber, K. E., Diggins, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+selection+response+in+larger+populations.+II.+Selection+for+ethanol+vapor+resistance+in+Drosophila+melanogaster+at+two+population+sizes.">Increased selection response in larger populations. II. Selection for ethanol vapor resistance in Drosophila melanogaster at two population sizes.</a> Genetics. 125 (3), 585-597 (1990).</li><li>Cohan, F. M., Graf, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latitudinal+cline+in+Drosophila+melanogaster+for+knockdown+resistance+to+ethanol+fumes+and+for+rates+of+response+to+selection+for+further+resistance.">Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance.</a> Evolution. 39 (2), 278-293 (1985).</li><li>Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hangover+gene+defines+a+stress+pathway+required+for+ethanol+tolerance+development.">The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development.</a> Nature. 436 (7052), 845-847 (2005).</li><li>Morozova, T. V., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+transcriptional+response+to+selection+for+alcohol+sensitivity+in+Drosophila+melanogaster.">Phenotypic and transcriptional response to selection for alcohol sensitivity in Drosophila melanogaster.</a> Genome Biology. 8 (10), 231 (2007).</li><li>Morozova, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol+sensitivity+in+Drosophila:+Translational+potential+of+systems+genetics.">Alcohol sensitivity in Drosophila: Translational potential of systems genetics.</a> Genetics. 83, 733-745 (2009).</li><li>Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+for+evoked+locomotor+behavior+in+Drosophila+reveals+a+role+for+integrins+in+ethanol+sensitivity+and+rapid+ethanol+tolerance.">An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33 (10), 1794-1805 (2009).</li><li>Sandhu, S., Kollah, A. P., Lewellyn, L., Chan, R. F., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inexpensive,+scalable+behavioral+assay+for+measuring+ethanol+sedation+sensitivity+and+rapid+tolerance+in+Drosophila.">An inexpensive, scalable behavioral assay for measuring ethanol sedation sensitivity and rapid tolerance in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52676 (2015).</li><li>Urizar, N. L., Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+homer+is+required+in+a+small+set+of+neurons+including+the+ellipsoid+body+for+normal+ethanol+sensitivity+and+tolerance.">Drosophila homer is required in a small set of neurons including the ellipsoid body for normal ethanol sensitivity and tolerance.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4541-4551 (2007).</li><li>Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+analysis+of+ethanol-induced+locomotor+stimulation+in+Drosophila.">High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (24), 11035-11044 (2002).</li><li>Cohan, F. M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+divergence+under+uniform+selection.+II.+Different+responses+to+selection+for+knockdown+resistance+to+ethanol+among+Drosophila+melanogaster+populations+and+their+replicate+lines.">Genetic divergence under uniform selection. II. Different responses to selection for knockdown resistance to ethanol among Drosophila melanogaster populations and their replicate lines.</a> Genetics. 114 (1), 145-164 (1986).</li><li>Pohl, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+genes+differentially+affect+tolerance+to+ethanol+in+Drosophila.">Circadian genes differentially affect tolerance to ethanol in Drosophila.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 37 (11), 1862-1871 (2013).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epistasis+dominates+the+genetic+architecture+of+Drosophila+quantitative+traits.">Epistasis dominates the genetic architecture of Drosophila quantitative traits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15553-15559 (2012).</li><li>Ehrenreich, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+genetically+complex+traits+with+extremely+large+pools+of+yeast+segregants.">Dissection of genetically complex traits with extremely large pools of yeast segregants.</a> Nature. 464 (7291), 1039-1042 (2010).</li><li>Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+less+traveled:+From+genotype+to+phenotype+in+flies+and+humans.">The road less traveled: From genotype to phenotype in flies and humans.</a> Mammalian Genome. 29, 5-23 (2018).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Her præsenterer vi en enkel, billig og høj-throughput metode til vurdering af sedation tid på grund af ethanol eksponering i Drosophila melanogaster. I modsætning til mange nuværende metoder, som kræver gruppeanalyser, gør denne analyse det muligt for en enkelt person at indsamle individuelle sedationstidsdata for ~ 2.000 fluer inden for en 8 timers arbejdsperiode. Vi fandt ud af, at en enkelt person kan score 48 fluer for sedation tid i omkring 5 min. Med denne hastighed kan 2.000 fluer scores på cirka 4 timer, men scoring kan gennemføres senere. Med vores analyse, den registrerede sedation tid for de fleste fluer spænder fra 5-15 min ved en eksponering til 1 ml 100% ethanol. Lavere koncentrationer af ethanol eller mindre leveringsmængder vil resultere i længere sedation gange.
