Name: in utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (magic) markers to individualize cortical mouse astrocytes
Uploaded: 2020-05-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes at JoVE.com

אנו מודים ל- S. Fouquet ולמתקני ההדמיה וליבת בעלי החיים של מכון דה לה ויז'ן ומכון דס מדעי המוח דה מונפלייה (MRI ו- RAM) על סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מלגות מ Région Ile-de-France ו Fondation ARC לשפוך la Recherche sur le Cancer כדי S.C, ומאוניברסיטת פריז-Saclay (יוזמות דוקטורטים Interdisciplinaires) ללוס אנג'לס, על ידי מימון ממועצת המחקר האירופית (ERC-SG 336331, PI J. Valette) כדי E.H., על ידי סוכנות לאומית דה לה Recherche תחת חוזים ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (צרפת BioImaging) על ידי פונדציה לשפוך la Recherche Médicale (Ref. DBI20141231328), על ידי מועצת המחקר האירופית (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) ועל ידי תוכנית ATIP-Avenir (PI K. Loulier).

כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים כאן בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות. פרוטוקולים של בעלי חיים אושרו על ידי המועצה האתית לניסויים בבעלי חיים של צ'ארלס דרווין (CEEACD / N ° 5).
1. הכנת פלסמידים נטולי אנדוטוקסין לסמני MAGIC באלקטרופורציה של הרחם
<ol><li>טרנספורמציה חיידקית<ol>
<li>על הקרח, להפשיר...

