Name: high-throughput method for measuring alcohol sedation time of individual drosophila melanogaster
Uploaded: 2020-04-20T13:00:00
Duration: 6 min 15 s
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이 작품은 TFCM 및 RRHA에 건강의 국가 학회에서 보조금 DA041613 및 GM128974에 의해 지원되었다.

1. 시험 장치의 건설
<ol><li>골판지의 판주 를 추적하고 지정된 영역을 절단하여 24 웰 셀 배양 판의 크기의 판지 템플릿을 만듭니다.</li>
	<li>1.1 단계에서 판지 템플릿을 사용하여 세포 배양 판의 크기를 메쉬 작은 곤충 스크린의 조각을 잘라.</li>
	<li>핫 글루 건을 사용하여 플레이트 상단의 둘레에 작은 열접착제 라인을 배치하고 열린 웰 위에 스크린 메쉬를 부착하여 24 웰 셀 배양 플레이트를 준비합니다.</li>
	<li>열간 접착제 총을 사용하여 1.3 단계에서 동일한 세포 배양 판의 3면 각각에 나무 공예 스틱을 고정합니다. 수정된 세포 배양 플레이트는 이제 그림 1A에 표시된 플레이트 다이어그램과 유사해야 하며 그림 2에표시된 실험 설정과 유사해야 합니다. 참고 : 촬영 실에 맞는 만큼 적어도 많은 세포 배양 플레이트를 준비하십시오 (아래 참조).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61108/61108fig1.jpg"> 그림 1: 시험 장치 및 촬영 챔버의 다이어그램. (A)상위 다이어그램. 시험 장치의 상단, 측면 및 전면 뷰가 각각 도시됩니다. 스크린 메쉬는 24웰 셀 배양 플레이트 위에 평평하게 놓습니다. 화살촉으로 표현된 나무 공예 스틱은 안정성과 정렬 보조를 위해 인접한 세 면에 부착되어 있으며, 두 개는 웰 플레이트 측면에 6개의 우물과 4개의 우물이 있는 플레이트 측면에 부착되어 있습니다. 모든 부착물은 기기에 뜨겁게 부착됩니다. (B)아래쪽 다이어그램. 분석 설정의 상단, 측면 및 전면 뷰가 각각 표시됩니다. 슬릿은 상자의 오른쪽에, 뚜껑의 개구부에서 개구부 뒤쪽까지, 슬릿 레벨의 바닥은 내부 표면으로 절단됩니다. 상자 상단의 구멍, 지면과 평행한 표면은 최대 비디오 노출을 위해 중앙에 배치됩니다. 그늘진 상자는 비디오 카메라를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61108/61108fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61108/61108fig2.jpg"> 그림 2: 분석 시스템의 사진. 비디오 카메라는 도 1B의다이어그램에 예시 된 컷 아웃 구멍에 삽입 된 렌즈와 함께 폴리스티렌 챔버 의 상단에 배치됩니다. 수정된 24웰 세포 배양 플레이트의 두 세트는 챔버의 측면을 통해 슬릿에 삽입되는 조명 패드 의 상부에 놓습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61108/61108fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2. 촬영실 의 건설
<ol><li>폴리스티렌 상자 의 측면에 있는 비디오 카메라 렌즈 크기의 구멍을 절단하여 촬영 챔버를 만듭니다. 폴리스티렌 상자의 반대쪽에 조명 패드의 폭을 추가로 잘라. 촬영실은 그림 1B 및 그림 2에표시된 촬영 실과 유사해야 합니다.</li>
	<li>조명 패드를 슬릿에 삽입하고 조명 패드 위의 렌즈 구멍에 카메라를 배치하여 사용할 촬영 챔버를 준비합니다.</li>
	<li>모든 재료를 배치하고 제어 된 환경에서 모든 후속 테스트를 수행, 바람직하게는 약 30 % 습도, 25 ° C 온도, 균일 한 공기 흐름, 65 dB 미만의 소음 수준행동 챔버.</li>
</ol>3. 시험 기구의 준비 및 파리
<ol><li>100% 에탄올의 파이펫 1 mL은 각 우물에 스크린 메쉬를 통해.</li>
	<li>치즈 천 조각으로 스크린 메쉬를 건조.</li>
	<li>1.1단계에서 작성된 골판지 템플릿을 사용하여 세포 배양 판의 치수를 치즈 클로스 두 조각을 잘라냅니다. 3.2단계에서 에탄올을 함유하는 변형된 세포 배양판의 건조스크린 메쉬 위에 놓는다.</li>
	<li>1.1단계에서 일반적인 가이드로 작성된 골판지 템플릿을 추적하고 짧은 면 중 하나에서 추적 된 영역을 1-2cm 확장하여 얇고 유연한 플라스틱 도마의 작은 조각을 만듭니다. 얇고 유연한 플라스틱 도마에서 확장된 트레이스드 영역을 잘라냅니다. 절단 후, 플라스틱은 여전히 테스트 장치에 세 개의 나무 공예 스틱 사이에 맞는 있는지 확인하지만, 1-2cm에 의해 한쪽 끝을 중단합니다.</li>