De nuværende metoder til vurdering af sedationstiden kræver test af et stort antal fluer uden let at muliggøre målinger på enkeltindivider15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Mange nuværende sedation og følsomhed assays stole på ST5022,23,24, det tidspunkt, hvor 50% af fluerne er bedøvet som følge af ethanol eksponering. Selv om opnåelse af ST50 for grupper af fluer ikke var den primære motivation for at udvikle denne analyse, viser videooptagelserne højere nytte i forhold til de nuværende metoder, da optagelserne kan bruges til at fastslå ST50 for grupper af individuelt testede fluer og til at måle procentdelen af fluer, der opfylder et givet kriterium (f.eks. tab af postural kontrol) til enhver tid. Det skal bemærkes, at sådanne videoanalyser ville kræve ekstra tid.
I modsætning til nuværende inebriometer analyser, den metode, vi beskriver ikke kræver specialiserede værktøjer til at oprette og kan udføres i ethvert laboratorium ved hjælp af fælles materialer. Ved hjælp af denne metode har vi opnået pålidelige og ensartede sedation gange for individuelle fluer. Analysen kan i princippet udvides til at vurdere virkningerne af eksponering for et flygtigt stof. Analysen kan også anvendes til at måle virkningerne af akut toksicitet af flygtige stoffer på andre insekter, herunder andre fluearter. Individuelle sedationstidsdata kan bruges til at vurdere omfanget af fænotypiskvariation inden for en population, f.eks.
Vi brugte små insektskærmnet for at forhindre direkte kontakt med ethanolopløsningen, samtidig med at vi tillod tilstrækkelige mængder ethanoldampe at nå fluen. Laget af hvid ostelærred oven på skærmmasken giver visuel kontrast mellem fluen og overfladen nedenfor og sikrer, at fluer ikke bliver fanget i skærmmasken, hvilket kan føre til tvetydig bestemmelse af tab af postural kontrol. Kommercielt tilgængelige membraner, der er porøse til vand og luft gav inkonsekvente resultater og var utilstrækkeligt gennemtrængelige til ethanol dampe. Vi har bevidst brugt små insekt skærm mesh, fordi det er et ensartet porøst materiale, der minimerer variation i ethanol eksponering som følge af flyve position i en brønd. Ændringer kan foretages i denne protokol baseret på tilgængelige materialer, selv om vi anbefaler en kontrolleret adfærdsmæssige kammer, adgang til 90% -100% ethanol tæt på fluen, og ensartet ethanol eksponering.
Flyve position inden for cellekultur plader bør randomiseres mellem replikater for at undgå positionelle bias. For større forsøg, der kræver brug af denne analyse på tværs af flere dage og derfor er underlagt miljømæssige variationer, der kan påvirke assay resultater (f.eks ændringer i barometertryk)27, anbefaler vi kraftigt, at fluer testes på samme tidspunkt hver dag og randomiseres både inden for og på tværs af dage, især hvis forskellige linjer og / eller køn skal sammenlignes med hinanden.
Den metode, vi udviklede, er bedst egnet til at måle effekten af akut alkoholeksponering, men er ikke egnet til at opnå forbrugsdata eller modelleringsafhængighed. Data om alkoholsedation sedation følsomhed fra denne analyse kan dog integreres med andre foranstaltninger af alkoholrelaterede fænotyper. En begrænsning af systemet er, at den lodrette højde af standard celle kultur plader giver mulighed for lodret flyve bevægelse, der ikke umiddelbart kan spores ved video til detaljeret vurdering af den samlede aktivitet eller bevægelse. Denne begrænsning påvirker dog ikke en nøjagtig vurdering af sedationstiden. Når du bruger fluer af forskellige genotyper (f.eks. i DGRP-afledte udbredde populationer28), gør denne analyse det også muligt at hente individuelle fluer for at indsamle puljer af fluer med kontrasterende fænotyper til bulk-DNA-sekvensering og ekstrem QTL-kortlægning29,30. Samlet set denne analyse tillader hurtig, billig indsamling af alkohol sedation data om et stort antal af enkelt fluer.