<ol>
	<li>Clarke, L. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+astrocytes+in+neural+circuit+development.">Emerging roles of astrocytes in neural circuit development.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).</li><li>Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromodulators+signal+through+astrocytes+to+alter+neural+circuit+activity+and+behaviour.">Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour.</a> Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).</li><li>Blanco-Su&#225;rez, E., Caldwell, A. L. M., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+astrocyte-synapse+interactions+in+CNS+disorders:+Astrocyte-synapse+disease.">Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders: Astrocyte-synapse disease.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).</li><li>Stogsdill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+neuroligins+control+astrocyte+morphogenesis+and+synaptogenesis.">Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis.</a> Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+in+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes in Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50 (6), 499-506 (2008).</li><li>Garc&#237;a-Marqu&#233;s, J., L&#243;pez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Identity+Determines+Astrocyte+Cortical+Heterogeneity.">Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity.</a> Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).</li><li>Mart&#237;n-L&#243;pez, E., Garc&#237;a-Marques, J., N&#250;&#241;ez-Llaves, R., L&#243;pez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Astrocytic+Response+to+Cortical+Injury.">Clonal Astrocytic Response to Cortical Injury.</a> PLoS ONE. 8 (9), 74039 (2013).</li><li>Guti&#233;rrez, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sibling+astrocytes+share+preferential+coupling+via+gap+junctions.">Sibling astrocytes share preferential coupling via gap junctions.</a> Glia. 67 (10), 1852-1858 (2019).</li><li>Lee, Y., Messing, A., Su, M., Brenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP+promoter+elements+required+for+region-specific+and+astrocyte-specific+expression.">GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression.</a> Glia. 56 (5), 481-493 (2008).</li><li>Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity+across+the+brain+and+spinal+cord+occurs+developmentally,+in+adulthood+and+in+response+to+demyelination.">Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination.</a> PloS One. 12 (7), 0180697 (2017).</li><li>Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+generation+of+glia+is+a+major+astrocyte+source+in+postnatal+cortex.">Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex.</a> Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).</li><li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels.">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).</li><li>Figueres-O&#241;ate, M., Garc&#237;a-Marqu&#233;s, J., L&#243;pez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UbC-StarTrack,+a+clonal+method+to+target+the+entire+progeny+of+individual+progenitors.">UbC-StarTrack, a clonal method to target the entire progeny of individual progenitors.</a> Scientific Reports. 6 (1), 33896 (2016).</li><li>Figueres-O&#241;ate, M., Garc&#237;a-Marqu&#233;s, J., Pedraza, M., De Carlos, J. A., L&#243;pez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+analyses+of+neural+lineages+after+embryonic+and+postnatal+progenitor+targeting+combining+different+reporters.">Spatiotemporal analyses of neural lineages after embryonic and postnatal progenitor targeting combining different reporters.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 87 (2015).</li><li>Figueres-O&#241;ate, M., S&#225;nchez-Villal&#243;n, M., S&#225;nchez-Gonz&#225;lez, R., L&#243;pez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+Tracing+and+Cell+Potential+of+Postnatal+Single+Progenitor+Cells+In+Vivo.">Lineage Tracing and Cell Potential of Postnatal Single Progenitor Cells In Vivo.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 700-712 (2019).</li><li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets.">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).</li><li>Peng, H., Bria, A., Zhou, Z., Iannello, G., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensible+visualization+and+analysis+for+multidimensional+images+using+Vaa3D.">Extensible visualization and analysis for multidimensional images using Vaa3D.</a> Nature Protocols. 9 (1), 193-208 (2014).</li><li>Peng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+finger+boosts+three-dimensional+imaging+and+microsurgery+as+well+as+terabyte+volume+image+visualization+and+analysis.">Virtual finger boosts three-dimensional imaging and microsurgery as well as terabyte volume image visualization and analysis.</a> Nature Communications. 5 (1), 4342 (2014).</li><li>Loulier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Cell+and+Lineage+Tracking+with+Combinatorial+Labels.">Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels.</a> Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Abdeladim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+multiscale+brain+imaging+with+chromatic+multiphoton+serial+microscopy.">Multicolor multiscale brain imaging with chromatic multiphoton serial microscopy.</a> Nature Communications. 10 (1), 1662 (2019).</li><li>Chen, F., LoTurco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+stable+transgenesis+of+radial+glia+lineage+in+rat+neocortex+by+piggyBac+mediated+transposition.">A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).</li><li>Siddiqi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+by+PiggyBac+Transposase+Reveals+That+Neocortical+GLAST++Progenitors+Generate+More+Astrocytes+Than+Nestin++Progenitors+in+Rat+Neocortex.">Fate Mapping by PiggyBac Transposase Reveals That Neocortical GLAST+ Progenitors Generate More Astrocytes Than Nestin+ Progenitors in Rat Neocortex.</a> Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).</li><li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system.">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes to Cells. 15 (5), 501-502 (2010).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+Improved+Tools+for+In+Utero+Electroporation+Studies+of+Developing+Cerebral+Cortex.">New and Improved Tools for In Utero Electroporation Studies of Developing Cerebral Cortex.</a> Cerebral Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+Genetic+Manipulation+of+Dendrites+and+Spines+in+the+Mouse+Cerebral+Cortex+and+Hippocampus+using+in+utero+Electroporation.">Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using in utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4163 (2012).</li></ol>

באלקטרופורציה של הרחם (IUE) של סמני MAGIC באבות קליפת המוח (איור 1) אפשר תיוג של אסטרוציטים לאורך קליפת המוח לאחר הלידה בשלבים שונים לאחר הלידה (P4-P7-P21, איור 2). מעניין, השלב של IUE אינו קריטי, כמו electroporation שבוצעו מ E13.5 כדי E15.5 מניב דפוסי תיוג דומים לגבי אסטרוציטים קליפת...