	<li>(선택 사항) 흡입기를 만들어야 하는 경우 먼저 P1000 파이펫 팁을 반으로 절단하여 그림 3에 표시된 것과 같은 흡인기를 조립합니다. 큰 직경의 조각을 ~ 30cm 의 유연한 튜브 조각의 한쪽 끝에 삽입하여 마우스 피스역할을합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61108/61108fig3.jpg"> 그림 3 : 플라이 가제 스토퍼와 유연한 튜브에 부착 된 교환 마우스 피스와 넓은 보어 혈청 피펫으로 파리수집되는 비행 흡입기. 작업자는 마취 없이 이송을 위해 파이펫에 단일 플라이를 흡인할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61108/61108fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="6"><li>(선택 사항) 흡입기 어셈블리를 완료하려면, 튜브에 들어가는 파리를 방지하기 위해 거즈와 혈청 피펫의 10cm 조각의 넓은 끝을 커버하고 먼저, 배관의 열린 끝에, 거즈를 삽입하여 플라이 챔버 역할을합니다. 지피어레이터는 그림 3에표시된 것과 유사해야 합니다.</li>
	<li>흡입기(그림3,단계 3.5 및 3.6)를 사용하여, 흡인1편을 별도의 24웰 세포 배양 플레이트로 잘 비행한다. 유연한 플라스틱을 사용하여 이전에 흡인된 파리가 들어 있는 모든 우물을 덮으세요. 각 비행의 유정 위치 및 관련 유전자형 또는 표현형 정보를 기록합니다.</li>
	<li>파리를 함유하는 세포 배양 플레이트의 상부와 함께 유연한 플라스틱 플러시를 잡고 그들의 탈출을 방지하고 에탄올과 함께 변형된 세포 배양 판의 상부에 플레이트를 반전시킨다. 유연한 플라스틱 시트는 치즈 천의 시트 위에 휴식해야합니다. 크래프트 스틱을 사용하여 파리를 포함하는 거꾸로 된 세포 배양 플레이트를 정렬하여 각 우물에 에탄올이 정렬되도록 하여 파리를 포함하는 각 우물을 정렬합니다.</li>
	<li>실험 설정은 그림 2와유사해야 합니다.</li>
</ol>4. 파리 테스트
<ol><li>조명 패드가 최대 시각적 대비를 위해 최대 밝기로 켜져 있는지 확인합니다. 비디오 카메라로 녹화를 시작합니다.</li>
	<li>파리를 에탄올에 노출시키기 위해, 조심스럽게 치즈 천을 빼내지 않도록주의, 잘 접시와 테스트 장치 사이의 플라스틱을 제거합니다.</li>
	<li>모든 파리가 자세 제어를 잃은 후 비디오 녹화를 종료합니다. 모든 파리가 자세 제어를 잃은 것으로 의심되면, 모든 파리가 자세 제어의 완전한 손실을 가지고 있는지 확인하기 위해 접시의 중앙에 단단히 누릅니다. 움직임이 있는 경우 계속 기록합니다. 움직임이 없을 때까지 주기적으로(1-2분마다) 계속 탭하십시오.</li>
	<li>(선택 사항) 파리를 신속하게 복구하려면 테스트 장치에서 상단 플레이트만 제거하여 치즈 천에 놓인 진정된 파리를 드러냅니다. 인해수 개별 복구를 위해 선택한 컨테이너로 날아갑니다.</li>
	<li>변형된 세포 배양 플레이트에서 에탄올을 1mL의 신선한 100% 에탄올로 매시간 1회 이상 교체하여 에탄올의 증발 및 가습을 제어하고 분석결과 전반에 걸쳐 일관된 에탄올 노출을 유지한다. 치즈 천으로 스크린 메쉬를 건조.</li>
	<li>원하는 만큼 샘플을 반복합니다. 참고: 처리량이 가장 높은 경우 비디오 녹화 중에 다음 라운드의 파리를 새 셀 배양 플레이트에 흡인합니다. 비디오 녹화는 나중에 검토할 수 있기 때문에 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 비행 침전 시간의 결정
<ol><li>비디오 녹화를 시청하여 각 개인의 비행에 대한 녹음 시간을 기록합니다. 침전 시간은 비행이 완전한 자세 제어 및 운동 능력을 잃는 순간으로 정의됩니다. 영화를 역으로 보고 정확도를 보장하기 위해 비행이 움직이기 시작하는 시간을 기록하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Heath, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+differences+in+alcohol+sensitivity+and+the+inheritance+of+alcoholism+risk.">Genetic differences in alcohol sensitivity and the inheritance of alcoholism risk.</a> Psychological Medicine. 29 (5), 1069-1081 (1999).</li><li>Schuckit, M. A., Smith, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationships+of+a+family+history+of+alcohol+dependence,+a+low+level+of+response+to+alcohol+and+six+domains+of+life+functioning+to+the+development+of+alcohol+use+disorders.">The relationships of a family history of alcohol dependence, a low level of response to alcohol and six domains of life functioning to the development of alcohol use disorders.</a> Journal of Studies on Alcohol. 61 (6), 827-835 (2000).</li><li>Trim, R. 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저자는 공개 할 것이 없다.