National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism rapporterer, at i 2015 overdreven alkoholforbrug, udpeget som "alkoholbrug lidelse", påvirket en anslået 16 millioner mennesker i USA. Alkoholmisbrug forårsager en bred vifte af negative fysiologiske virkninger og er en væsentlig dødsårsag i USA. Hos mennesker har nedsat følsomhed eller et lavt niveau af respons på alkohol en stærk genetisk komponent og er forbundet med en højere risiko for at udvikle alkoholmisbrugsforstyrrelser1,2,3,4. Genetiske risikoundersøgelser af befolkningsgrupper er udfordrende på grund af blanding af befolkningen, forskellige udviklingshistorieog miljøeksponeringer og afhængighed af selvrapporterede spørgeskemaer til kvantificering af alkoholrelaterede fænotyper, som ofte er forvirrede med andre neuropsykiatriske tilstande.
Drosophila melanogaster er en fremragende model til at studere de genetiske fundamenter af alkohol følsomhed5,6,7,8. Drosophila-modellen giver mulighed for streng kontrol over genetisk baggrund, og stort set ubegrænset antal personer af samme genotype kan opdrættes hurtigt under velkontrollerede miljøforhold uden lovgivningsmæssige restriktioner og til relativt lave omkostninger. Ud over offentligt tilgængelige mutationer og RNAi-linjer, der er målrettet mod et flertal af gener i genomet, har tilgængeligheden af Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP), en population på 205 indavlede vilde linjer med komplette genomsekvenser, muliggjort forbindelsesundersøgelserforhele genomet 9,10. Sådanne undersøgelser har identificeret genetiske netværk i forbindelse med virkninger på udviklingstiden og levedygtigheden ved udvikling af ethanol11,12. Evolutionær bevarelse af grundlæggende biologiske processer gør det muligt translationelle slutninger, der skal drages ved at overlejre menneskelige ortologs på deres flyve modstykker.
Fluer udsat for ethanol undergår fysiologiske og adfærdsmæssige ændringer, der ligner human alkoholforgiftning, herunder tab af postural kontrol8, sedation, og udvikling af tolerance13,14,15. Alkohol induceret sedation i Drosophila kan kvantificeres ved hjælp af inebriometre. Der er tale om 122 cm lange lodrette glassøjler med skrå maskeskillevægge , som fluer kan fastgøre16,17,18. En gruppe på mindst 50 fluer (køn kan analyseres separat) indføres i toppen af kolonnen og udsættes for ethanoldampe. Fluer, der mister postural kontrol falder gennem kolonnen og indsamles med 1 min intervaller. Den gennemsnitlige elueringstid tjener som et mål for følsomhed over for alkoholforgiftning. Når fluer udsættes for alkohol en anden gang efter at være kommet sig efter den første eksponering, kan de udvikle tolerance, som det fremgår af et skift i middelelueringstiden13,15,19,20. Mens inebriometer analyser har ført til identifikation af gener, genetiske netværk, og cellulære veje forbundet med alkohol sedation følsomhed og udvikling af tolerance12,,13,14,21, analysen er tidskrævende, lav-throughput, og ineffektiv til måling af alkohol følsomhed i enkelt fluer.
Alternative ethanolsedationsanalyser , der ikke kræver den omfattende opsætning af inebriometer , giver mulighed for mere bekvemme målinger , men som stadig er begrænsede i overførselsmængde og kræver generelt analyser af grupper af fluer i stedet for individer21,22,23,24,25. Vurdering af enkelte fluer minimerer risikoen for konfunderende effekter på grund af gruppeinteraktioner, f.eks. Her præsenterer vi en enkel, billig, høj-throughput assay til vurdering af alkohol sedation følsomhed i stort antal af enkelt fluer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1396px;" width="1396">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">24-well Cell Culture Plates</td>
			<td style="width:207px;">Corning</td>
			<td style="width:128px;">3526</td>
