Name: high-throughput method for measuring alcohol sedation time of individual drosophila melanogaster
Uploaded: 2020-04-20T13:00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים DA041613 ו GM128974 מן המכונים הלאומיים לבריאות ל-TFCM ו RRHA.

1. בניית מנגנוני הבדיקה
<ol><li>יצירת תבנית קרטון בגודלה של צלחת תרבות תא בעלת 24 תאים על-ידי עקיבה סביב הצלחת על קרטון וגזירת האזור המיועד.</li>
	<li>חותכים פיסת רשת קטנה של מסך חרק בגודל צלחת תרבות התא באמצעות תבנית קרטון משלב 1.1.</li>
	<li>הכנת צלחת התרבות תא 24 היטב על ידי הצבת קו קטן של דבק חם סביב היקף החלק העליון של הצלחת באמצעות אקדח דבק חם ותיקון שינוי המסך על גבי הבארות פתוח.</li>
	<li>אבטחת מלאכה עץ מקל כל אחד משלושת הצדדים של אותה צלחת תרבות התא משלב 1.3 באמצעות אקדח דבק חם. לוח תרבות התא המתוקן אמור להידמות כעת לדיאגרמת הצלחות המוצגת באיור 1A ובכיוונון הנסיוני המוצג באיור 2. הערה: הכינו לפחות מספר רב של לוחיות הזיהוי התאים שיתאימו לתאי הצילום (ראו להלן).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61108/61108fig1.jpg"> איור 1: תרשים מנגנון הבדיקה וחדר הצילום. (A) דיאגרמות עליונות. התצוגות העליונות, הצדדיות והקדמיות של מנגנוני הבדיקה מוצגות, בהתאמה. רשת שינוי של המסך מטילה על גבי צלחת תרבות התאים 24 היטב. כלי השיט מעץ, המיוצגים על ידי ראשי החצים, מחוברים לשלושה צדדים סמוכים ליציבות ולעזר היישור, שניים בצד צלחת הבאר עם שש בארות ואחד בצד הצלחת עם ארבע בארות. כל הקבצים המצורפים חמים מודבקים על המנגנון. (ב) דיאגרמות נמוכות יותר. התצוגות העליונות, הצדדיות והקדמיות של הגדרת הערכה מוצגות, בהתאמה. חתך מצדו הימני של הקופסה, מפתח המכסה ועד לחלק האחורי של הפתח, עם החלק התחתון של רמת החתך אל המשטח הפנימי. החור בראש התיבה, המשטח המקביל לקרקע, ממורכז לחשיפה מקסימלית של וידאו. התיבה המוצלת מייצגת את מצלמת הווידיאו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61108/61108fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61108/61108fig2.jpg"> איור 2: צילום של מערכת השיטה. מצלמת הווידיאו מונחת על גבי תא הפוליסטירן, כשהעדשה מוכנסת לחור החתוך, מומחש בדיאגרמות של איור 1B. שני סטים של שינוי היטב של תרבות תא התאים משענת על גבי משטח התאורה כי הוא הוכנס לחתוך דרך הצד של החדר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61108/61108fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
2. בניית חדר הצילום
<ol><li>צור תא צילום על ידי חיתוך חור בגודל של עדשת מצלמת הוידיאו בצד של התיבה פוליסטירן. חותכים תוספת לרוחב של משטח התאורה בצדו הנגדי של הפוליסטירן. חדר הצילום אמור להידמות לחדר הצילום המוצג באיור 1B ובאיור 2.</li>
	<li>הכן את חדר הצילום לשימוש על-ידי החדרת משטח התאורה לתוך החריץ והצבת המצלמה בחור העדשה מעל למשטח התאורה.</li>
	<li>מניחים את כל החומרים ולבצע את כל הבדיקות העוקבות בסביבה מבוקרת, רצוי חדר התנהגותית עם כ 30% לחות, 25 ° c טמפרטורה, זרימת אוויר אחיד, ורמות רעש פחות מ 65 dB.</li>
</ol>3. הכנת מנגנון הבדיקה והזבובים
<ol><li>פיפטה 1 מ ל של 100% אתנול דרך המסך שינוי לתוך כל טוב.</li>
	<li>יבש את שינוי המסך עם פיסת גזה.</li>
	<li>חותכים שתי חתיכות של גזה את הממדים של צלחת תרבות התא באמצעות תבנית קרטון שנוצר בשלב 1.1. מניחים אותם על גבי רשת המסך היבש של הצלחת תרבות התא שונה המכיל אתנול משלב 3.2.</li>
	<li>צור חתיכה קטנה של לוח חיתוך פלסטיק דק וגמיש על-ידי מעקב סביב תבנית קרטון שנוצרה בשלב 1.1 כמדריך כללי והרחבת אזור המעקב באמצעות 1 – 2 ס"מ על אחד הצדדים הקצרים. לגזור את האזור המורחב מעקב מלוח דק, גמיש חיתוך פלסטיק. לאחר גזירה, להבטיח כי פלסטיק עדיין מתאים בין שלוש מקלות כלי השיט מעץ על מנגנון הבדיקה, אבל מתנתק קצה אחד על ידי 1 – 2 ס"מ.</li>
	<li>אופציונלי אם צריך ליצור מייבש שמנת, להרכיב מייבש כמו זה המוצג באיור 3 על ידי הראשון חיתוך P1000 מראה הצינורות לחצי. הוסף את פיסת עם קוטר גדול לקצה אחד של ~ 30 ס"מ פיסת צינורות גמישים לשמש כפייה.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61108/61108fig3.jpg"> איור 3: שופית זבוב שבו זבובים נאספים עם שומה להחלפה מחוברת אבובים גמיש ומלא משעמם עם פקק של גזה כותנה. המפעיל יכול לאכול זבוב אחד. לתוך הפיפטה להעברה ללא הרדמה <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61108/61108fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol start="6"><li>אופציונלי כדי להשלים את ההרכבה מייבש, לכסות את הקצה הרחב של 10 ס"מ פיסת הצינור סרולוגית עם גזה כדי למנוע זבובים להיכנס אבובים ולהכניס את הפיפטה, גזה הראשון, לתוך הקצה הפתוח של אבובים לשמש תא זבוב. מייבש האספירין צריך להידמות. לזה שמוצג באיור 3</li>
	<li>באמצעות מייבש (איור 3, שלבים 3.5 ו 3.6), לייבש זבוב אחד לתוך לוחית נפרד 24-היטב התרבות התא. השתמש בפלסטיק גמיש כדי לכסות כל בארות המכילות זבובים משופחת קודם לכן. הקלט את המיקום היטב ואת כל גנוטיפ רלוונטיים או מידע פנוטיפ של כל זבוב.</li>
	<li>להחזיק את הסומק פלסטיק גמיש עם החלק העליון של הלוח תרבות התא המכיל את הזבובים כדי למנוע בריחה שלהם להפוך את הצלחת אל החלק העליון של הצלחת תרבות התא שונה עם האתנול. הסדין של פלסטיק גמיש צריך להיות נח על גבי גיליונות של גזה. ליישר את הלוח הפוך תרבות התא המכיל זבובים באמצעות מקלות מלאכת יד כדי להבטיח כל טוב עם אתנול מיישרת עם כל היטב המכיל זבוב.</li>