여기에서, 우리는 Drosophila melanogaster에있는 에탄올 노출 때문에 침전 시간을 평가하기 위한 간단하고, 저렴하고, 높은 처리량 방법을 제시합니다. 그룹 분석을 요구하는 많은 현재 방법과는 달리,이 분석은 한 사람이 8 시간 작업 기간 내에 ~ 2,000 파리에 대한 개별 적인 침동 시간 데이터를 수집 할 수 있습니다. 우리는 한 사람이 약 5 분 동안 식도 시간에 대한 48 파리를 득점 할 수 있음을 발견했다. 이 속도로, 2,000 파리는 약 4 시간에서 득점 할 수 있지만, 점수는 나중에 수행 할 수 있습니다. 우리의 분석으로, 대부분의 파리에 대한 기록 된 침전 시간은 100 % 에탄올의 1 mL에 노출5-15 분 범위. 에탄올농도가 낮거나 전달량이 작을수록 신분 공급 시간이 길어집니다.
침전 시간을 평가하기위한 현재의 방법은 쉽게 단일 개인15,,16,,17,,18,,19,,20,21,,22,23,,24,,25,26에대한 측정을 가능하게하지 않고 파리의 큰 숫자를 테스트해야합니다. 많은 현재 진정 및 감도 측정은 ST5022,,23,,24,파리의 50 %가 에탄올 노출의 결과로 진정되는 시점에 의존합니다. 파리 그룹에 대한 ST50을 획득하는 것이 이 분석법을 개발하는 주된 동기는 아니었지만, 비디오 녹화는 개별적으로 테스트된 파리의 그룹에 대한 ST50을 확인하고 주어진 기준(예: 자세 제어 상실)을 충족하는 파리의 백분율을 측정하는 데 사용될 수 있기 때문에 현재 방법에 비해 더 높은 유틸리티를 보여줍니다. 이러한 비디오 분석에는 추가 시간이 필요하다는 점에 유의해야 합니다.
현재 의 무당계 측정법과는 달리, 우리가 설명하는 방법은 설치하기 위하여 전문화한 공구를 요구하지 않으며 일반적인 물자를 사용하여 어떤 실험실든지에서 수행될 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 개별 파리에 대한 안정적이고 일관된 완화 시간을 얻었습니다. 이 분석은 원칙적으로 휘발성 물질에 대한 노출의 영향을 평가하기 위해 확장될 수 있습니다. 이 분석은 또한 다른 비행 종을 포함한 다른 곤충에 대한 휘발성 의 급성 독성의 영향을 측정하기 위해 적용 될 수있다. 개별 적인 축삭 시간 데이터는 DGRP와 같은 인구 내의 표현형 변화의 정도를 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다.
우리는 에탄올 용액과의 직접적인 접촉을 방지하는 동시에 충분한 양의 에탄올 증기가 파리에 도달할 수 있도록 작은 곤충 스크린 메쉬를 사용했습니다. 화면 메쉬 위에 있는 흰색 치즈 천 레이어는 플라이와 아래 표면 사이의 시각적 대비를 제공하며 파리가 화면 메시에 걸리지 않도록 하여 자세 제어손실의 모호한 결정을 초래할 수 있습니다. 물과 공기에 다공성인 시판되는 멤브레인은 일관성 없는 결과를 주었으며 에탄올 증기에 불충분하게 침투할 수 없었습니다. 우물 내 의 플라이 위치의 결과로 에탄올 노출의 변동을 최소화하는 균일한 다공성 물질이기 때문에 의도적으로 작은 곤충 스크린 메쉬를 사용했습니다. 사용 가능한 물질에 따라 이 프로토콜을 수정할 수 있지만, 제어된 행동 챔버, 비행에 가까운 90%-100% 에탄올에 대한 접근, 균일한 에탄올 노출을 권장합니다.
세포 배양 플레이트 내의 플라이 위치는 위치 편향을 피하기 위해 복제 사이에 무작위로 배정되어야 합니다. 여러 날에 걸쳐 이 분석법의 사용을 요구하고 따라서 분석 결과에 영향을 미칠 수 있는 환경 적 변화의 대상이 되는 더 큰 실험(예를 들어, 기압의변화)(27)의경우, 특히 다른 선 및/또는 성별을 서로 비교해야 하는 경우, 매일 같은 시간에 파리를 테스트하고 며칠 동안 무작위로 테스트하는 것이 좋습니다.
우리가 개발한 방법은 급성 알콜 노출의 효력을 측정하는 위해 가장 적합하지만 소비 데이터를 얻거나 모델링 중독을 얻기에는 적합하지 않습니다. 그러나 이 분석에서 얻은 알코올 중독 민감도 데이터는 알코올 관련 표현형의 다른 측정값과 통합될 수 있다. 시스템의 한 가지 제한은 표준 세포 배양 판의 수직 높이가 전체 활동 이나 운동의 상세한 평가를 위해 비디오로 쉽게 추적 할 수없는 수직 비행 운동을 허용한다는 것입니다. 그러나 이러한 제한은 침전 시간의 정확한 평가에 영향을 미치지 않습니다. 다른 유전자형의 파리를 사용하는 경우 (예를 들어, DGRP 유래 아웃브레드 집단28에서),이 분석은 또한 대량 DNA 염기서열 분석 및 극단적인 QTL 매핑을 위한 대조적인 표현형을 가진 파리의 풀을 수집하는 개별 파리의 회수를 가능하게 한다29,,30. 전반적으로, 이 분석은 단일 파리의 큰 숫자에 알코올 중독 데이터의 신속하고 저렴한 수집을 허용합니다.

