Name: in utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (magic) markers to individualize cortical mouse astrocytes
Uploaded: 2020-05-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes at JoVE.com

Vi takker S. Fouquet og bilde- og dyrekjernefasilitetene til Institut de la Vision og Institut des Neurosciences de Montpellier (MR og RAM) for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av stipender fra Région Ile-de-France og Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer to S.C, og fra Université Paris-Saclay (Initiatives Doctorales Interdisciplinaires) til LA, ved finansiering fra European Research Council (ERC-SG 336331, PI J. Valette) til E.H., av Agence Nationale de la Recherche under kontrakter ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (Frankrike BioImaging) , av Fondation pour la Recherche Médicale (Ref. DBI20141231328), av European Research Council (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) og av ATIP-Avenir program (PI K. Loulier).

Alle dyreprosedyrer som er beskrevet her ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer. Dyreprotokoller er godkjent av Charles Darwin dyreksperimentering etisk styre (CEEACD/N°5).
1. Fremstilling av endotoksinfrie plasmider for MAGIC Markører i utero elektroporasjon
<ol><li>Bakteriell transformasjon<ol>
<li>På is, tine DH5 alfa kompetente celler lagret ved -70 °C.</li>
		<li>Varm opp agarplatene som inneholder riktig antibiotika (100 μg/ml ampicillin eller 50 μg/ml kanamycin...

<ol>
	<li>Clarke, L. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+astrocytes+in+neural+circuit+development.">Emerging roles of astrocytes in neural circuit development.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).</li><li>Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromodulators+signal+through+astrocytes+to+alter+neural+circuit+activity+and+behaviour.">Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour.</a> Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).</li><li>Blanco-Su&#225;rez, E., Caldwell, A. L. M., Allen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+astrocyte-synapse+interactions+in+CNS+disorders:+Astrocyte-synapse+disease.">Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders: Astrocyte-synapse disease.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).</li><li>Stogsdill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+neuroligins+control+astrocyte+morphogenesis+and+synaptogenesis.">Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis.</a> Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+in+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes in Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50 (6), 499-506 (2008).</li><li>Garc&#237;a-Marqu&#233;s, J., L&#243;pez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Identity+Determines+Astrocyte+Cortical+Heterogeneity.">Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity.</a> Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).</li><li>Mart&#237;n-L&#243;pez, E., Garc&#237;a-Marques, J., N&#250;&#241;ez-Llaves, R., L&#243;pez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Astrocytic+Response+to+Cortical+Injury.">Clonal Astrocytic Response to Cortical Injury.</a> PLoS ONE. 8 (9), 74039 (2013).</li><li>Guti&#233;rrez, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sibling+astrocytes+share+preferential+coupling+via+gap+junctions.">Sibling astrocytes share preferential coupling via gap junctions.</a> Glia. 67 (10), 1852-1858 (2019).</li><li>Lee, Y., Messing, A., Su, M., Brenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP+promoter+elements+required+for+region-specific+and+astrocyte-specific+expression.">GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression.</a> Glia. 56 (5), 481-493 (2008).</li><li>Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity+across+the+brain+and+spinal+cord+occurs+developmentally,+in+adulthood+and+in+response+to+demyelination.">Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination.</a> PloS One. 12 (7), 0180697 (2017).</li><li>Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+generation+of+glia+is+a+major+astrocyte+source+in+postnatal+cortex.">Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex.</a> Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).</li><li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels.">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).</li><li>Figueres-O&#241;ate, M., Garc&#237;a-Marqu&#233;s, J., L&#243;pez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UbC-StarTrack,+a+clonal+method+to+target+the+entire+progeny+of+individual+progenitors.">UbC-StarTrack, a clonal method to target the entire progeny of individual progenitors.</a> Scientific Reports. 6 (1), 33896 (2016).</li><li>Figueres-O&#241;ate, M., Garc&#237;a-Marqu&#233;s, J., Pedraza, M., De Carlos, J. A., L&#243;pez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+analyses+of+neural+lineages+after+embryonic+and+postnatal+progenitor+targeting+combining+different+reporters.">Spatiotemporal analyses of neural lineages after embryonic and postnatal progenitor targeting combining different reporters.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 87 (2015).</li><li>Figueres-O&#241;ate, M., S&#225;nchez-Villal&#243;n, M., S&#225;nchez-Gonz&#225;lez, R., L&#243;pez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+Tracing+and+Cell+Potential+of+Postnatal+Single+Progenitor+Cells+In+Vivo.">Lineage Tracing and Cell Potential of Postnatal Single Progenitor Cells In Vivo.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 700-712 (2019).</li><li>Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V3D+enables+real-time+3D+visualization+and+quantitative+analysis+of+large-scale+biological+image+data+sets.">V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets.</a> Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).</li><li>Peng, H., Bria, A., Zhou, Z., Iannello, G., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensible+visualization+and+analysis+for+multidimensional+images+using+Vaa3D.">Extensible visualization and analysis for multidimensional images using Vaa3D.</a> Nature Protocols. 9 (1), 193-208 (2014).</li><li>Peng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+finger+boosts+three-dimensional+imaging+and+microsurgery+as+well+as+terabyte+volume+image+visualization+and+analysis.">Virtual finger boosts three-dimensional imaging and microsurgery as well as terabyte volume image visualization and analysis.</a> Nature Communications. 5 (1), 4342 (2014).</li><li>Loulier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Cell+and+Lineage+Tracking+with+Combinatorial+Labels.">Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels.</a> Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Abdeladim, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+multiscale+brain+imaging+with+chromatic+multiphoton+serial+microscopy.">Multicolor multiscale brain imaging with chromatic multiphoton serial microscopy.</a> Nature Communications. 10 (1), 1662 (2019).</li><li>Chen, F., LoTurco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+stable+transgenesis+of+radial+glia+lineage+in+rat+neocortex+by+piggyBac+mediated+transposition.">A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition.</a> Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).</li><li>Siddiqi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+by+PiggyBac+Transposase+Reveals+That+Neocortical+GLAST++Progenitors+Generate+More+Astrocytes+Than+Nestin++Progenitors+in+Rat+Neocortex.">Fate Mapping by PiggyBac Transposase Reveals That Neocortical GLAST+ Progenitors Generate More Astrocytes Than Nestin+ Progenitors in Rat Neocortex.</a> Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).</li><li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system.">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes to Cells. 15 (5), 501-502 (2010).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+Improved+Tools+for+In+Utero+Electroporation+Studies+of+Developing+Cerebral+Cortex.">New and Improved Tools for In Utero Electroporation Studies of Developing Cerebral Cortex.</a> Cerebral Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Pacary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+Genetic+Manipulation+of+Dendrites+and+Spines+in+the+Mouse+Cerebral+Cortex+and+Hippocampus+using+in+utero+Electroporation.">Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using in utero Electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e4163 (2012).</li></ol>