	<li>הכיוונון הנסיוני צריך להידמות לאיור 2.</li>
</ol>4. בדיקת הזבובים
<ol><li>ודא שמשטח התאורה דולק בבהירות מלאה לניגודיות חזותית מקסימלית. התחל להקליט עם מצלמת הווידיאו.</li>
	<li>כדי לחשוף את הזבובים כדי אתנול, בזהירות להסיר את הפלסטיק מבין צלחת הבאר ומכשיר הבדיקה, מטפלת לא לנתק את גזה.</li>
	<li>לסיים את הקלטת וידאו פעם אחת כל הזבובים איבדו את השליטה הפוסט. ברגע שהוא חשוד כי כל הזבובים איבדו את השליטה הפוסט, הקש בחוזקה במרכז הלוח כדי להבטיח כי כל הזבובים יש אובדן מוחלט של שליטה בדואר. , אם יש תזוזה. המשיכי להקליט המשך להקיש מדי פעם (כל 1 – 2 דקות) עד ששום תנועה לא תתרחש.</li>
	<li>אופציונלי כדי לשחזר במהירות את הזבובים, להסיר את הצלחת העליון ממנגנון הבדיקה, חשיפת זבובים מסומם נח על גזה. מנושף זבובים בודדים לתוך מכולות שנבחרו להתאוששות.</li>
	<li>החלף את האתנול בלוחות תרבות התא ששונתה עם 1 מ ל של טרי 100% אתנול לפחות 1 x כל שעה כדי לשלוט על אידוי ומחולל לחות של האתנול וכדי לשמור על חשיפה לאתנול עקבי לאורך הזמן. יבש את שינוי המסך עם גזה.</li>
	<li>חזור על הפעולה לקבלת דגימות רבות ככל שתרצה. הערה: לתפוקה הגבוהה ביותר, המשך הסיבוב הבא של זבובים ללוחות של תרבות התא החדשה במהלך הקלטת וידאו. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן, כמו הקלטת וידאו ניתן לסקור מאוחר יותר.</li>
</ol>5. קביעת זמן הרגעה לטיסה
<ol><li>הקלטת זמן הרגעה עבור כל זבוב בודד על ידי צפייה בהקלטת וידאו. זמן ההרדמה מוגדר כרגע זבוב מאבד שליטה מלאה הפוסט ויכולת locomotor. מומלץ לצפות בסרט הפוך ולתעד את הזמן שהזבוב מתחיל לנוע כדי להבטיח דיוק.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Heath, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+differences+in+alcohol+sensitivity+and+the+inheritance+of+alcoholism+risk.">Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk.</a> Psychological Medicine. 29 (5), 1069-1081 (1999).</li><li>Schuckit, M. A., Smith, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationships+of+a+family+history+of+alcohol+dependence,+a+low+level+of+response+to+alcohol+and+six+domains+of+life+functioning+to+the+development+of+alcohol+use+disorders.">The relationships of a family history of alcohol dependence, a low level of response to alcohol and six domains of life functioning to the development of alcohol use disorders.</a> Journal of Studies on Alcohol. 61 (6), 827-835 (2000).</li><li>Trim, R. S., Schuckit, M. A., Smith, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationships+of+the+level+of+response+to+alcohol+and+additional+characteristics+to+alcohol+use+disorders+across+adulthood:+a+discrete-time+survival+analysis.">The relationships of the level of response to alcohol and additional characteristics to alcohol use disorders across adulthood: a discrete-time survival analysis.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33 (9), 1562-1570 (2009).</li><li>Schuckit, M. A., Smith, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+and+course+of+alcoholism+over+25+years+in+middle+class+men.">Onset and course of alcoholism over 25 years in middle class men.</a> Drug and Alcohol Dependence. 113 (1), 21-28 (2011).</li><li>Morozova, T. V., Mackay, T. F. C., Anholt, R. R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+genomics+of+alcohol+sensitivity.">Genetics and genomics of alcohol sensitivity.</a> Molecular Genetics and Genomics. 289 (3), 253-269 (2014).</li><li>Heberlein, U., Wolf, F. W., Rothenfluh, A., Guarnieri, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+analysis+of+ethanol+intoxication+in+Drosophila+melanogaster.">Molecular genetic analysis of ethanol intoxication in Drosophila melanogaster.</a> Integrative and Comparative Biology. 44 (4), 269-274 (2004).</li><li>Engel, G. L., Taber, K., Vinton, E., Crocker, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+alcohol+use+disorder+using+Drosophila+melanogaster+in+the+era+of+'Big+Data'.">Studying alcohol use disorder using Drosophila melanogaster in the era of 'Big Data'.</a> Behavioral and Brain Functions. 15 (1), 7 (2019).</li><li>Singh, C. M., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+acute+ethanol-induced+behaviors+in+Drosophila.">Genetic control of acute ethanol-induced behaviors in Drosophila.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 24 (8), 1127-1136 (2000).</li><li>Mackay, T. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel.">The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel.</a> Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+genome+architecture+among+205+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel+lines.">Natural variation in genome architecture among 205 Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel lines.</a> Genome Research. 24 (7), 1193-1208 (2014).</li><li>Morozova, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cyclin+E+centered+genetic+network+contributes+to+alcohol-induced+variation+in+Drosophila+development.">A Cyclin E centered genetic network contributes to alcohol-induced variation in Drosophila development.