알코올 남용 및 알코올 중독에 국가 학회 보고 2015 과도 한 알코올 소비, 로 지정 된 "알코올 사용 장애", 미국에서 추정된 1,600 만 명에 영향을. 알코올 남용 불리 한 생리 효과의 넓은 범위를 발생 하 고 미국에서 죽음의 주요 원인. 인간에서는, 감소된 감도, 또는 알콜에 반응의 낮은 수준은, 강한 유전 성분이 있고 알콜 사용 무질서1,2,23,및4를 개발의 고위험과 연관됩니다. 인간 인구에 대한 유전 적 위험 연구는 인구 혼화제, 다양한 발달 역사 및 환경 노출, 그리고 종종 다른 신경 정신 질환과 혼동되는 알코올 관련 표현형을 정량화하기 위해 자가보고 설문지에 의존하기 때문에 도전적입니다.
Drosophila melanogaster는 알콜 감도5,,6,,7,,8의유전 기초를 공부하는 우수한 모형을 제공합니다. Drosophila 모형은 유전 배경에 엄격한 통제를 허용하고, 동일 유전자형의 개별의 거의 무제한 수는 규정제한 없이 그리고 상대적으로 낮은 비용으로 잘 통제된 환경 조건 하에서 급속하게 양육될 수 있습니다. 게놈에 있는 유전자의 대다수를 표적으로 하는 공개적으로 이용 가능한 돌연변이 및 RNAi 선 이외에, Drosophila melanogaster 유전 참조 패널 (DGRP)의 가용성, 완전한 게놈 서열을 가진 205의 근친 야생 유래 선의 인구, 게놈 전체 협회연구9,10를가능하게 했습니다. 이러한 연구는 에탄올11,,12에대한 발달 노출 시 개발 시간 및 생존 가능성에 미치는 영향과 관련된 유전 네트워크를 확인했습니다. 근본적인 생물학적 과정의 진화적 보존을 통해 인간 직립을 플라이 에 중첩시켜 번역 추론을 그릴 수 있습니다.
에탄올에 노출된 파리는 자세 조절8,침전, 내성 발달 을 포함하여 인간의 알코올 중독과 유사한 생리적 및 행동적 변화를 겪는다13,,14,,15. 초파리에서 알코올 유도 된 침열은 불청체계를 사용하여 정량화 될 수있다. 이들은파리가 16,,17,18을부착 할 수있는 경사진 메쉬 파티션이있는 122cm 길이의 수직 유리 기둥입니다., 적어도 50개의 파리(남녀는 별도로 분석될 수 있음)의 그룹이 컬럼의 상단에 도입되어 에탄올 증기에 노출된다. 자세 제어를 잃은 파리는 열을 통해 떨어지고 1 분 간격으로 수집됩니다. 평균 용출 시간은 알코올 중독에 대한 민감도의 척도역할을 합니다. 파리가 첫 번째 노출에서 회복 한 후 두 번째로 알코올에 노출되면 평균 용출 시간13,,15,,19,,20의변화에서 알 수 있듯이 허용 오차를 개발할 수 있습니다. 비ebriometer 분석은 알콜 침전 감도 및 내성의 발달과 관련되었던 유전자, 유전 네트워크 및 세포 통로의 확인으로 이끌어 내고 있는 반면12,,13,,14,,21,분석제는 시간 소모적이고, 낮은 처리량, 및 단일 파리에서 알콜 감도를 측정하기 위한 비효과이다.
치밀한 비단수계 설정이 필요하지 않은 대체 에탄올 침전 분석은 보다 편리한 측정을 허용하지만 여전히 처리량이 제한되어 있으며 일반적으로 개인,21, 22,23,,2324,,25가아닌 파리 그룹의 분석을 필요로 한다., 단일 파리를 평가하는 것은 사회적 행동에서 비롯된 것과 같은 집단 상호 작용으로 인한 혼란스러운 영향의 가능성을 최소화합니다. 여기에서는 많은 수의 단일 파리에서 알코올 감산 도/위를 평가하기 위한 간단하고 저렴한 고처리량 분석서를 제시합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1396px;" width="1396">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">24-well Cell Culture Plates</td>
			<td style="width:207px;">Corning</td>
			<td style="width:128px;">3526</td>
			<td style="width:772px;">Flat-bottomed; will house flies throughout assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Aspirator</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:772px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Cheesecloth</td>
			<td style="width:207px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:128px;">53-100</td>
			<td>Widely available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Ethanol</td>
			<td style="width:207px;">Decon Labs</td>
			<td style="width:128px;">V1001</td>
			<td>Widely available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover)</td>
			<td style="width:207px;">Walmart</td>
			<td style="width:128px;">550098612</td>
			<td>Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Gauze (for aspirator)</td>
			<td style="width:207px;">Honeywell North</td>
			<td style="width:128px;">67622</td>
			<td>Widely available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Illumination Pad</td>
			<td style="width:207px;">Amazon (AGPtek)</td>
			<td style="width:128px;">ASIN B00YA9GP0G</td>
			<td>Any light pad to provide contrast is suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Jumbo Craft Sticks</td>
			<td style="width:207px;">Michaels</td>
			<td style="width:128px;">10334892</td>
			<td>Any craft stick at least 7 cm long is suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">P1000 Pipette Tip (for aspirator)</td>
			<td style="width:207px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:128px;">24-165RL</td>
			<td>Any P1000 pipette tip is suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Serological Pipette (for aspirator)</td>
			<td style="width:207px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:128px;">12-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Small Insect Screen Mesh</td>
			<td style="width:207px;">Lowe&#39;s (Saint-Gobain ADFORS)</td>
			<td style="width:128px;">89322</td>
			<td>Any small insect screen mesh is suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Testing Chamber</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td>Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Tygon Tubing (for aspirator)</td>
			<td style="width:207px;">Grainger</td>
			<td style="width:128px;">9CUG7</td>
			<td>Widely available.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Video Camera</td>
			<td style="width:207px;">Canon</td>
			<td>1959C001AA</td>
			<td>Any video camera is suitable.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput method for measuring alcohol sedation time of individual drosophila melanogaster