			<td style="width:772px;">Flat-bottomed; will house flies throughout assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Aspirator</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:772px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Cheesecloth</td>
			<td style="width:207px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:128px;">53-100</td>
			<td>Widely available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Ethanol</td>
			<td style="width:207px;">Decon Labs</td>
			<td style="width:128px;">V1001</td>
			<td>Widely available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover)</td>
			<td style="width:207px;">Walmart</td>
			<td style="width:128px;">550098612</td>
			<td>Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Gauze (for aspirator)</td>
			<td style="width:207px;">Honeywell North</td>
			<td style="width:128px;">67622</td>
			<td>Widely available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Illumination Pad</td>
			<td style="width:207px;">Amazon (AGPtek)</td>
			<td style="width:128px;">ASIN B00YA9GP0G</td>
			<td>Any light pad to provide contrast is suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Jumbo Craft Sticks</td>
			<td style="width:207px;">Michaels</td>
			<td style="width:128px;">10334892</td>
			<td>Any craft stick at least 7 cm long is suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">P1000 Pipette Tip (for aspirator)</td>
			<td style="width:207px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:128px;">24-165RL</td>
			<td>Any P1000 pipette tip is suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Serological Pipette (for aspirator)</td>
			<td style="width:207px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:128px;">12-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Small Insect Screen Mesh</td>
			<td style="width:207px;">Lowe&#39;s (Saint-Gobain ADFORS)</td>
			<td style="width:128px;">89322</td>
			<td>Any small insect screen mesh is suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Testing Chamber</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td>Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Tygon Tubing (for aspirator)</td>
			<td style="width:207px;">Grainger</td>
			<td style="width:128px;">9CUG7</td>
			<td>Widely available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Video Camera</td>
			<td style="width:207px;">Canon</td>
			<td>1959C001AA</td>
			<td>Any video camera is suitable.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput method for measuring alcohol sedation time of individual drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster giver en fremragende model til at studere den genetiske fundament af alkohol følsomhed. I modsætning til undersøgelser i befolkningsgrupper giver Drosophila-modellen mulighed for streng kontrol over genetisk baggrund, og stort set ubegrænset antal personer af samme genotype kan opdrættes hurtigt under velkontrollerede miljøforhold uden lovgivningsmæssige restriktioner og til relativt lave omkostninger. Fluer udsat for ethanol undergår fysiologiske og adfærdsmæssige ændringer, der ligner human alkoholforgiftning, herunder tab af postural kontrol, sedation og udvikling af tolerance. Her beskriver vi en enkel, billig, høj-throughput assay til vurdering af alkohol sedation følsomhed i stort antal af enkelt fluer. Analysen er baseret på videooptagelse af enkeltfluer indført uden anæstesi i 24-brønd celle kultur plader i et set-up, der muliggør synkron indledning af alkohol eksponering. Systemet gør det muligt for en enkelt person at indsamle individuelle ethanol sedation data om så mange som 2.000 fluer inden for en 8 timers arbejdsperiode. Analysen kan i princippet udvides til at omfatte en vurdering af virkningerne af eksponering for et flygtigt stof og anvendes til at måle virkningerne af flygtige stoffers akutte toksicitet på andre insekter, herunder andre fluearter.