In utero electroporation (IUE) av MAGIC Markører i kortikale stamfar (figur 1) aktivert merking av astrocytter gjennom postnatal hjernebark på ulike postnatale stadier (P4-P7-P21, Figur 2). Interessant, scenen av IUE er ikke kritisk, som elektroporasjon utført fra E13.5 til E15.5 gir lignende merking mønstre om kortikale astrocytter14. Plasseringen av merkede pyramidale nevroner i kortikal parenchyma varierer imidlertid med elektropor...

Astrocytter spiller mange vitale funksjoner i hjernens utvikling og fysiologi1. Ved siden av sin rolle ved blod-hjernebarrieren hvor de regulerer næringsopptak og blodstrøm, bidrar de aktivt til synapsedannelse og funksjon mens de produserer nevromodulatorer som kan endre nevronal aktivitetog atferd 2. Videre bidrar astrocyttdysfunksjon til en rekke nevrologiske lidelser3. Astrocytter som ligger i hjernebarken viser en forseggjort morfologi som muliggjør omfattende kontakt med nevronale prosesser. Disse kontaktene, avgjørende for kretsfunksjon, kontrollerer også astrocyttmorfogenese og synaptogenesis gjennom celle-vedheftproteiner4. Nevrologer trenger praktiske og robuste verktøy for å undersøke astrocyttutvikling og morfogenese i sine nevrologiske modeller av interesse. Men på grunn av den nære tilponeringen av astrocytter til sine naboer og deres ensartede tredimensjonale flislegging, er det utfordrende å utpeke kortikale astrocytter og grundig vurdere deres morfologi ved hjelp av immunmarkører.
For tiden, to viktigste genteknologi strategier muliggjør merking og individualisering av kortikale astrocytter in situ: sparsom reporter aktivering i transgene muselinjer eller somatisk transgenese ved hjelp av elektroporasjon av reporter plasmids. Den første strategien er avhengig av å avle en floxed reporter muselinje med mus som uttrykker en induserbar form for Cre recombinase aktivert spesielt i astrocytter ved tamoxifen levering (f.eks Aldh1l1-CreERT25). Flere ulemper er knyttet til denne strategien. For det første krever avl av transgene mus et stort antall dyr, og flere analyser er vanligvis nødvendig for å bestemme riktig dose tamoxifen for å gi tilstrekkelig sparsom merking av kortikale astrocytter. Analysere kortikale astrocytter fenotyper i en genetisk musemodell av interesse vil kreve enda mer avl og mus forbruk. Videre, in utero tamoxifen injeksjon er kjent for å forstyrre delurition, noe som gjør denne strategien vanskelig å gjelde for studien av de tidligste stadiene av astrocytt utvikling. In vivo DNA elektroporasjon er en alternativ tamoxifen-fri strategi som er avhengig av et minimum antall dyr6. Utført enten på embryonale eller postnatale stadier, består denne tilnærmingen av å injisere reporterplasmider i laterale ventrikler av gnagere etterfulgt av elektriske pulser som skaper porer i cellemembranen, og dermed tillater DNA å gå inn i stamceller som fôrer ventrikkelen. Deretter behandles reportertransgenes som bæres av de elektroporatede plasmidene av det målrettede cellemaskineriet og uttrykkes7. To elektroporasjonsmetoder har tidligere blitt beskrevet for å merke muskortikale astrocytter: 1) Postnatal Astrocyte Merking av Electroporation (PALE), som er avhengig av elektroporasjon av 1-2 enfarget episomal reporter plasmider i tidlige postnatale stadier4; 2) StarTrack strategi basert på in utero elektroporasjon (IUE) av flere single-color integrative reporter plasmids8,9,10. Selv om disse to teknikkene effektivt merker PrA i hjernebarken, presenterer de også noen begrensninger. I sin første versjon, begge metodene stole på en glial fibrillary surt protein (GFAP) promotor å drive uttrykk i astrocytter, som kan skjevhet merking mot radial glia samt pial og reaktive astrocytter som uttrykker GFAP sterkere enn normalt hvile PrA11,12. Når det gjelder PALE, andre ulemper er den sene fasen av elektroporasjon, som forhindrer merking av tidlig født PrA (eller de som stammer fra tidlig delaminerende stamfarier) og analyse av tidlige stadier av astroglia utvikling, og bruk av episomale vektorer som blir fortynnet gjennom påfølgende divisjoner under den massive spredningen som PrA gjennomgår i løpet av den første postnataluke 13,14. I motsetning til PALE er StarTrack basert på embryonal elektroporasjon av integrative reporterplasmider som tillater sporing av bidraget fra både embryonale og postnatale stamfarer til PrA. En oppdatert StarTrack-ordning som er avhengig av ubiquitin C-promoteren (UbC-StarTrack) oppnår bredere uttrykk for fluorescerende journalister i både nevronal og glial nedstigning (astrocytter inkludert) av nevrale stamfar15,16,17. Men i sin nåværende versjon er implementeringen av denne tilnærmingen kompleks, da den er avhengig av en equimolar blanding av 12 forskjellige plasmider som uttrykker seks fluorescerende proteiner (FP) med delvis eksitasjon og utslippspektra overlapping.
Presentert her er en enkel i utero elektroporasjon-basert flerfarget merking metode ved hjelp av integrerende reporter konstruksjoner drevet av en sterk og bredt aktiv promotor for å utpeke kortikale astrocytter14. I tillegg er en enkel bildeanalyserørledning ved hjelp av både lisensiert (f.eks. Imaris) og åpen tilgang (Vaa3D18,19,20) bildeanalyseprogramvare gitt til segmentastrocytt territorial volum og arborisering, henholdsvis. Sammenlignet med tidligere beskrevne metoder, Denne strategien er utelukkende avhengig av 1–2 flerfargede integrerende transgener Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC eller MM21) rettet mot cytoplasmatisk og (eventuelt) kjernefysisk cellerom hvis uttrykk drives av en syntetisk CAG-promoter bestående av en cytomegalovirusforsterker, kylling β-actin arrangør og kanin β-globin skjøte akseptor nettstedet22. Dette gjør det mulig å merke og spore kortikale astrocytter, fra embryonale til sene postnatale stadier, uavhengig av GFAP-uttrykk14,23. Hver av disse transgenene bærer følgende fire forskjellige FP: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP og tdTomato/mCherry, som viser minimal spektral overlapping som lett kan omgås med 1) Sekvensiell kanaloppkjøp; 2) Optimalisert excitation makt og samling gevinst; og 3) Spesifikke dichroic filtre for å samle smale FP utslipp vinduer. MM-strategien bruker Cre/lox-rekombinasjon med en selvutsigelig Cre-rekombinering (seCre) til å drive stokastisk uttrykk for FP i en cellulær befolkning. En enkelt kopi av MM transgene uttrykker FP på en gjensidig eksklusiv måte, mens flere transgener gir opphav til FP-kombinasjoner, noe som skaper dusinvis av forskjellige fargetoner. Genomisk integrasjon av transgenene drives av piggyBac (PB) eller Tol2 transposisjonssystem24,25,26. Derfor, gjennom in utero elektroporasjon, MM verktøykasse og flerfarget 'mosaikk' som den genererer muliggjør samtidig merking av flere tilstøtende kortikale stamfarer og sporing av deres glial nedstigning, inkludert kortikale astrocytter, over lange perioder. Fargekontraster som følge av uttrykk for distinkt FP tillater avgrensning av konturen av PrA og deretter trekke ut viktig informasjon om deres territoriale volum (ved hjelp av IMARIS) og kompleks morfologi (ved hjelp av Vaa3D). Flerfarget strategi presentert i detalj her er en praktisk og robust metode som gir rask og enkel tilgang til kortikale astrocytt overflate og morfologi i vill type mus på ulike utviklingsstadier, og er lett tilpasningsdyktig til å undersøke astrocytt anatomiske funksjoner i musemodeller av nevrologiske sykdommer uten å bruke transgene reporter linjer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.1 Bacteria transformation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0400-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5 alpha competent cells</td>