אסטרוציטים לשחק פונקציות חיוניות רבות בהתפתחות המוח ופיזיולוגיה1. לצד תפקידם במחסום הדם - מוח שבו הם מווסתים את ספיגת החומרים המזינים ואת זרימת הדם, הם תורמים באופן פעיל להיווצרות ותפקוד הסינפסה תוך הפקת נוירומודולטורים שיכולים לשנות פעילות עצבית והתנהגות2. יתר על כן, תפקוד לקוי של אסטרוציטים תורם למגוון הפרעות נוירולוגיות3. אסטרוציטים הממוקמים בקליפת המוח מציגים מורפולוגיה משוכללת המאפשרת מגע נרחב עם תהליכים עצביים. מגעים אלה, חיוני לתפקוד מעגלי, שולטים גם במורפוגנזה אסטרוציטים ובסינפטוגנזה באמצעות חלבוני הידבקות בתאים4. מדעני מוח זקוקים לכלים נוחים וחזקים כדי לחקור התפתחות אסטרוציטים ומורפוגנזה במודלים הנוירולוגיים שלהם של עניין. עם זאת, בשל ההחמרה הקרובה של אסטרוציטים לשכניהם וריצוף תלת מימדי אחיד שלהם, זה מאתגר לבודד אסטרוציטים קליפת המוח ולהעריך באופן מקיף את המורפולוגיה שלהם באמצעות immunomarkers.
נכון לעכשיו, שתי אסטרטגיות הנדסה גנטית עיקריות מאפשרות תיוג ואינדיבידואליזציה של אסטרוציטים קליפת המוח במקום: הפעלת כתב דליל בקווי עכבר מהונדסים או טרנסגנזה סומטית באמצעות אלקטרופורציה של פלסמידים כתב. האסטרטגיה הראשונה מסתמכת על הרבייה של קו עכבר כתב floxed עם עכברים המבטאים צורה בלתי ניתנת להסבר של Recombinase Cre המופעל במיוחד אסטרוציטים על משלוח טמוקסיפן (למשל, Aldh1l1-CreERT25). מספר חסרונות קשורים לאסטרטגיה זו. ראשית, הרבייה של עכברים מהונדסים דורשת מספר רב של בעלי חיים ובדרך כלל יש צורך במבחנים מרובים כדי לקבוע את המינון הנכון של טמוקסיפן כדי לספק תיוג דליל כראוי של אסטרוציטים קליפת המוח. ניתוח פנוטיפים אסטרוציטים קליפת המוח במודל עכבר גנטי של עניין ידרוש אפילו יותר רבייה וצריכת עכבר. יתר על כן, בהזרקת טמוקסיפן הרחם ידוע להפריע parturition, מה שהופך אסטרטגיה זו קשה ליישם את המחקר של השלבים המוקדמים ביותר של התפתחות אסטרוציטים. In vivo DNA electroporation היא אסטרטגיה חלופית ללא טמוקסיפן המסתמכת על מספר מינימלי של בעליחיים 6. גישה זו, המבוצעת בשלבים עובריים או לאחר לידה, מורכבת מהזרקת פלסמידים עיתונאיים בחדרים הצדדיים של מכרסמים ואחריו פולסים חשמליים היוצרים נקבוביות בקרום התא, ומכאן מאפשרים לדנ"א להיכנס לתאי אב המצפים את החדר. לאחר מכן, transgenes הכתב נישא על ידי פלסמידים electroporated מעובדים על ידי מכונות התא ממוקד והביע7. שתי שיטות electroporation תוארו בעבר לתייג אסטרוציטים קליפת המוח של העכבר: 1) תיוג אסטרוציטים לאחר הלידה על ידי Electroporation (PALE), המסתמך על electroporation של 1-2 פלסמידים כתב אפיזומלי צבע יחיד בשלבים מוקדמים לאחר הלידה4; 2) האסטרטגיה StarTrack מבוסס על electroporation הרחם (IUE) של פלסמידים כתב אינטגרטיבי צבע יחיד מרובים8,9,10. למרות שתי טכניקות אלה ביעילות תווית PrA בקליפת המוח, הם גם מציגים כמה מגבלות. בגרסה הראשונית שלהם, שתי השיטות מסתמכות על חלבון חומצי פרפור גליה (GFAP) מקדם לנהוג ביטוי אסטרוציטים, אשר עשוי להטות את התיוג לכיוון גליה רדיאלי, כמו גם אסטרוציטים פייאל תגובתי המבטאים GFAP חזק יותר מאשר מנוחה רגילה PrA11,12. לגבי PALE, חסרונות אחרים הם השלב המאוחר של electroporation, אשר מונע תיוג של פרה בגיל הרך (או אלה שמקורם אבות delaminating מוקדם) וניתוח של שלבים מוקדמים של התפתחות אסטרוליה, ושימוש וקטורים אפיזומליים שהופכים מדוללים באמצעות חטיבות רצופות במהלך התפשטות מסיבית כי פרה לעבור במהלך השבוע הראשון לאחר הלידה13,14. בניגוד ל- PALE, StarTrack מבוסס על אלקטרופוציה עוברית של פלסמידים עיתונאיים אינטגרטיביים המאפשרים מעקב אחר תרומתם של אבות עוברים ואחרי לידה ל- PrA. תוכנית StarTrack מעודכנת המסתמכת על מקדם Ubiquitin C (UbC-StarTrack) משיגה ביטוי רחב יותר של כתבים פלואורסצנטיים הן בירידה העצבית והן בירידה הגלית (כולל אסטרוציטים) של אבות עצביים15,16,17. עם זאת, בגרסתה הנוכחית, יישום גישה זו הוא מורכב, שכן הוא מסתמך על תערובת שווה של 12 פלסמידים נפרדים המבטאים שישה חלבונים פלואורסצנטיים (FP) עם עירור חלקי וחפיפת ספקטרום פליטה.
מוצג כאן הוא פשוט בשיטת תיוג multicolor מבוססי אלקטרופורציה הרחם באמצעות מבני כתב אינטגרטיבי מונע על ידי מקדם חזק ופעיל באופן נרחב כדי לבודד אסטרוציטים קליפת המוח14. בנוסף, צינור ניתוח תמונה קל באמצעות מורשה (למשל, Imaris) וגישה פתוחה (Vaa3D18,19,20) תוכנת ניתוח תמונה מסופקת לפלח נפח טריטוריאלי אסטרוציטים ו arborization, בהתאמה. בהשוואה לשיטות שתוארו לעיל, אסטרטגיה זו מסתמכת אך ורק על 1-2 טרנסגנים אינטגרטיביים צבעוניים מרובי סמני צבע משולבי גנום (סמני MAGIC או MM21) המופנים לתא התא הגרעיני הציטופלסמי (אופציונלי) שביטויו מונע על ידי מקדם CAG סינתטי המורכב משפר ציטומגלווירוס, מקדם העוף β-actin, ואתר מקבל β-גלוביןsplice 22. זה מאפשר תיוג ומעקב של אסטרוציטים קליפת המוח, מעובר לשלבים מאוחרים לאחר הלידה, ללא תלות ביטוי GFAP14,23. כל אחד מהטרנג'ינים האלה נושא את ארבעת ה-FP השונים הבאים: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP ו- tdTomato/mCherry, המציגים חפיפה ספקטרלית מינימלית שניתן לעקוף בקלות עם 1) רכישת ערוצים רציפים; 2) כוח עירור ממוטב ורווח איסוף; ו-3) מסננים דיכריים ספציפיים לאיסוף חלונות פליטת FP צרים. אסטרטגיית MM משתמשת רקומבינציה Cre /lox עם recombinase Cre עצמית excisable (seCre) כדי להניע ביטוי סטוכסטי של FP באוכלוסייה הסלולר. עותק יחיד של MM transgene מבטא את ה-FP באופן בלעדי הדדית, בעוד שטרנסג'ינים מרובים יוצרים שילובי FP ויוצרים עשרות גוונים שונים. אינטגרציה גנומית של הטרנסגנס מונעת על ידי מערכת טרנספוזיציה PB (PB) או Tol224,25,26. לכן, באמצעות electroporation הרחם, ערכת הכלים MM ואת "פסיפס" צבעוני שהיא מייצרת לאפשר סימון בו זמנית של אבות קליפת המוח הסמוכים מרובים ואת המעקב אחר הירידה הגלית שלהם, כולל אסטרוציטים קליפת המוח, על פני תקופות ארוכות. ניגודי צבעים הנובעים מהביטוי של חלוקה ברורה של FP היתר מתאר של קווי המתאר של PrA ולאחר מכן לחלץ מידע מפתח על נפח טריטוריאלי שלהם (באמצעות IMARIS) ומורפולוגיה מורכבת (באמצעות Vaa3D). האסטרטגיה הצבעונית המוצגת בפירוט כאן היא שיטה נוחה וחזקה המעניקה גישה מהירה וקלה למשטח האסטרוציטים הקליפתיים והמורפולוגיה בעכברים מסוג בר בשלבים התפתחותיים שונים, וקל להסתגלה לחקירת תכונות אנטומיות אסטרוציטים במודלים של עכברים של מחלות נוירולוגיות מבלי להשתמש בקווי כתב מהונדסים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.1 Bacteria transformation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0400-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5 alpha competent cells</td>