To 24-brønd mikrotiter plader kunne generere data samtidig på 48 individuelle fluer inden for så lidt som 10 min. Tabel 1 lister målinger af ethanol sedation gange for 48 individuelle fluer, hanner og hunner separat, af to DGRP linjer med forskellige følsomheder over for alkohol eksponering på udvikling tid og levedygtighed13. Linjefluer RAL_555 var mindre følsomme end linje RAL_177 (figur 4, tabel 2; p < 0,0001, ANOVA). Hanner og hunner af RAL_177 udviste ingen seksuelt dimororfe virkning (figur 4, tabel 2; p > 0,1, ANOVA), mens hunner af linje RAL_555 var mindre følsomme over for ethanoleksponering end hannerne ( figur4, tabel 2; p < 0,006, ANOVA). Det store antal fluer, der kan måles samtidigt, og evnen til at måle køn og forskellige linjer samtidig tikanet kan øge nøjagtigheden ved at reducere fejl på grund af miljøvariation.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>A.</td>
			<td colspan="6">Ethanol Sedation Time (r)</td>
			<td>B.</td>
			<td colspan="6">Ethanol Sedation Time (r)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">Kvinder</td>
			<td colspan="3">Mænd</td>
			<td></td>
			<td colspan="3">Kvinder</td>
			<td colspan="3">Mænd</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>414</td>
			<td>365</td>
			<td>477</td>
			<td>423</td>
			<td>568</td>
			<td>309</td>
			<td></td>
			<td>937</td>
			<td>742</td>
			<td>622</td>
			<td>460</td>
			<td>331</td>
			<td>498</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>201</td>
			<td>384</td>
			<td>498</td>
			<td>411</td>
			<td>523</td>
			<td>626</td>
			<td></td>
			<td>791</td>
			<td>619</td>
			<td>197</td>
			<td>467</td>
			<td>455</td>
			<td>562</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>228</td>
			<td>364</td>
			<td>333</td>
			<td>440</td>
			<td>403</td>
			<td>267</td>
			<td></td>
			<td>504</td>
			<td>744</td>
			<td>513</td>
			<td>570</td>
			<td>582</td>
			<td>506</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>440</td>
			<td>416</td>
			<td>404</td>
			<td>408</td>
			<td>422</td>
			<td>384</td>
			<td></td>
			<td>970</td>
			<td>540</td>
			<td>369</td>
			<td>865</td>
			<td>533</td>
			<td>492</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>888</td>
			<td>283</td>
			<td>285</td>
			<td>322</td>
			<td>369</td>
			<td>287</td>
			<td></td>
			<td>595</td>
			<td>550</td>
			<td>606</td>
			<td>392</td>
			<td>544</td>
			<td>345</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1079</td>
			<td>519</td>
			<td>315</td>
			<td>393</td>
			<td>376</td>
			<td>284</td>
			<td></td>
			<td>418</td>
			<td>709</td>
			<td>553</td>
			<td>308</td>
			<td>477</td>
			<td>388</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>718</td>
			<td>287</td>
			<td>432</td>
			<td>275</td>
			<td>206</td>
			<td>411</td>
			<td></td>
			<td>366</td>
			<td>564</td>
			<td>558</td>
			<td>385</td>
			<td>576</td>
			<td>377</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>598</td>
			<td>337</td>
			<td>398</td>
			<td>279</td>
			<td>631</td>
			<td>372</td>
			<td></td>
			<td>437</td>
			<td>692</td>
			<td>578</td>
			<td>460</td>
			<td>511</td>
			<td>412</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>241</td>
			<td>398</td>
			<td>364</td>
			<td>347</td>
			<td>374</td>
			<td>808</td>
			<td></td>
			<td>665</td>
			<td>729</td>
			<td>484</td>
			<td>532</td>
			<td>425</td>
			<td>354</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>229</td>
			<td>423</td>
			<td>534</td>
			<td>386</td>
			<td>396</td>
			<td>628</td>
			<td></td>
			<td>312</td>
			<td>576</td>
			<td>305</td>
			<td>334</td>
			<td>531</td>
			<td>506</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>388</td>
			<td>488</td>
			<td>451</td>
			<td>523</td>
			<td>322</td>
			<td>533</td>
			<td></td>
			<td>682</td>
			<td>638</td>
			<td>420</td>
			<td>560</td>
			<td>548</td>
			<td>379</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>252</td>
			<td>529</td>
			<td>375</td>
			<td>427</td>
			<td>330</td>
			<td>540</td>
			<td></td>
			<td>1045</td>
			<td>741</td>
			<td>708</td>
			<td>832</td>