</a> G3. 8 (8), 2643-2653 (2018).</li><li>Morozova, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphisms+in+early+neurodevelopmental+genes+affect+natural+variation+in+alcohol+sensitivity+in+adult+drosophila.">Polymorphisms in early neurodevelopmental genes affect natural variation in alcohol sensitivity in adult drosophila.</a> BMC Genomics. 16, 865 (2015).</li><li>Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. M., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ethanol+tolerance+in+Drosophila.">Functional ethanol tolerance in Drosophila.</a> Neuron. 28 (1), 261-271 (2000).</li><li>Berger, K. H., Heberlein, U., Moore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+chronic:+two+distinct+forms+of+ethanol+tolerance+in+Drosophila.">Rapid and chronic: two distinct forms of ethanol tolerance in Drosophila.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 28 (10), 1469-1480 (2004).</li><li>Morozova, T. V., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+response+to+alcohol+exposure+in+Drosophila+melanogaster.">Transcriptional response to alcohol exposure in Drosophila melanogaster.</a> Genome Biology. 7 (10), 95 (2006).</li><li>Weber, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+apparatus+for+measurement+of+resistance+to+gas-phase+agents.">An apparatus for measurement of resistance to gas-phase agents.</a> Drosophila Information Service. 67, 91-93 (1988).</li><li>Weber, K. E., Diggins, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+selection+response+in+larger+populations.+II.+Selection+for+ethanol+vapor+resistance+in+Drosophila+melanogaster+at+two+population+sizes.">Increased selection response in larger populations. II. Selection for ethanol vapor resistance in Drosophila melanogaster at two population sizes.</a> Genetics. 125 (3), 585-597 (1990).</li><li>Cohan, F. M., Graf, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latitudinal+cline+in+Drosophila+melanogaster+for+knockdown+resistance+to+ethanol+fumes+and+for+rates+of+response+to+selection+for+further+resistance.">Latitudinal cline in Drosophila melanogaster for knockdown resistance to ethanol fumes and for rates of response to selection for further resistance.</a> Evolution. 39 (2), 278-293 (1985).</li><li>Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hangover+gene+defines+a+stress+pathway+required+for+ethanol+tolerance+development.">The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development.</a> Nature. 436 (7052), 845-847 (2005).</li><li>Morozova, T. V., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+transcriptional+response+to+selection+for+alcohol+sensitivity+in+Drosophila+melanogaster.">Phenotypic and transcriptional response to selection for alcohol sensitivity in Drosophila melanogaster.</a> Genome Biology. 8 (10), 231 (2007).</li><li>Morozova, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcohol+sensitivity+in+Drosophila:+Translational+potential+of+systems+genetics.">Alcohol sensitivity in Drosophila: Translational potential of systems genetics.</a> Genetics. 83, 733-745 (2009).</li><li>Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assay+for+evoked+locomotor+behavior+in+Drosophila+reveals+a+role+for+integrins+in+ethanol+sensitivity+and+rapid+ethanol+tolerance.">An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 33 (10), 1794-1805 (2009).</li><li>Sandhu, S., Kollah, A. P., Lewellyn, L., Chan, R. F., Grotewiel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inexpensive,+scalable+behavioral+assay+for+measuring+ethanol+sedation+sensitivity+and+rapid+tolerance+in+Drosophila.">An inexpensive, scalable behavioral assay for measuring ethanol sedation sensitivity and rapid tolerance in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52676 (2015).</li><li>Urizar, N. L., Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+homer+is+required+in+a+small+set+of+neurons+including+the+ellipsoid+body+for+normal+ethanol+sensitivity+and+tolerance.">Drosophila homer is required in a small set of neurons including the ellipsoid body for normal ethanol sensitivity and tolerance.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (17), 4541-4551 (2007).</li><li>Wolf, F. W., Rodan, A. R., Tsai, L. T., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+analysis+of+ethanol-induced+locomotor+stimulation+in+Drosophila.">High-resolution analysis of ethanol-induced locomotor stimulation in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (24), 11035-11044 (2002).</li><li>Cohan, F. M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+divergence+under+uniform+selection.+II.