			<td>Fisher Scientitic</td>
			<td>11563117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice box</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>139959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>Fisher Scientitic</td>
			<td>11563117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dish- 10 cm</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>462-0556H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 Plasmid culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml culture tube</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>187262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass erlenmeyer- 2L</td>
			<td>Fisher Scientitic</td>
			<td>11383454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3 Plasmid DNA preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi Plus EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740426.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1 Preparation of the solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G x 1/2 needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>8AN2613R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2 needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>8AN3013R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use polypropylene syringe, 1 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>50002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2 Preparation of the surgery material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps - DeBakey Pattern- 12.5 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>11617-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arched tip Forceps- 10 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>11071-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z378569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipette 1 mm diameter</td>
			<td>FHC</td>
			<td>10-10-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>11651-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>11650-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors - Delicate Straight- 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory tape</td>
			<td>Fisher Scientitic</td>
			<td>11730454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>INJECT+MATIC</td>
			<td>No catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar Needle Holder - 12 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical fiber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic-coated white paper</td>
			<td>Distrimed</td>
			<td>700103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signagel electrode gel</td>
			<td>Free-Med</td>
			<td>15-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri dish- 35 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>056714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer, glass dry bead, Steri 250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z378569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.3 Preparation of the pregnant female mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol pad</td>
			<td>Alcomed</td>
			<td>1731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprecare</td>
			<td>Axience</td>
			<td>0.3 mg/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compress</td>
			<td>tRAFFIN</td>
			<td>70189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Merial</td>
			<td>Imalgene 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular gel</td>
			<td>tvm lab</td>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RjOrl:SWISS mice</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetadine, 10% solution</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>4337400113B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming pad</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-0493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Rompun 2%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 Electroporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse</td>
			<td>Novosyn</td>
			<td>C0068220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporateur Sonidel</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>NEPA 21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile transfer pipets (individually wrapped)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>043202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY650P3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1 Tissue harvesting and sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigenfix</td>
			<td>Microm Microtech</td>
			<td>U/P0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>100266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolethal</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>DOL202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11540486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>100001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vectorlabs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Multichannel confocal imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X oil NA 0.85</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 20x/0.8 M27</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. Astrocyte territorial volume segmentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS 8.3 and later versions</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7. Astrocyte arborization tracing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D)</td>
			<td>HHMI - Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (magic) markers to individualize cortical mouse astrocytes