드로소필라 멜라노가스터는 알코올 민감도의 유전적 기초를 연구하는 훌륭한 모델을 제공한다. 인간 인구에 있는 연구 결과와는 대조적으로, Drosophila 모형은 유전 배경에 엄격한 통제를 허용하고, 동일 유전자형의 개별의 거의 무제한 수는 규정제한 없이 그리고 상대적으로 낮은 비용으로 잘 통제된 환경 조건 하에서 급속하게 양육될 수 있습니다. 에탄올에 노출된 파리는 자세 조절, 침전 및 내성 발달을 포함하여 인간의 알코올 중독과 유사한 생리적 및 행동적 변화를 겪습니다. 여기에서는 많은 수의 단일 파리에서 알코올 감산 도/위를 평가하기 위한 간단하고 저렴한 고처리량 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 알코올 노출의 동기 개시를 가능하게 하는 셋업에서 24웰 세포 배양 플레이트에서 마취 없이 도입된 단일 파리의 비디오 녹화를 기반으로 합니다. 이 시스템은 한 사람이 8 시간 작업 기간 내에 최대 2,000 개의 파리에 대한 개별 에탄올 매연 데이터를 수집 할 수 있게합니다. 이 분석은 원칙적으로 모든 휘발성 물질에 대한 노출의 영향을 평가하기 위해 확장될 수 있으며 다른 비행 종을 포함한 다른 곤충에 대한 휘발성 물질의 급성 독성의 영향을 측정하기 위해 적용될 수 있습니다.