+Different+responses+to+selection+for+knockdown+resistance+to+ethanol+among+Drosophila+melanogaster+populations+and+their+replicate+lines.">Genetic divergence under uniform selection. II. Different responses to selection for knockdown resistance to ethanol among Drosophila melanogaster populations and their replicate lines.</a> Genetics. 114 (1), 145-164 (1986).</li><li>Pohl, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+genes+differentially+affect+tolerance+to+ethanol+in+Drosophila.">Circadian genes differentially affect tolerance to ethanol in Drosophila.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 37 (11), 1862-1871 (2013).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epistasis+dominates+the+genetic+architecture+of+Drosophila+quantitative+traits.">Epistasis dominates the genetic architecture of Drosophila quantitative traits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15553-15559 (2012).</li><li>Ehrenreich, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+genetically+complex+traits+with+extremely+large+pools+of+yeast+segregants.">Dissection of genetically complex traits with extremely large pools of yeast segregants.</a> Nature. 464 (7291), 1039-1042 (2010).</li><li>Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+less+traveled:+From+genotype+to+phenotype+in+flies+and+humans.">The road less traveled: From genotype to phenotype in flies and humans.</a> Mammalian Genome. 29, 5-23 (2018).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה, זולה, תפוקה גבוהה להערכת זמן הרגעה עקב חשיפה אתנול ב Drosophila ילה melanogaster. שלא כמו שיטות נוכחיות רבות, הדורשות ניתוח קבוצתי, שיטה זו מאפשרת לאדם אחד לאסוף נתוני זמן הרגעה בודדים עבור ~ 2,000 זבובים בתוך תקופת עבודה של 8 h. מצאנו כי אדם אחד יכול להבקיע 48 זבובים בזמן ההרדמה בערך 5 דקות. בקצב זה, 2,000 זבובים יכולים להיות הבקיע כ 4 h, אם כי הבקיע ניתן לנהל מאוחר יותר. עם הצורך שלנו, זמן ההרדמה מוקלט עבור רוב הזבובים נע בין 5-15 דקות בחשיפה ל 1 mL של 100% אתנול. ריכוזים נמוכים יותר של אתנול או אמצעי מסירה קטנים יותר יגרמו זמני הרגעה ארוכים יותר.
השיטות הנוכחיות להערכת זמן הרגעה דורשות בדיקת מספר גדול של זבובים מבלי לאפשר בקלות מדידות על אנשים בודדים15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. הרגעה ורגישות הנוכחי רבים מוסר להסתמך על ST5022,23,24, הזמן שבו 50% של זבובים הם הרגעה כתוצאה של חשיפה אתנול. למרות השגת ST50 עבור קבוצות של זבובים לא היתה המוטיבציה העיקרית לפיתוח הספק הזה, הקלטות וידאו להפגין שירות גבוה יותר לעומת השיטות הנוכחיות, כמו ההקלטות ניתן להשתמש כדי לוודא את ST50 עבור קבוצות של זבובים נבדק בנפרד כדי למדוד את אחוז הזבובים המקיימים קריטריון נתון (למשל, אובדן של שליטה בדואר) בכל יצוין כי ניתוח וידאו כזה ידרוש זמן נוסף.
בניגוד inebriometer assays הנוכחי, השיטה שאנו מתארים אינו דורש כלים מיוחדים להגדיר וניתן לבצע בכל מעבדה באמצעות חומרים משותפים. באמצעות שיטה זו, הצלחנו להשיג זמן הרגעה אמין ועקבי עבור זבובים בודדים. ניתן להרחיב את האפשרות, בעיקרון, להעריך את השפעות החשיפה לכל חומר נדיף. ניתן גם ליישם את האפשרות למדוד את ההשפעות של רעילות חריפה של וולאטיקלס על חרקים אחרים, כולל מינים אחרים זבוב. בודדים זמן הרגעה נתונים ניתן להשתמש כדי להעריך את מידת וריאציה פנוטימית בתוך אוכלוסיה, כגון DGRP.
השתמשנו שינוי מסך קטן של חרק כדי למנוע מגע ישיר עם פתרון אתנול תוך מתן כמויות נאותה של אדי אתנול כדי להגיע לזבוב. שכבת הגזה הלבנה על גבי רשת שינוי המסך מספקת ניגוד חזותי בין הזבוב לבין המשטח שמתחת ומבטיחה שהזבובים לא יתפסו ברשת שינוי המסך, דבר שעלול להוביל לקביעת הפסד רב-משמעי של איבוד שליטה בדואר. ממברנות זמינים מסחרית כי הם נקבובי למים ואוויר נתן תוצאות לא עקביות היו נחדרת מספיק כדי אדים אתנול. במתכוון השתמשנו בכוונת מסך קטן ברשת החרקים משום שהוא חומר נקבובי אחיד המקזער את הווריאציה בחשיפה לאתנול כתוצאה מתנוחת הזבוב בתוך הבאר. ניתן לבצע שינויים בפרוטוקול זה על בסיס חומרים זמינים, למרות שאנו ממליצים על תא התנהגותי מבוקר, גישה ל-90%-100% אתנול קרוב לזבוב, וחשיפה אחידה לאתנול.
מיקום לטוס בתוך לוחות תרבות התא צריך להיות אקראי בין משכפל כדי למנוע הטיה מיקום. לניסויים גדולים יותר הדורשים שימוש בטיפול זה לאורך ימים מרובים ולכן כפופים לווריאציה סביבתית שיכולה להשפיע על תוצאות הטיפול (למשל, שינויים בלחץ ברומטרי)27, מומלץ מאוד לבדוק זבובים באותו הזמן בכל יום ובאופן אקראי הן בתוך ומעבר לימים, במיוחד אם שורות ו/או
השיטה שפיתחנו מתאימה ביותר למדידת ההשפעה של חשיפה לאלכוהול חריפה אך אינה מתאימה להשגת נתוני צריכה או התמכרות לדוגמנות. אלכוהול הרגעה רגישות נתונים שהתקבלו מתוך הנתון הזה יכול, עם זאת, להיות משולב עם אמצעים אחרים של הקשורות לאלכוהול פנוטיפים. מגבלה אחת של המערכת היא כי הגובה האנכי של הלוחות הסטנדרטיים של תרבות התא מאפשר תנועה לטוס אנכי כי לא ניתן לעקוב בקלות על ידי וידאו להערכה מפורטת של הפעילות הכללית או תנועה. עם זאת, מגבלה זו אינה משפיעה על הערכה מדויקת של זמן ההרדמה. כאשר משתמשים בזבובים של גנוסוגים שונים (למשל, ב-DGRP-נגזר האוכלוסייה28), שיטת הפעולה מאפשרת גם לאחזור של זבובים בודדים כדי לאסוף בריכות של זבובים עם פנוטיפים מנוגדים עבור רצפי DNA בצובר ומיפוי qtl קיצוני29,30. בסך הכל, שיטת הפעולה מאפשרת איסוף מהיר וזול של מידע על הרדמה לאלכוהול על מספר גדול של זבובים בודדים.