			<td>Fisher Scientitic</td>
			<td>11563117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice box</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>139959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>Fisher Scientitic</td>
			<td>11563117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dish- 10 cm</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>462-0556H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2 Plasmid culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml culture tube</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>187262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass erlenmeyer- 2L</td>
			<td>Fisher Scientitic</td>
			<td>11383454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.3 Plasmid DNA preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi Plus EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740426.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1 Preparation of the solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G x 1/2 needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>8AN2613R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G x 1/2 needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>8AN3013R1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27810.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-use polypropylene syringe, 1 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>50002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.2 Preparation of the surgery material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps - DeBakey Pattern- 12.5 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>11617-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arched tip Forceps- 10 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>11071-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer Steri 250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z378569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass micropipette 1 mm diameter</td>
			<td>FHC</td>
			<td>10-10-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>11651-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>11650-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors - Delicate Straight- 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory tape</td>
			<td>Fisher Scientitic</td>
			<td>11730454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>INJECT+MATIC</td>
			<td>No catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olsen-Hegar Needle Holder - 12 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>12002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical fiber</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic-coated white paper</td>
			<td>Distrimed</td>
			<td>700103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signagel electrode gel</td>
			<td>Free-Med</td>
			<td>15-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Petri dish- 35 mm</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>056714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer, glass dry bead, Steri 250</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z378569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.3 Preparation of the pregnant female mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol pad</td>
			<td>Alcomed</td>
			<td>1731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprecare</td>
			<td>Axience</td>
			<td>0.3 mg/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compress</td>
			<td>tRAFFIN</td>
			<td>70189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Merial</td>
			<td>Imalgene 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocular gel</td>
			<td>tvm lab</td>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RjOrl:SWISS mice</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetadine, 10% solution</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>4337400113B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming pad</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-0493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>Rompun 2%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 Electroporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse</td>
			<td>Novosyn</td>
			<td>C0068220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporateur Sonidel</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>NEPA 21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile transfer pipets (individually wrapped)</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>043202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY650P3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1 Tissue harvesting and sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigenfix</td>
			<td>Microm Microtech</td>
			<td>U/P0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>100266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dolethal</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>DOL202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10X), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11540486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>100001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vectorlabs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Multichannel confocal imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X oil NA 0.85</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan Apochromat 20x/0.8 M27</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. Astrocyte territorial volume segmentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS 8.3 and later versions</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7. Astrocyte arborization tracing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D)</td>
			<td>HHMI - Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (magic) markers to individualize cortical mouse astrocytes