2개의 24웰 마이크로티터 플레이트는 10분 이내에 48개의 개별 파리에 대한 데이터를 동시에 생성할 수 있습니다. 표 1은 개발 시간 및 생존 가능성에 대한 알코올 노출에 다른 감도를 가진 2개의 DGRP 라인의 48개의 개별 파리, 수컷 및 암컷을 위한 에탄올 침전 시간의 측정값을 나열합니다13. RAL_555 선의 파리는 라인 RAL_177 덜 민감했다(그림 4, 표 2;p < 0.0001, ANOVA). RAL_177 남성과 여성은 성적 이형성 효과를 나타내지 않았다(도 4, 표 2;p > 0.1, ANOVA), 라인 RAL_555 여성의 경우 남성보다 에탄올 노출에 덜 민감했다(그림 4, 표 2;p < 0.006, ANOVA). 동시에 측정할 수 있는 많은 수의 파리와 남녀 및 다른 라인을 동시에 측정할 수 있는 능력은 환경 변화로 인한 오차를 줄임으로써 정확도를 높일 수 있습니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>A.</td>
			<td colspan="6">에탄올 채도 시간 (들)</td>
			<td>B.</td>
			<td colspan="6">에탄올 채도 시간 (들)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="3">여성</td>
			<td colspan="3">남성</td>
			<td></td>
			<td colspan="3">여성</td>
			<td colspan="3">남성</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>414</td>
			<td>365</td>
			<td>477</td>
			<td>423</td>
			<td>568</td>
			<td>309</td>
			<td></td>
			<td>937</td>
			<td>742</td>
			<td>622</td>
			<td>460</td>
			<td>331</td>
			<td>498</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>201</td>
			<td>384</td>
			<td>498</td>
			<td>411</td>
			<td>523</td>
			<td>626</td>
			<td></td>
			<td>791</td>
			<td>619</td>
			<td>197</td>
			<td>467</td>
			<td>455</td>
			<td>562</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>228</td>
			<td>364</td>
			<td>333</td>
			<td>440</td>
			<td>403</td>
			<td>267</td>
			<td></td>
			<td>504</td>
			<td>744</td>
			<td>513</td>
			<td>570</td>
			<td>582</td>
			<td>506</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>440</td>
			<td>416</td>
			<td>404</td>
			<td>408</td>
			<td>422</td>
			<td>384</td>
			<td></td>
			<td>970</td>
			<td>540</td>
			<td>369</td>
			<td>865</td>
			<td>533</td>
			<td>492</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>888</td>
			<td>283</td>
			<td>285</td>
			<td>322</td>
			<td>369</td>
			<td>287</td>
			<td></td>
			<td>595</td>
			<td>550</td>
			<td>606</td>
			<td>392</td>
			<td>544</td>
			<td>345</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1079</td>
			<td>519</td>
			<td>315</td>
			<td>393</td>
			<td>376</td>
			<td>284</td>
			<td></td>
			<td>418</td>
			<td>709</td>
			<td>553</td>
			<td>308</td>
			<td>477</td>
			<td>388</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>718</td>
			<td>287</td>
			<td>432</td>
			<td>275</td>
			<td>206</td>
			<td>411</td>
			<td></td>
			<td>366</td>
			<td>564</td>
			<td>558</td>
			<td>385</td>
			<td>576</td>
			<td>377</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>598</td>
			<td>337</td>
			<td>398</td>
			<td>279</td>
			<td>631</td>
			<td>372</td>
			<td></td>
			<td>437</td>
			<td>692</td>
			<td>578</td>
			<td>460</td>
			<td>511</td>
			<td>412</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>241</td>
			<td>398</td>
			<td>364</td>
			<td>347</td>
			<td>374</td>
			<td>808</td>
			<td></td>
			<td>665</td>
			<td>729</td>
			<td>484</td>
			<td>532</td>
			<td>425</td>
			<td>354</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>229</td>
			<td>423</td>
			<td>534</td>
			<td>386</td>
			<td>396</td>
			<td>628</td>
			<td></td>
			<td>312</td>
			<td>576</td>
			<td>305</td>
			<td>334</td>
			<td>531</td>
			<td>506</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>388</td>
			<td>488</td>
			<td>451</td>
			<td>523</td>
			<td>322</td>
			<td>533</td>
			<td></td>
			<td>682</td>
			<td>638</td>
			<td>420</td>
			<td>560</td>
			<td>548</td>
			<td>379</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>252</td>
			<td>529</td>
			<td>375</td>
			<td>427</td>
			<td>330</td>
			<td>540</td>
			<td></td>
			<td>1045</td>
			<td>741</td>
			<td>708</td>
			<td>832</td>
			<td>509</td>
			<td>472</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>674</td>
			<td>401</td>
			<td>303</td>
			<td>401</td>
			<td>307</td>
			<td>311</td>
			<td></td>
			<td>394</td>
			<td>675</td>
			<td>381</td>
			<td>477</td>
			<td>449</td>
			<td>784</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>303</td>
			<td>453</td>
			<td>351</td>
			<td>429</td>
			<td>525</td>
			<td>262</td>
			<td></td>
			<td>540</td>
			<td>690</td>
			<td>520</td>
			<td>556</td>
			<td>495</td>
			<td>226</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>258</td>
			<td>483</td>
			<td>302</td>
			<td>389</td>
			<td>562</td>
			<td>319</td>
			<td></td>
			<td>356</td>
			<td>615</td>
			<td>336</td>
			<td>454</td>
			<td>524</td>
			<td>590</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>346</td>
			<td>426</td>
			<td>385</td>
			<td>416</td>
			<td>596</td>
			<td>287</td>
			<td></td>
			<td>626</td>
			<td>678</td>
			<td>840</td>
			<td>634</td>
			<td>677</td>
			<td>509</td>
		</tr></tbody></table>표 1: (A) DGRP RAL_177 라인의 개별 파리(a)의 BA 에탄올 침전 시간(들)의측정은 별도의 성별에 대한 RAL_555 (n=48). 또한 표 2, 그림 4를참조하십시오.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61108/61108fig4.jpg"> 그림 4: DGRP 라인의 알코올 감미 시간 RAL_177 및 RAL_555. 막대는 SEM(n = 48)과 에러 막대를 나타냅니다. RAL_177 파리의 침전 시간은 RAL_55 파리 (p < 0.0001, ANOVA)보다 적었다. 개별 데이터 요소가 표 1에표시됩니다. 성별과 선 간의 통계적으로 유의한 추가 차이는 텍스트와 표 2에표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61108/61108fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>분석</td>
			<td>변형의 근원</td>
			<td>Df</td>
			<td>Ss</td>
			<td>F-값</td>
			<td>P 값</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">풀풀된 전체 모델</td>
			<td>라인</td>
			<td>1</td>
			<td>769627</td>
			<td>34.869</td>
			<td><0.0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>섹스</td>
			<td>1</td>
			<td>105001</td>
			<td>4.757</td>
			<td>0.0304</td>
		</tr>
<tr>
<td>라인 x 섹스</td>
			<td>1</td>
			<td>86021</td>
			<td>3.897</td>
			<td>0.0498</td>
		</tr>
<tr>
<td>오류</td>
			<td>188</td>
			<td>4149491</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">감소 된 모델 여성</td>
			<td>라인</td>
			<td>1</td>
			<td>685126</td>
			<td>23.58</td>
			<td><0.0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>오류</td>
			<td>94</td>
			<td>2730718</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">감소 된 모델 남성</td>
			<td>라인</td>
			<td>1</td>
			<td>170522</td>
			<td>11.3</td>
			<td>0.0011</td>
		</tr>
<tr>
<td>오류</td>
			<td>94</td>
			<td>1418774</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">모델 RAL_177 감소</td>
			<td>섹스</td>
			<td>1</td>
			<td>473</td>
			<td>0.023</td>
			<td>0.8800</td>
		</tr>
<tr>
<td>오류</td>
			<td>94</td>
			<td>1943741</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">모델 RAL_555 감소</td>
			<td>섹스</td>
			<td>1</td>
			<td>190549</td>
			<td>8.12</td>
			<td>0.0054</td>
		</tr>
<tr>
<td>오류</td>
			<td>94</td>
			<td>2205751</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 성별 및 DGRP 라인 간 축동 시간에 대한 분산 분석. 사용된 모델은 Y =μ + S L + S + S+Θ이고, 여기서 μ는 전체 평균이고, L은 DGRP 선의 고정 효과(RAL_177, RAL_555), S는 성(남성, 여성), LxS상호작용 용어(fixed) 및 θ는 오차 용어이다. 모델 Y = μ + L + θ 및 Y = μ + S + θ를 감소된 모델에 사용했습니다. 라인, 성별 및 라인 x 섹스 상호작용 용어는 모두 α< 0.05에서 전체 모델에서 유의했다. 성별 및 DGRP 라인 RAL_555 의해 감소된 모델은 α < 0.01에서도 유의했다. 또한 표 1, 그림 4를참조하십시오. df = 자유도, SS = 제곱의 유형 I 합계.