המכון הלאומי על אלכוהול התעללות ו אלכוהוליזם מדווח כי ב 2015 צריכת אלכוהול מוגזמת, המיועד כ "הפרעת שימוש באלכוהול", השפיעו על 16,000,000 אנשים בארצות הברית. שימוש לרעה באלכוהול גורם למגוון רחב של תופעות פיזיולוגיות לוואי והוא הגורם העיקרי למוות בארה ב. בבני אדם, רגישות מופחת, או רמה נמוכה של תגובה לאלכוהול, יש מרכיב גנטי חזק והוא קשור לסיכון גבוה יותר לפתח הפרעות שימוש באלכוהול1,2,3,4. מחקרי הסיכון הגנטי על אוכלוסיות אנושיות מאתגרת בגלל מוספים לאוכלוסיה, היסטוריה התפתחותית מגוונת וחשיפות סביבתיות, והסתמכות על שאלונים שדווחו על-ידי ככמת להפנוטיפים הקשורים לאלכוהול, אשר לעיתים קרובות מבולבל בתנאים נוירופסיכיאטריים אחרים.
Drosophila ילה melanoster מספק מודל מצוין כדי ללמוד את התחתון הגנטי של רגישות לאלכוהול5,6,7,8. דגם Drosophila ילה מאפשר שליטה קפדנית על הרקע הגנטי, וכמעט מספר בלתי מוגבל של אנשים מאותו גנוטיפ אותו ניתן לגדל במהירות תחת תנאים סביבתיים מבוקרת היטב ללא הגבלות רגולטוריות בעלות נמוכה יחסית. בנוסף על מוטציות זמינות בפומבי ו rnai קווים היעד רוב הגנים בגנום, הזמינות של הפאנל התייחסות גנטית של drosophila ילה מלאנוסטר (DGRP), אוכלוסיה של 205 שורות מלאות פראי עם רצפי הגנום המלא, אפשרה הגנום9הרחב לימודיהתאגדות 9,10. מחקרים כאלה זיהו רשתות גנטיות הקשורות להשפעות על זמן פיתוח וכדאיות על חשיפה התפתחותית לאתנול11,12. שימור אבולוציוני של תהליכים ביולוגיים בסיסיים מאפשר להסיק מסקנות על ידי הטלת הרושם האנושי על עמיתיהם הטסים.
זבובים חשופים לאתנול עוברים שינויים פיסיולוגיים והתנהגותיים הדומים לשיכרון אלכוהול אנושי, כולל אובדן שליטה בפוסט-טראומטית8, הרגעה ופיתוח של סובלנות13,14,15. ניתן לכמת את השפעת ההרדמה בדרוסופילה באמצעות inebriometers. אלה הם 122 ס מ לאורך עמודות זכוכית אנכית עם מחיצות רשת משופע שבהם זבובים יכולים לצרף16,17,18. קבוצה של לפחות 50 זבובים (המינים יכולים להיות מנותח בנפרד) מוצגים בחלק העליון של הטור וחשופים אדים אתנול. זבובים שאיבדו את השליטה בדואר האלקטרוני נופלים דרך הטור ונאספים במרווחי זמן של 1 דקות. הזמן הממוצע משמש מידה של רגישות הרעלת אלכוהול. כאשר זבובים חשופים אלכוהול בפעם השנייה לאחר שהחלים מן החשיפה הראשונה, הם יכולים לפתח סובלנות, כפי שניכר מתוך משמרת מתכוון הימנעות ממוצע זמן13,15,19,20. בעוד inebriometer בחני הובילו לזיהוי של גנים, רשתות גנטיות, ומסלולים סלולריים הקשורים עם רגישות הרגעה לאלכוהול ופיתוח של סובלנות12,13,14,21, את היכולת לגזול זמן רב, תפוקה נמוכה, ולא יעיל למדידת רגישות לאלכוהול בזבובים בודדים.
הרגעה האתנול האלטרנטיבי בחני כי לא דורשים את הגדרת inebriometer מורכבים לאפשר מדידות נוח יותר אבל הם עדיין מוגבלים תפוקה בדרך כלל דורשים ניתוחים של קבוצות של זבובים ולא יחידים21,22,23,24,25. הערכת זבובים בודדים מקטינה את הפוטנציאל להשפעות מייסדים עקב אינטראקציות קבוצתיות, כגון אלה הנובעות מהתנהגויות חברתיות. כאן, אנו מציגים בקלות, בעלות נמוכה, שיטת תפוקה גבוהה להערכת רגישות הרגעה לאלכוהול במספר גדול של זבובים בודדים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1396px;" width="1396">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">24-well Cell Culture Plates</td>
			<td style="width:207px;">Corning</td>
			<td style="width:128px;">3526</td>
			<td style="width:772px;">Flat-bottomed; will house flies throughout assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Aspirator</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:772px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Cheesecloth</td>
			<td style="width:207px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:128px;">53-100</td>
			<td>Widely available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Ethanol</td>
			<td style="width:207px;">Decon Labs</td>
			<td style="width:128px;">V1001</td>
			<td>Widely available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover)</td>
			<td style="width:207px;">Walmart</td>
			<td style="width:128px;">550098612</td>
			<td>Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Gauze (for aspirator)</td>
			<td style="width:207px;">Honeywell North</td>
			<td style="width:128px;">67622</td>
			<td>Widely available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Illumination Pad</td>
			<td style="width:207px;">Amazon (AGPtek)</td>
			<td style="width:128px;">ASIN B00YA9GP0G</td>
			<td>Any light pad to provide contrast is suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Jumbo Craft Sticks</td>
			<td style="width:207px;">Michaels</td>
			<td style="width:128px;">10334892</td>
			<td>Any craft stick at least 7 cm long is suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">P1000 Pipette Tip (for aspirator)</td>
			<td style="width:207px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:128px;">24-165RL</td>
			<td>Any P1000 pipette tip is suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Serological Pipette (for aspirator)</td>
			<td style="width:207px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:128px;">12-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Small Insect Screen Mesh</td>
			<td style="width:207px;">Lowe&#39;s (Saint-Gobain ADFORS)</td>
			<td style="width:128px;">89322</td>
			<td>Any small insect screen mesh is suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Testing Chamber</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td>Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Tygon Tubing (for aspirator)</td>
			<td style="width:207px;">Grainger</td>
			<td style="width:128px;">9CUG7</td>
			<td>Widely available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Video Camera</td>
			<td style="width:207px;">Canon</td>
			<td>1959C001AA</td>
			<td>Any video camera is suitable.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput method for measuring alcohol sedation time of individual drosophila melanogaster