אסטרוציטים פרוטופלזמיים (PrA) הממוקמים בקליפת המוח של העכבר הם צמודים זה בזה, ויוצרים מטריצה תלת מימדית רציפה לכאורה בשלבים למבוגרים. עד כה, שום אסטרטגיה חיסונית לא יכולה לבודד אותם ולחלק את המורפולוגיה שלהם בבעלי חיים בוגרים ובמהלך הקורטיקורטיקוס. מקורו של PrA קליפת המוח מאבות הממוקמים בפאליום הגבי וניתן לכוון אותו בקלות לשימוש באלקטרופורציה של וקטורים אינטגרטיביים ברחם. פרוטוקול מוצג כאן כדי לתייג תאים אלה עם צבע רב תכליתי שילוב הגנום (MAGIC) סמנים אסטרטגיה, המסתמך על piggyBac / Tol2 טרנספוזיציה ו Cre /lox recombination כדי לבטא stochastically חלבונים פלואורסצנטיים נפרדים (כחול, ציאן, צהוב, ואדום) ממוען לתאים תת תאיים ספציפיים. אסטרטגיית מיפוי גורל צבעונית זו מאפשרת לסמן באתרו אבות קליפתיים סמוכים עם שילובים של סמני צבע לפני תחילת הגליוגנזה ולעקוב אחר צאצאיהם, כולל אסטרוציטים, החל בשלבים עובריים ועד בוגרים ברמת התא הבודד. תיוג דליל למחצה שהושג על ידי התאמת הריכוז של וקטורים אלקטרופולציה וניגודי צבע המסופקים על ידי סמני צבע משולבי גנום רב-תכליתיים (סמני MAGIC או MM) מאפשרים להתאים אישית אסטרוציטים ולבודד את הטריטוריה והמורפולוגיה המורכבת שלהם למרות הסידור האנטומי הצפוף שלהם. להלן זרימת עבודה ניסיונית מקיפה הכוללת את פרטי הליך האלקטרופורציה, רכישת ערימות תמונה רב-ערוציות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית ופילוח תלת מימדי בסיוע מחשב שיאפשר לניסוי להעריך נפח PrA ומורפולוגיה בודדים. לסיכום, אלקטרופולציה של סמני MAGIC מספקת שיטה נוחה לתייג בנפרד אסטרוציטים רבים ולקבל גישה לתכונות האנטומיות שלהם בשלבים התפתחותיים שונים. טכניקה זו תהיה שימושית כדי לנתח תכונות מורפולוגיות אסטרוציטים קליפת המוח במודלים שונים של העכבר מבלי להזדקק צלבים מורכבים עם קווי כתב מהונדסים.