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High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Drosophila에 있는 알콜 감도를 측정하는 현재 방법은 파리의 단을 시험하기 위하여 디자인됩니다. 우리는 단일 파리의 큰 숫자에 알코올 감산 도성을 평가하기위한 간단한, 저렴한 비용, 높은 처리량 분석을 제시한다. 이 방법은 특수 공구를 필요로하지 않으며 일반적인 재료를 사용하여 모든 실험실에서 수행 할 수 있습니다.

개별 초파리 멜라노가스터의 알코올 침전 시간을 측정하기위한 높은 처리량 방법

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human ...

Drosophila는 통제된 유전 배경 및 환경 조건하에서 정확하게 알콜 감도를 정량화할 수 있기 때문에 알콜 감도의 유전 기초를 연구하는 우수한 모형을 제공합니다. 플라이의 Drosophila 테스트 그룹에서 알코올 감도를 측정하는 현재 방법. 우리는 단일 파리의 많은 수의 알코올 민감도를 평가하는 간단하고 저렴한 고처리량 방법을 제시합니다.Drosophila에 있는 알콜 감도에 있는 변이는 파리가 인간 정형전환과 그들의 유전자의 대략 75%를 공유하기 때문에 인간에 있는 유사한 표현형으로 번역될 수 있습니다. 우리가 개발 한 분석은 또한 다른 비행 종 또는 질병 벡터를 포함하여 다른 곤충에 휘발성의 급성 독성의 효과를 측정하기 위해 적용 될 수있다. 24웰 세포 배양판의 판지 템플릿을 만드는 것으로 시작합니다.접시 주변을 추적하고 지정된 영역을 잘라냅니다. 그런 다음 골판지 템플릿을 사용하여 접시 크기의 작은 곤충 화면 메쉬 조각을 만듭니다. 24웰 컬쳐 플레이트 둘레에 작은 핫 접착제라인을 놓고 우물 위에 화면 메쉬를 부착합니다.그런 다음 뜨거운 접착제 총을 사용하여 문화 판의 세 면에 나무 공예 스틱을 고정하십시오. 촬영실에 들어갈 수 있는 만큼 플레이트를 준비합니다. 촬영 챔버를 만들려면 폴리스티렌 상자의 한쪽에 비디오 카메라 렌즈의 크기를 구멍과 반대쪽에 조명 패드의 크기에 추가 슬릿을 잘라.조명 패드를 슬릿에 삽입하고 카메라를 조명 패드 위의 렌즈 구멍에 배치합니다. 모든 시험재료를 제어된 환경에 배치하고, 바람직하게는 습도 약 30%, 섭씨 25도, 균일한 기류 및 소음 수준이 65데시벨 미만인 행동 챔버를 배치합니다. 이전에 만든 골판지 템플릿을 사용하여 치즈 천 두 조각을 잘라냅니다.그런 다음 각 우물에 화면 메쉬를 통해 100 % 에탄올의 파이펫 1 밀리리터. 메쉬를 말리고 치즈천 두 조각을 위에 놓습니다. 골판지 템플릿을 짧은 면 중 하나에서 1~2센티미터로 확장하는 가이드로 사용하여 얇고 유연한 플라스틱 도마의 작은 조각을 잘라냅니다.절단 후 플라스틱이 여전히 테스트 장치에 세 개의 나무 공예 스틱 사이에 맞는지 확인하지만 한쪽 끝에 매달려 있습니다. 원고 의 지시에 따라 흡인기를 준비하고, 유연한 플라스틱으로 이전에 흡인 된 파리로 모든 우물을 덮는 24 웰 세포 배양 판으로 잘 당 하나의 비행을 전송하는 데 사용합니다. 각 비행의 우물 위치와 관련 유전자형 또는 표현형 정보를 기록합니다.플라이를 포함하는 세포 배양판의 상단과 유연한 플라스틱 플러시를 잡고, 에탄올을 사용하여 변형된 세포 배양판의 상단에 플레이트를 반전시킨다. 공예 스틱을 사용하여 반전된 세포 배양 판을 정렬하여 에탄올을 잘 사용하여 파리를 포함하는 각 우물과 잘 정렬되도록 합니다. 조명 패드가 전체 밝기로 켜지고 비디오 카메라로 녹화를 시작합니다.두 접시 사이에 플라스틱을 조심스럽게 제거하여 에탄올에 파리를 노출하여 치즈 천을 빼내지 않도록 하십시오. 모든 파리가 자세 조절권을 잃었다고 의심되는 경우 접시 중앙을 단단히 누릅니다. 움직임이 있는 경우 이동이 발생하지 않습니다 때까지 1~2분마다 계속 녹화합니다.움직임이 없는 후에 레코딩을 종료합니다. 파리를 복구하려면 테스트 장치에서 상단 플레이트를 제거하고 개별 파리를 선택한 용기로 흡인합니다. 변형된 세포 배양 판에서 에탄올을 시간당 적어도 한 번 교체하여 분석 전반에 걸쳐 일관된 에탄올 노출을 유지하고 원하는 만큼의 시료에 대한 실험을 반복한다.비디오 녹화를 시청하여 플라이가 자세 제어 및 운동 능력을 잃는 순간으로 정의된 플라이 세빙 시간을 결정합니다. 정확도를 보장하려면 필름을 역으로 보고 비행이 이동하기 시작하는 시간을 기록합니다. 이 방법을 사용하여 10분 이내에 많은 수의 플라이에서 데이터를 생성할 수 있습니다.24웰 플레이트 2개는 알코올에 대한 민감도가 다른 두 개의 DGRP 라인의 48개의 개별 파리에 대해 에탄올 체멸 시간을 동시에 측정하는 데 사용되었습니다. 샘플 크기가 큰 경우 정확도를 높이고 환경 변화에 대한 오차를 줄입니다. RAL_555 파리는 RAL-177 파리보다 덜 민감했다.RAL_177 남성과 여성은 성적으로 이질적인 영향을 미치지 않는 반면, RAL_555 선의 여성은 남성보다 에탄올 노출에 덜 민감했습니다. 이 프로토콜을 시도할 때, 원하는 결과를 달성하기 위해 정밀하게 파리의 포부와 세포 배양판의 반전을 수행하는 것이 중요합니다. 단일 파리를 평가하는 능력은 그룹 상호 작용으로 인한 혼동 효과를 피하기 때문에,이 분석은 알코올 노출의 급성 효과에 대한 높은 처리량 연구에 대한 Drosophila 모델의 유용성을 향상시킵니다.