Drosophila ילה melanoster מספק מודל מצוין כדי ללמוד את התחתון הגנטי של רגישות לאלכוהול. בניגוד למחקרים באוכלוסיות אנושיות, דגם Drosophila ילה מאפשר שליטה קפדנית על רקע גנטי, ולמעשה מספר בלתי מוגבל של אנשים מאותו גנוטיפ ניתן לגדל במהירות בתנאים סביבתיים מבוקרת היטב ללא הגבלות רגולטוריות בעלות נמוכה יחסית. זבובים חשופים לאתנול עוברים שינויים פיסיולוגיים והתנהגותיים הדומים לשכרות אלכוהול אנושיים, כולל אובדן שליטה באמצעות הרדמה, הרגעה ופיתוח של סובלנות. כאן, אנו מתארים פשוט, בעלות נמוכה, התפוקה הגבוהה שיטת להערכת רגישות הרגעה לאלכוהול במספר גדול של זבובים בודדים. העיבוד מבוסס על הקלטת וידאו של זבובים בודדים הציג ללא הרדמה ב 24-היטב לוחיות התרבות התא בהגדרה המאפשרת חניכה סינכרונית של חשיפה לאלכוהול. המערכת מאפשרת לאדם אחד לאסוף נתונים בודדים הרדמה האתנול על רבים כמו 2,000 זבובים בתוך תקופת עבודה של 8 h. האפשרות, בעיקרון, להיות מורחבת כדי להעריך את ההשפעות של חשיפה לכל חומר נדיף ולהחיל על השפעות מדידה של רעילות חריפה של וולאטיקלס על חרקים אחרים, כולל מינים אחרים זבוב.

