Name: intratracheal instillation of stem cells in term neonatal rats
Uploaded: 2020-05-04T14:30:00
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Cette étude a été en partie soutenue par une subvention de Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan (A-109-008).

Cette procédure a été approuvée par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’Université médicale de Taipei.
REMARQUE : Les MSCs humains transfectés de protéines fluorescentes vertes (GFP) et de gènes de luciferase de lucferase de lucfly (Fluc) ont été obtenus auprès d’une société commerciale (Table of Materials).
1. Caractérisation des MSC humains avec luciferase de luciferase de lucfly et protéine fluorescente v...

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	<li>Ramanathan, R., Bhatia, J. J., Sekar, K., Ernst, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+in+preterm+infants+with+respiratory+distress+syndrome+treated+with+poractant+alfa,+calfactant+or+beractant:+a+retrospective+study.">Mortality in preterm infants with respiratory distress syndrome treated with poractant alfa, calfactant or beractant: a retrospective study.</a> Journal of Perinatology. 33, 119-125 (2013).</li><li>Gien, J., Kinsella, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+treatment+of+bronchopulmonary+dysplasia.">Pathogenesis and treatment of bronchopulmonary dysplasia.</a> Current Opinion in Pediatrics. 23, 305-313 (2011).</li><li>Pasha, A. B., Chen, X. Q., Zhou, G. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+attenuate+experimental+bronchopulmonary+dysplasia+induced+by+perinatal+inflammation+and+hyperoxia.">Human mesenchymal stem cells attenuate experimental bronchopulmonary dysplasia induced by perinatal inflammation and hyperoxia.</a> American Journal of Translational Research. 8, 342-353 (2016).</li><li>Chen, C. M., Chou, H. C., Lin, W., Tseng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+effects+on+the+viability+and+function+of+human+mesenchymal+stem+cells:+in+vitro+and+in+vivo+assessment.">Surfactant effects on the viability and function of human mesenchymal stem cells: in vitro and in vivo assessment.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8, 180 (2017).</li><li>Kim, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratracheal+transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+simultaneously+attenuates+both+lung+and+brain+injuries+in+hyperoxic+newborn+rats.">Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats.</a> Pediatric Research. 80, 415-424 (2016).</li><li>Fleurence, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+efficacy+of+intratracheal+adeno-associated+virus+administration+to+newborn+rats.">Comparative efficacy of intratracheal adeno-associated virus administration to newborn rats.</a> Human Gene Therapy. 16, 1298-1306 (2005).</li><li>Waszak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+intratracheal+adenoviral+vector+administration+on+lung+development+in+newborn+rats.">Effect of intratracheal adenoviral vector administration on lung development in newborn rats.</a> Human Gene Therapy. 13, 1873-1885 (2002).</li><li>O'Reilly, M., Th&#233;baud, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+bronchopulmonary+dysplasia.+The+term+rat+models.">Animal models of bronchopulmonary dysplasia. The term rat models.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307, 948 (2014).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+labeling+and+hepatic+differentiation+potential+of+human+placenta-derived+mesenchymal+stem+cells.">GFP labeling and hepatic differentiation potential of human placenta-derived mesenchymal stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 35, 2299-2308 (2015).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).</li><li>Zhang, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superior+osteogenic+capacity+for+bone+tissue+engineering+of+fetal+compared+with+perinatal+and+adult+mesenchymal+stem+cells.">Superior osteogenic capacity for bone tissue engineering of fetal compared with perinatal and adult mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 27, 126-137 (2009).</li><li>Huang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+surfactant+and+budesonide+on+pulmonary+distribution+of+fluorescent+dye+in+mice.">Effect of surfactant and budesonide on pulmonary distribution of fluorescent dye in mice.</a> Pediatric and Neonatology. 56, 19-24 (2015).</li><li>Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+looking+beyond+the+light.">Bioluminescence imaging: looking beyond the light.</a> Trends in Molecular Medicine. 18, 164-172 (2012).</li><li>Yeh, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-tracheal+administration+of+budesonide/surfactant+to+prevent+bronchopulmonary+dysplasia.">Intra-tracheal administration of budesonide/surfactant to prevent bronchopulmonary dysplasia.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193, 86-95 (2016).</li><li>Nguyen, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratracheal+inoculation+of+Fischer+344+rats+with+Francisella+tularensis.">Intratracheal inoculation of Fischer 344 rats with Francisella tularensis.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56123 (2017).</li><li>de Almeida, P. E., van Rappard, J. R., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+for+tracking+cell+fate+and+function.">In vivo bioluminescence for tracking cell fate and function.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 663-671 (2011).</li><li>Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+tracking+with+bioluminescence+imaging.">In vivo cell tracking with bioluminescence imaging.</a> Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49, 3-10 (2011).</li></ol>