Research

JoVE Journal

Behavior

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Moderate Prenatal Alcohol Exposure and Quantification of Social Behavior in Adult Rats

보통 태아 알코올 노출과 성인 쥐의 사회적 행동의 정량화

Alterations in social behavior are among the major negative consequences observed in children with Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASDs). Several ...

연구

행동분석학

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

쥐 뇌 미세 주입은 분자 기판 동기를 행동을 연구하기 위해

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

A Method for Evaluating the Reinforcing Properties of Ethanol in Rats without Water Deprivation, Saccharin Fading or Extended Access Training

물 박탈, 사카린 페이딩 또는 확장 액세스 교육을받지 않은 쥐에 에탄올의 강화 속성을 평가하는 방법

Operant oral self-administration methods are commonly used to study the reinforcing properties of ethanol in animals. However, the standard methods ...

The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse

디딜 방아 피로 시험 : 마우스에 대한 피로와 같은 행동 간단한, 높은 처리량 분석

Fatigue is a prominent symptom in many diseases and disorders and reduces quality of life for many people. The lack of clear pathogenesis and failure of ...

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

환경에서 신호의 결합 효과에 미치는 영향을 시험하는 방법<em&gt; Drosophila melanogaster</em

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

초파리 melanogaster 애벌레에서 Hypoxia의 검출에 대 한 분석 결과 내/터널링

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Noninvasive, High-throughput Determination of Sleep Duration in Rodents

수 면 기간 설치류의 비 침범 성, 높은 처리량 결정

Traditionally, sleep is monitored by an electroencephalogram (EEG). EEG studies in rodents require surgical implantation of the electrodes followed by a ...

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

An Automated Method to Determine the Performance of Drosophila in Response to Temperature Changes in Space and Time

시간과 공간에서 온도 변화에 대 한 응답에서 초파리 의 성능을 결정 하는 자동화 된 방법

Temperature is a ubiquitous environmental factor that affects how species distribute and behave. Different species of Drosophila fruit flies have specific ...

Multi-Modal Signals for Analyzing Pain Responses to Thermal and Electrical Stimuli

열 및 전기 자극에 고통 응답을 분석 하기 위한 다중 모드 신호

The assessment of pain relies mostly on methods that require a person to communicate. However, for people with cognitive and verbal impairments, existing ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

드로소필라 애벌레의 기계적 고치절 측정을 위한 향상된 분석 및 도구

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...