2 24-גם צלחות microtiter יכול ליצור נתונים בו על 48 זבובים בודדים בתוך קטן כמו 10 דקות. Table 1 רשימות מדידות של זמני הרגעה אתנול עבור 48 בודדים זבובים, זכרים ונקבות בנפרד, של שני קווים DGRP עם רגישויות שונות לחשיפה לאלכוהול על זמן פיתוח ויכולת קיום13. זבובים של קו RAL_555 היו פחות רגישים מאשר קו RAL_177 (איור 4, טבלה 2; p < 0.0001, ANOVA). זכרים ונקבות של RAL_177 הראו לא השפעה מינית (איור 4, שולחן 2; p > 0.1, ANOVA), בעוד נקבות של קו RAL_555 היו רגישים פחות לחשיפה אתנול מאשר הזכרים (איור 4, טבלה 2; p < 0.006, ANOVA). המספר הגדול של הזבובים שניתן למדוד בו זמנית את היכולת למדוד המינים ושורות שונות contemporaneously יכול להגביר את הדיוק על ידי הפחתת שגיאה בשל וריאציה סביבתית.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>קצת.</td>
			<td colspan="6">זמן הרגעה של אתנול</td>
			<td>B.</td>
			<td colspan="6">זמן הרגעה של אתנול</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">נקבות</td>
			<td colspan="3">זכרים</td>
			<td></td>
			<td colspan="3">נקבות</td>
			<td colspan="3">זכרים</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>414</td>
			<td>365</td>
			<td>477</td>
			<td>423</td>
			<td>568</td>
			<td>309</td>
			<td></td>
			<td>937</td>
			<td>742</td>
			<td>622</td>
			<td>460</td>
			<td>331</td>
			<td>498</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>201</td>
			<td>384</td>
			<td>498</td>
			<td>411</td>
			<td>523</td>
			<td>626</td>
			<td></td>
			<td>791</td>
			<td>619</td>
			<td>197</td>
			<td>467</td>
			<td>455</td>
			<td>562</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>228</td>
			<td>364</td>
			<td>333</td>
			<td>440</td>
			<td>403</td>
			<td>267</td>
			<td></td>
			<td>504</td>
			<td>744</td>
			<td>513</td>
			<td>570</td>
			<td>582</td>
			<td>506</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>440</td>
			<td>416</td>
			<td>404</td>
			<td>408</td>
			<td>422</td>
			<td>384</td>
			<td></td>
			<td>970</td>
			<td>540</td>
			<td>369</td>
			<td>865</td>
			<td>533</td>
			<td>492</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>888</td>
			<td>283</td>
			<td>285</td>
			<td>322</td>
			<td>369</td>
			<td>287</td>
			<td></td>
			<td>595</td>
			<td>550</td>
			<td>606</td>
			<td>392</td>
			<td>544</td>
			<td>345</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1079</td>
			<td>519</td>
			<td>315</td>
			<td>393</td>
			<td>376</td>
			<td>284</td>
			<td></td>
			<td>418</td>
			<td>709</td>
			<td>553</td>
			<td>308</td>
			<td>477</td>
			<td>388</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>718</td>
			<td>287</td>
			<td>432</td>
			<td>275</td>
			<td>206</td>
			<td>411</td>
			<td></td>
			<td>366</td>
			<td>564</td>
			<td>558</td>
			<td>385</td>
			<td>576</td>
			<td>377</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>598</td>
			<td>337</td>
			<td>398</td>
			<td>279</td>
			<td>631</td>
			<td>372</td>
			<td></td>
			<td>437</td>
			<td>692</td>
			<td>578</td>
			<td>460</td>
			<td>511</td>
			<td>412</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>241</td>
			<td>398</td>
			<td>364</td>
			<td>347</td>
			<td>374</td>
			<td>808</td>
			<td></td>
			<td>665</td>
			<td>729</td>
			<td>484</td>
			<td>532</td>
			<td>425</td>
			<td>354</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>229</td>
			<td>423</td>
			<td>534</td>
			<td>386</td>
			<td>396</td>
			<td>628</td>
			<td></td>
			<td>312</td>
			<td>576</td>
			<td>305</td>
			<td>334</td>
			<td>531</td>
			<td>506</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>388</td>
			<td>488</td>
			<td>451</td>
			<td>523</td>
			<td>322</td>
			<td>533</td>
			<td></td>
			<td>682</td>
			<td>638</td>
			<td>420</td>
			<td>560</td>
			<td>548</td>
			<td>379</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>252</td>
			<td>529</td>
			<td>375</td>
			<td>427</td>
			<td>330</td>
			<td>540</td>
			<td></td>
			<td>1045</td>
			<td>741</td>
			<td>708</td>
			<td>832</td>
			<td>509</td>
			<td>472</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>674</td>
			<td>401</td>
			<td>303</td>
			<td>401</td>
			<td>307</td>
			<td>311</td>
			<td></td>
			<td>394</td>
			<td>675</td>
			<td>381</td>
			<td>477</td>
			<td>449</td>
			<td>784</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>303</td>
			<td>453</td>
			<td>351</td>
			<td>429</td>
			<td>525</td>
			<td>262</td>
			<td></td>
			<td>540</td>
			<td>690</td>
			<td>520</td>
			<td>556</td>
			<td>495</td>
			<td>226</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>258</td>
			<td>483</td>
			<td>302</td>
			<td>389</td>
			<td>562</td>
			<td>319</td>
			<td></td>
			<td>356</td>
			<td>615</td>
			<td>336</td>
			<td>454</td>
			<td>524</td>
			<td>590</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>346</td>
			<td>426</td>
			<td>385</td>
			<td>416</td>
			<td>596</td>
			<td>287</td>
			<td></td>
			<td>626</td>
			<td>678</td>
			<td>840</td>
			<td>634</td>
			<td>677</td>
			<td>509</td>
		</tr></tbody></table>שולחן 1: מדידות של האתנול פעמים (s) של הDGRP שורות בודדות של (א) קווי הרגעה RAL_177 ו (ב) RAL_555 למינים נפרדים (n = 48). ראה גם טבלה 2, איור 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61108/61108fig4.jpg"> איור 4: זמני הרדמה לאלכוהול של קווי DGRP RAL_177 ו RAL_555. העמודות מייצגות את האמצעים ואת קווי השגיאה SEM (n = 48). זמני הרגעה עבור RAL_177 זבובים היו פחות אלה עבור RAL_55 זבובים (p < 0.0001, ANOVA). נקודות נתונים בודדות מצוינות בטבלה 1. הבדלים משמעותיים סטטיסטית נוספים בין המינים והקווים מצוינים בטקסט ובטבלה 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61108/61108fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>ניתוח</td>
			<td>מקור הווריאציה</td>
			<td>df</td>
			<td>האס</td>
			<td>ערך F</td>
			<td>ערך פי</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">מודל מלא במאגר</td>
			<td>קו</td>
			<td>1</td>
			<td>769627</td>
			<td>34.869</td>
			<td>< 0.0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>סקס</td>
			<td>1</td>
			<td>105001</td>
			<td>4.757</td>
			<td>0.0304</td>
		</tr>
<tr>
<td>קו x סקס</td>
			<td>1</td>
			<td>86021</td>
			<td>3.897</td>
			<td>0.0498</td>
		</tr>
<tr>
<td>שגיאה</td>
			<td>188</td>
			<td>4149491</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">מופחתת מודל נקבות</td>
			<td>קו</td>
			<td>1</td>
			<td>685126</td>
			<td>23.58</td>
			<td>< 0.0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>שגיאה</td>
			<td>94</td>
			<td>2730718</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">מופחתת גברים מודל</td>
			<td>קו</td>
			<td>1</td>
			<td>170522</td>
			<td>11.3</td>
			<td>0.0011</td>
		</tr>
<tr>
<td>שגיאה</td>
			<td>94</td>
			<td>1418774</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">דגם מופחת RAL_177</td>
			<td>סקס</td>
			<td>1</td>
			<td>473</td>
			<td>0.023</td>
			<td>0.8800</td>
		</tr>
<tr>
<td>שגיאה</td>
			<td>94</td>
			<td>1943741</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">דגם מופחת RAL_555</td>
			<td>סקס</td>
			<td>1</td>
			<td>190549</td>
			<td>8.12</td>
			<td>0.0054</td>
		</tr>
<tr>
<td>שגיאה</td>
			<td>94</td>
			<td>2205751</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: ניתוח של סטיה לזמן הרגעה לאורך המין ו DGRP קו. המודל שהיה Y בשימוש היה Y L = μ + s + lxs + ε, כאשר μ הוא הממוצע הכולל, L הוא האפקט הקבוע של הקו DGRP (RAL_177, RAL_555), S הוא האפקט הקבוע של מין (זכר, נקבה), lxs הוא מונח האינטראקציה (קבוע), ו ε הוא מונח השגיאה. המודלים Y = μ + L + ε ו- Y = μ + S + ε שימשו למודלים הפחיתו. קו, סקס, המונח אינטראקציה קו x היחסים היו משמעותיים בדגם המלא ב α < 0.05. מופחת דגמים על ידי סקס DGRP line RAL_555 היו משמעותיים גם ב α < 0.01. ראה גם טבלה 1, איור 4. df = דרגות של חופש, SS = הקלד אני סכומי ריבועים.