אלקטרופולציה של סמני MAGIC באבות קליפת המוח העוברית מאפשרת תיוג של אסטרוציטים מהשלבים המוקדמים עד המאוחרים של התפתחות קליפת המוח (איור 1). אסטרוציטים אלה נמצאו בכל שכבות קליפת המוח בשלבים שונים לאחר הלידה (P4, P7, P21) כפי שהם התפזרו נרחב לתוך קליפת המוח כולה. הם הוערכו באמצעות תמו...

Watch this Scientific Journal Video about In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes at JoVE.com

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

אסטרוציטים לפרוש את קליפת המוח באופן אחיד, מה שהופך את הניתוח של המורפולוגיה המורכבת שלהם מאתגר ברמה התאית. הפרוטוקול המסופק כאן משתמש בתיוג צבעוני המבוסס על אלקטרופורציה ברחם כדי לבודד אסטרוציטים קליפתיים ולנתח את נפחם ומורפולוגיה שלהם עם צינור ניתוח תמונה ידידותי למשתמש.

ב אלקטרופולציה הרחם של גנום רב-תכליתי שילוב צבע (MAGIC) סמנים כדי להתאים אישית אסטרוציטים עכבר קליפת המוח

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

ג&#39;ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

בידוד ותרבות של האסטרוציטים עכבר קליפתיים

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

לשעבר הרחם electroporation וexplants חצי כדור שלם: שיטה ניסיונית פשוטה למחקרים בהתפתחות קליפת מוח הקדומה

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Electroporation תת סוג סלקטיבי של בקליפת המוח interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation בC57BL / 6 העכבר

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...