Protoplasmaiske astrocytter (PrA) som ligger i musen hjernebarken er tett sidestilt, og danner en tilsynelatende kontinuerlig tredimensjonal matrise på voksenstadier. Så langt, ingen immunstaining strategi kan enkelt dem ut og segmentere sin morfologi i modne dyr og i løpet av kortikogenese. Kortikal PrA stammer fra forfedre som ligger i dorsal pallium og kan lett målrettes ved hjelp av in utero elektroporering av integrerende vektorer. En protokoll presenteres her for å merke disse cellene med multiaddressable genom-integrerende farge (MAGIC) Markører strategi, som er avhengig av piggyBac / Tol2 transposisjon og Cre /lox rekombinasjon til stochastically uttrykke distinkte fluorescerende proteiner (blå, cyan, gul og rød) adressert til bestemte subcellulære rom. Denne flerfargede skjebnekartleggingsstrategien gjør det mulig å markere in situ nærliggende kortikale stamfarer med kombinasjoner av fargemarkører før starten av gliogenese og å spore deres etterkommere, inkludert astrocytter, fra embryonale til voksne stadier på individcellenivå. Semi-sparsom merking oppnådd ved å justere konsentrasjonen av elektroporated vektorer og fargekontraster levert av Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC eller MM) gjør det mulig å individualisere astrocytter og utpeke deres territorium og komplekse morfologi til tross for deres tette anatomiske arrangement. Presentert her er en omfattende eksperimentell arbeidsflyt, inkludert detaljene i elektroporasjonsprosedyren, flerkanals bilde stabler oppkjøp av konfokal mikroskopi, og dataassistert tredimensjonal segmentering som gjør det mulig for eksperimentereren å vurdere individuell PrA-volum og morfologi. Oppsummert gir elektroporering av MAGIC en praktisk metode for å individuelt merke mange astrocytter og få tilgang til deres anatomiske egenskaper på ulike utviklingsstadier. Denne teknikken vil være nyttig for å analysere kortikale astrocytt morfologiske egenskaper i ulike musemodeller uten å ty til komplekse kors med transgene reporterlinjer.