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster at JoVE.com

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

שיטות נוכחיות למדידת רגישות האלכוהול בדרוזופילה נועדו לבחון קבוצות של זבובים. אנו מציגים בקלות, בעלות נמוכה, התפוקה גבוהה הערכה להערכת רגישות הרגעה אלכוהול במספר גדול של זבובים בודדים. השיטה אינה דורשת כלים מיוחדים וניתן לבצעו בכל מעבדה המשתמשת בחומרים משותפים.

שיטת תפוקה גבוהה עבור מדידת אלכוהול הרגעה זמן של הפרט דרוזופילה מלאנוגסטר

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human ...

Drosophila מספק מודל מצוין ללמוד את תריסים גנטיים של רגישות לאלכוהול כי אתה יכול לכמת את הרגישות לאלכוהול דווקא תחת רקע גנטי מבוקר ותנאים סביבתיים. השיטות הנוכחיות למדידת רגישות לאלכוהול בקבוצות בדיקה Drosophila של זבובים. אנו מציגים שיטה פשוטה, בעלות נמוכה, תפוקה גבוהה כדי להעריך את הרגישות לאלכוהול במספר רב של זבובים בודדים.וריאציה ברגישות לאלכוהול ב Drosophila ניתן לתרגם פנוטיפים דומים בבני אדם כי זבובים חולקים כ 75% מהגנים שלהם עם אורתולוגים אנושיים. ניתן ליישם את הראיה שפיתחנו גם כדי למדוד את ההשפעות של רעילות חריפה של נדיפים על חרקים אחרים, כולל מיני זבובים אחרים או וקטורים של מחלות. התחל ביצירת תבנית קרטון של צלחת תרבות תאים 24 באר.תאתר את הצלחת, ותחתוך את האזור המיועד. לאחר מכן השתמש בתבנית הקרטון כדי ליצור חתיכת רשת מסך חרקים קטנה בגודל הצלחת. מניחים שורה קטנה של דבק חם סביב ההיקף של צלחת תרבות 24 בארות, ולהדביק את רשת המסך על גבי הבארים.לאחר מכן השתמש באקדח הדבק החם כדי לאבטח מקל מלאכה מעץ לשלושה צדדים של צלחת התרבות. הכינו כמה שיותר צלחות שיכולות להתאים לתא הצילום. כדי ליצור את תא הצילום, לחתוך חור בגודל של עדשת מצלמת וידאו בצד אחד של תיבת פוליסטירן וחץ נוסף על גודל כרית התאורה בצד הנגדי.הכנס את כרית התאורה לתוך ההארכה, והצב את המצלמה בחור העדשה מעל כרית התאורה. מניחים את כל חומרי הבדיקה בסביבה מבוקרת, רצוי תא התנהגותי עם כ 30% לחות, 25 מעלות צלזיוס טמפרטורה, זרימת אוויר אחידה, ורמות רעש פחות מ 65 דציבלים. השתמש בתבנית הקרטון שנעשתה בעבר כדי לחתוך שתי חתיכות של מטלית גבינה.ואז פיפטה מיליליטר אחד של 100% אתנול דרך רשת המסך לתוך כל באר. מייבשים את רשת, ומ מניחים את שתי חתיכות הגבינה על גבי. חותכים חתיכה קטנה של קרש חיתוך דק, גמיש, פלסטיק באמצעות תבנית קרטון כמדריך להרחבת האזור על ידי אחד עד שני סנטימטרים על אחד הצדדים הקצרים.לאחר החיתוך, ודא כי הפלסטיק עדיין מתאים בין שלושת מקלות מלאכה עץ על מנגנון הבדיקה אבל תלוי בקצה אחד. הכינו שאפתן לפי הוראות כתב היד, ולהשתמש בו כדי להעביר זבוב אחד לתוך צלחת תרבות תאים 24 בארות, מכסה את כל הבארים עם זבובים שאפו בעבר עם פלסטיק גמיש. רשום את מיקום הבאר ואת כל המידע הרלוונטי של גנוטיפ או פנוטיפ של כל זבוב.החזק את סומק פלסטיק גמיש עם החלק העליון של צלחת תרבות התא המכיל את הזבובים, ולהפוך את הצלחת על החלק העליון של צלחת תרבות התא שונה עם אתנול. השתמש במקלות מלאכה כדי ליישר את צלחת תרבות התא ההפוך, לוודא כי כל טוב עם אתנול מתיישר עם כל באר המכילה זבוב. ודאו שפד התאורה דולק במלוא הבהירות, והתחלו להקליט באמצעות מצלמת הווידאו.חשוף את הזבובים לאתנול על ידי הסרה זהירה של הפלסטיק בין שתי הצלחות, הקפד לא לנתק את מטלית הגבינה. כאשר יש חשד כי כל הזבובים איבדו שליטה יציבה, הקש בחוזקה במרכז הצלחת. אם יש תנועה, המשיכו להקליט, הקשה כל דקה עד שתי דקות עד שלא תתרחש תנועה.סיים את ההקלטה ברגע שאין תנועה. כדי לשחזר את הזבובים, להסיר את הצלחת העליונה מן מנגנון הבדיקה, ולזעוף בודדים לתוך מיכלים שנבחרו. החלף את האתנול צלחות תאים שונה לפחות פעם בשעה כדי לשמור על חשיפה אתנול עקבי לאורך כל ההתמדה, ולחזור על הניסוי עבור דגימות רבות ככל הרצוי.צפה בהקלטת הווידאו כדי לקבוע את זמן הרגעה לטוס, אשר מוגדר כרגע זבוב מאבד שליטה יציבה ויכולת לוקומוטור. כדי להבטיח דיוק, צפה בסרט הפוך והקליט את הזמן שבו הזבוב מתחיל לנוע. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי ליצור נתונים על מספר גדול של זבובים בתוך 10 דקות.שתי צלחות 24 באר שימשו בו זמנית למדוד זמני סם אתנול עבור 48 זבובים בודדים של שני קווי DGRP עם רגישויות שונות לאלכוהול. גדלי מדגם גדולים מגבירים את הדיוק ומפחיתים את השגיאה לשינויים סביבתיים. RAL_555 היו פחות רגישים מזבובי RAL-177.זכרים ונקבות RAL_177 לא הראו השפעה שונה מבחינה מינית, ואילו הנקבות של קו RAL_555 היו פחות רגישות לחשיפה לאתנול מאשר הזכרים. כאשר מנסים פרוטוקול זה, חיוני לבצע את השאיפה של זבובים היפוך של צלחת תרבות התא עם דיוק כדי להשיג את התוצאה הרצויה. מאז היכולת להעריך זבובים בודדים נמנע השפעות מבלבלות עקב אינטראקציות קבוצתיות, הערכה זו משפרת את התועלת של מודל Drosophila עבור מחקרים תפוקה גבוהה על השפעות חריפות של חשיפה לאלכוהול.

Research

JoVE Journal

Behavior

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Moderate Prenatal Alcohol Exposure and Quantification of Social Behavior in Adult Rats

חשיפה לפני הלידה אלכוהול מתונה וכימות של התנהגות חברתית בחולדות מבוגרות

Alterations in social behavior are among the major negative consequences observed in children with Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). Several ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

מכרסמים מוח Microinjection לחקר מולקולריים מצעים של התנהגות מוטיבציה

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

A Method for Evaluating the Reinforcing Properties of Ethanol in Rats without Water Deprivation, Saccharin Fading or Extended Access Training

שיטה להערכת מאפייני החיזוק של אתנול בחולדות ללא מצוקת מים, סכרין Fading או הדרכת גישה מורחבת

Operant oral self-administration methods are commonly used to study the reinforcing properties of ethanol in animals. However, the standard methods ...

The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse

מבחן עייפות הליכון: A Assay פשוט, תפוקה גבוהה של התנהגות העייפות דמוית עבור העכבר

Fatigue is a prominent symptom in many diseases and disorders and reduces quality of life for many people. The lack of clear pathogenesis and failure of ...

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

שיטה לבחינת ההשפעה של רמזים סביבתיים על התנהגות ההזדווגות ב<em&gt; תסיסנית מלנוגאסטר</em

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

וזמינותו נובר/למנהור עבור זיהוי של היפוקסיה ב הזחלים דרוזופילה melanogaster

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Noninvasive, High-throughput Determination of Sleep Duration in Rodents

נחישותם לא פולשנית, תפוקה גבוהה של משך השינה בחולדות

Traditionally, sleep is monitored by an electroencephalogram (EEG). EEG studies in rodents require surgical implantation of the electrodes followed by a ...

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

שיטה אוטומטית כדי לקבוע את הביצועים של דרוזופילה בתגובה לשינויים בטמפרטורה בחלל ובזמן

Temperature is a ubiquitous environmental factor that affects how species distribute and behave. Different species of Drosophila fruit flies have specific ...

Multi-Modal Signals for Analyzing Pain Responses to Thermal and Electrical Stimuli

אותות ומשולבות לניתוח כאב תגובות לגירויים תרמי וחשמל

The assessment of pain relies mostly on methods that require a person to communicate. However, for people with cognitive and verbal impairments, existing ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

מבחנים וכלים משופרים למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...