			<td>509</td>
			<td>472</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>674</td>
			<td>401</td>
			<td>303</td>
			<td>401</td>
			<td>307</td>
			<td>311</td>
			<td></td>
			<td>394</td>
			<td>675</td>
			<td>381</td>
			<td>477</td>
			<td>449</td>
			<td>784</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>303</td>
			<td>453</td>
			<td>351</td>
			<td>429</td>
			<td>525</td>
			<td>262</td>
			<td></td>
			<td>540</td>
			<td>690</td>
			<td>520</td>
			<td>556</td>
			<td>495</td>
			<td>226</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>258</td>
			<td>483</td>
			<td>302</td>
			<td>389</td>
			<td>562</td>
			<td>319</td>
			<td></td>
			<td>356</td>
			<td>615</td>
			<td>336</td>
			<td>454</td>
			<td>524</td>
			<td>590</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>346</td>
			<td>426</td>
			<td>385</td>
			<td>416</td>
			<td>596</td>
			<td>287</td>
			<td></td>
			<td>626</td>
			<td>678</td>
			<td>840</td>
			<td>634</td>
			<td>677</td>
			<td>509</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Målinger af sedationstider for ethanol(r) for individuelle fluer af (A) DGRP-linjer RAL_177 og (B) RAL_555 for særskilte køn ( n =48). Se også tabel 2, figur 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61108/61108fig4.jpg"> Figur 4: Sengetider for alkohol sedation for DGRP-linjer RAL_177 og RAL_555. Søjlerne repræsenterer middelværdien og fejllinjerne SEM (n = 48). Sedation gange for RAL_177 fluer var mindre end for RAL_55 fluer (p < 0,0001, ANOVA). De enkelte datapunkter er angivet i tabel 1. Yderligere statistisk signifikante forskelle mellem køn og linjer er angivet i teksten og i tabel 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61108/61108fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Analyse</td>
			<td>Kilde til variation</td>
			<td>Df</td>
			<td>Ss</td>
			<td>F-værdi</td>
			<td>P-værdi</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Fuld model samlet</td>
			<td>Linje</td>
			<td>1</td>
			<td>769627</td>
			<td>34.869</td>
			<td><0.0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>Køn</td>
			<td>1</td>
			<td>105001</td>
			<td>4.757</td>
			<td>0.0304</td>
		</tr>
<tr>
<td>Linje x Sex</td>
			<td>1</td>
			<td>86021</td>
			<td>3.897</td>
			<td>0.0498</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fejl</td>
			<td>188</td>
			<td>4149491</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Reduceret model hunner</td>
			<td>Linje</td>
			<td>1</td>
			<td>685126</td>
			<td>23.58</td>
			<td><0.0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fejl</td>
			<td>94</td>
			<td>2730718</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Reduceret model hanner</td>
			<td>Linje</td>
			<td>1</td>
			<td>170522</td>
			<td>11.3</td>
			<td>0.0011</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fejl</td>
			<td>94</td>
			<td>1418774</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Reduceret model RAL_177</td>
			<td>Køn</td>
			<td>1</td>
			<td>473</td>
			<td>0.023</td>
			<td>0.8800</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fejl</td>
			<td>94</td>
			<td>1943741</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Reduceret model RAL_555</td>
			<td>Køn</td>
			<td>1</td>
			<td>190549</td>
			<td>8.12</td>
			<td>0.0054</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fejl</td>
			<td>94</td>
			<td>2205751</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Analyser af varians for sedation tid på tværs af køn og DGRP linje. Den anvendte model var Y = μ + L + L + LxS + ε, hvor μ er det samlede gennemsnit, L er den faste effekt af DGRP-linjen (RAL_177, RAL_555), S er den faste effekt af køn (mand, kvinde), LxS er interaktionsudtrykket (fast), og ε er fejludtrykket. Modellerne Y = μ + L + ε og Y = μ + S + ε blev anvendt til de reducerede modeller. Line, Sex, og Line x Sex interaktion sigt var alle væsentlige i den fulde model på α < 0,05. Reducerede modeller efter køn og DGRP linje RAL_555 var også betydelige på α < 0,01. Se også tabel 1, figur 4. df = frihedsgrader, SS = Type I Summer of Squares.