Elektroporasjon av MAGIC Markører i embryonale kortikale stamfarer gjør det mulig å merke astrocytter fra tidlige til sene stadier av hjernebarkutvikling (figur 1). Disse astrocytter ble funnet i alle kortikale lag på ulike postnatale stadier (P4, P7, P21) som de spredte seg mye inn i hele hjernebarken. De ble vurdert med skrånende konfokale bilder ervervet med en 20x 0,8 NA (eller høyere NA) mål og montert som Z-stack rekonstruksjoner (Figur 2). MAGIC Ma...

Watch this Scientific Journal Video about In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes at JoVE.com

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color MAGIC Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

Astrocytter fliser hjernebarken jevnt, noe som gjør analysen av deres komplekse morfologi utfordrende på cellenivå. Protokollen som tilbys her bruker flerfarget merking basert på in utero elektroporasjon for å utpekulere kortikale astrocytter og analysere deres volum og morfologi med en brukervennlig bildeanalyserørledning.

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markører for å individualisere kortikale mus astrocytter

Protoplasmic astrocytes (PrA) located in the mouse cerebral cortex are tightly juxtaposed, forming an apparently continuous three-dimensional matrix at ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering og genetisk manipulering av dendritter og pigger i Mus hjernebarken og hippocampus hjelp<em&gt; I fosterlivet</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Isolasjon og kultur av mus Kortikale Astrocytes

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Ex utero Electroporation og Whole halvkule explants: A Simple Experimental Method for studier av tidlig kortikal utvikling

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetisk manipulering av musen Utvikling Hypothalamus gjennom<em&gt; I utero</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

Subtype-selektiv Electroporation av Cortical interneuroner

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- og striatum spesifikke<em&gt; I Utero</em&gt; Electroporation i C57BL / 6 mus

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...