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster at JoVE.com

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Nuværende metoder til måling af alkoholfølsomhed i Drosophila er designet til at teste grupper af fluer. Vi præsenterer en enkel, billig, høj-throughput assay til vurdering af alkohol sedation følsomhed i stort antal af enkelt fluer. Metoden kræver ikke specialiserede værktøjer og kan udføres i ethvert laboratorium ved hjælp af fælles materialer.

High-Throughput metode til måling af alkohol sedation Tid af individuelle Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human ...

Drosophila giver en glimrende model til at studere de genetiske grundlag for alkohol følsomhed, fordi du kan kvantificere alkohol følsomhed præcist under kontrollerede genetiske baggrunde og miljømæssige forhold. Nuværende metoder til at måle alkohol følsomhed i Drosophila testgrupper af fluer. Vi præsenterer en enkel, billig, høj gennemløbsmetode til vurdering af alkoholfølsomhed i et stort antal enkelt fluer.Variation i alkohol følsomhed i Drosophila kan oversættes til lignende fænotyper hos mennesker, fordi fluer deler omkring 75% af deres gener med humane orthologs. Den analyse, vi udviklede, kan også anvendes til at måle virkningerne af flygtige stoffers akutte toksicitet på andre insekter, herunder andre fluearter eller sygdomsvektorer. Begynd med at lave en papskabelon af en 24-brøndcellekulturplade.Spor rundt om pladen, og skær det udpegede område ud. Brug derefter papskabelonen til at skabe et stykke lille insektskærmnet på størrelse med pladen. Placer en lille linje af varm lim omkring omkredsen af en 24-brønd kultur plade, og anbringe skærmen mesh på toppen af brøndene.Brug derefter den varme limpistol til at sikre et træfartøjspind på tre sider af kulturpladen. Forbered så mange plader, som der kan passe ind i filmkammeret. For at skabe filmkammeret skal du klippe et hul på størrelse med videokameralinsen på den ene side af en polystyrenboks og en ekstra slids på størrelsen af belysningspuden på den modsatte side.Sæt belysningspuden ind i slidsen, og placer kameraet i objektivhullet over belysningspuden. Placer alle testmaterialer i et kontrolleret miljø, helst et adfærdskammer med ca. 30% fugtighed, 25 grader Celsius temperatur, ensartet luftstrøm og støjniveauer mindre end 65 decibel. Brug den tidligere lavet pap skabelon til at skære to stykker ostelærred.Derefter pipette en milliliter 100% ethanol gennem skærmen mesh i hver brønd. Tør masken, og læg de to stykker ostelærred på toppen. Skær et lille stykke tyndt, fleksibelt, plastskærebræt ved at bruge papskabelonen som vejledning til at udvide området med en til to centimeter på en af de korte sider.Efter skæring skal du sikre dig, at plasten stadig passer mellem de tre træhåndværkspinde på testapparatet, men hænger den ene ende af. Forbered en aspirator i henhold til manuskript retninger, og bruge den til at overføre en flue per godt ind i en 24-brønd celle kultur plade, der dækker eventuelle brønde med tidligere indsugning fluer med den fleksible plast. Optag brøndpositionen og alle relevante genotype- eller fænotypeoplysninger for hver flue.Hold den fleksible plast flugter med toppen af cellekulturpladen, der indeholder fluerne, og inverter pladen på toppen af den modificerede cellekulturplade med ethanolen. Brug håndværkspindene til at justere den omvendte cellekulturplade, og sørg for, at hver brønd flugter med hver brønd, der indeholder en flue. Sørg for, at belysningspuden lyser ved fuld lysstyrke, og begynd at optage med videokameraet.Udsæt fluerne til ethanolen ved forsigtigt at fjerne plasten mellem de to plader, og sørg for ikke at løsne ostelærred. Når der er mistanke om, at alle fluer har mistet postural kontrol, tryk fast i midten af pladen. Hvis der er bevægelse, skal du fortsætte med at optage og trykke hvert en til to minutter, indtil der ikke sker nogen bevægelse.Afslut optagelsen, når der ikke er nogen bevægelse. For at bjærge fluerne skal du fjerne toppladen fra testapparatet og aspirere de enkelte fluer ind i udvalgte beholdere. Der skal erstattes ethanolen i de modificerede cellekulturplader mindst én gang i timen for at opretholde en ensartet ethanoleksponering i hele analysen, og forsøget gentages for så mange prøver som ønsket.Se videooptagelsen for at bestemme flyvesedationstid, som defineres som det øjeblik, en flue mister postural kontrol og bevægelsesevne. For at sikre nøjagtighed, se filmen i bakgear, og registrere det tidspunkt, hvor fluen begynder at bevæge sig. Denne metode kan bruges til at generere data om et stort antal fluer inden for 10 minutter.To 24-brønds plader blev brugt til samtidig at måle ethanol sedation gange for 48 individuelle fluer af to DGRP linjer med forskellige følsomheder over for alkohol. Store stikprøvestørrelser øger nøjagtigheden og reducerer fejl til miljøvariationer. RAL_555 var mindre følsomme end RAL-177 fluer.Hanner og hunner af RAL_177 viste ingen seksuelt dimorfe effekt, mens hunnerne af linje RAL_555 var mindre følsomme over for ethanol eksponering end hannerne. Når du forsøger denne protokol, er det afgørende at udføre aspiration af fluer og inversion af cellekultur plade med præcision for at opnå det ønskede resultat. Da evnen til at vurdere enkelt fluer undgår forstyrrende virkninger på grund af gruppeinteraktioner, forbedrer denne analyse nytten af Drosophila-modellen til undersøgelser med høj kapacitet på akutte virkninger af alkoholeksponering.

Research

JoVE Journal

Behavior

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Moderate Prenatal Alcohol Exposure and Quantification of Social Behavior in Adult Rats

Moderat Prænatal Alkohol Eksponering og kvantificering af social adfærd hos voksne rotter

Alterations in social behavior are among the major negative consequences observed in children with Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). Several ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Gnaverhjerne Mikroinjektion at studere Molekylær Substrater af motiveret adfærd

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

A Method for Evaluating the Reinforcing Properties of Ethanol in Rats without Water Deprivation, Saccharin Fading or Extended Access Training

En metode til evaluering af forstærkende egenskaber af ethanol i rotter uden vand afsavn, Saccharin Fading eller udvidet adgang Uddannelse

Operant oral self-administration methods are commonly used to study the reinforcing properties of ethanol in animals. However, the standard methods ...

The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse

Den løbebånd Træthed Test: En enkel, High-throughput Assay af Træthed-lignende adfærd for musen

Fatigue is a prominent symptom in many diseases and disorders and reduces quality of life for many people. The lack of clear pathogenesis and failure of ...

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

En metode til at teste effekten af ​​miljøvinkler på parringsadfærd i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

En gravende/Tunneling Assay til påvisning af hypoxi i Drosophila melanogaster larver

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Noninvasive, High-throughput Determination of Sleep Duration in Rodents

Noninvasiv, høj overførselshastighed bestemmelse af søvn varigheden i gnavere

Traditionally, sleep is monitored by an electroencephalogram (EEG). EEG studies in rodents require surgical implantation of the electrodes followed by a ...

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

En automatiseret metode til at bestemme effektiviteten af Drosophila reaktion på temperaturændringer i rum og tid

Temperature is a ubiquitous environmental factor that affects how species distribute and behave. Different species of Drosophila fruit flies have specific ...

Multi-Modal Signals for Analyzing Pain Responses to Thermal and Electrical Stimuli

Multimodale signaler til at analysere smerte reaktioner på termiske og elektriske Stimuli

The assessment of pain relies mostly on methods that require a person to communicate. However, for people with cognitive and verbal impairments, existing ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

En forbedret analyse og værktøjer til måling af mekanisk nociception i Drosophila Larver

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...