Les nouveau-nés souffrant de détresse respiratoire ont généralement besoin d’un surfactant intratrachéal et/ou d’un traitement corticostéroïde19. Les essais cliniques de phase I chez l’homme ont démontré l’innocuité des MSC intratrachéaux chez les nouveau-nés prématurés8. Ces études suggèrent que l’administration intratrachéale des médicaments est une option importante pour les nouveau-nés souffrant de détresse respirato...

L’oxygène supplémentaire est souvent nécessaire pour traiter les nouveau-nés souffrant de détresse respiratoire1. Cependant, la thérapie d’hyperoxie chez les enfants en bas âge a des effets à long terme défavorables. L’exposition prolongée à des concentrations élevées d’oxygène conduit à l’inflammation et aux lésions pulmonaires aiguës, qui est semblable à la dysplasie bronchopulmonaire humaine (BPD)2. Le DBP est une complication majeure du traitement d’hyperoxie qui peut se produire en dépit de la thérapie de surfactant tôt, des procédures optimales de ventilation, et l’utilisation accrue de la ventilation positive non invasive de pression dans les enfants en bas âge prématurés. Alors que de nombreuses stratégies de traitement ont été rapportées pour bpd3, aucun traitement connu ne peut réduire cette complication.
L’utilisation de corticostéroïdes est un traitement potentiel pour prévenir le TPL, parce que l’inflammation pulmonaire joue un rôle crucial dans sa pathogénie. Cependant, la thérapie systémique de corticostéroïde n’est habituellement pas recommandée pour les nouveau-nés prématurés en raison des effets indésirables à long terme4,5.
Les cellules stromales mésenchymales (MSC) ont des caractéristiques pluripotentes et peuvent se différencier en différents types de cellules, y compris les os, le cartilage, les tissus adipeux, les muscles et les tendons6. Les MSC ont des effets immunomodulatoires, anti-inflammatoires et régénératifs7,et les études animales montrent les avantages thérapeutiques des MSC et de leurs composants sécrétés dans les lésions pulmonaires induites par l’hyperoxie chez les rongeurs8,9. La transplantation intratrachéale et intraveineuse de MSC a été montrée pour protéger contre des dommages hyperoxiques néonatals de poumon. Par conséquent, l’administration intratrachéale des cellules souches et la thérapie combinée de surfactant et de corticostéroïde pourrait être une stratégie potentielle de traitement pour traiter des nouveau-nés avec des désordres respiratoires. Des études précliniques ont utilisé l’administration intratrachéale des cellules souches et du virus adéno-associé chez les rats nouveau-nés10,11,12. Cependant, une présentation étape par étape de la technique et du suivi in vivo des cellules souches transplantées n’est pas disponible. Le rat nouveau-né est approprié pour étudier les effets de l’administration intratrachéale sur les nouveau-nés prématurés souffrant de détresse respiratoire parce que le stade saccular du poumon de rat à la naissance est équivalent à celui du poumon humain à 26−28 semaine de gestation13. Une méthode efficace d’administration dans la trachée de rat est cruciale pour la distribution pulmonaire réussie. La technique présentée ici permet l’étude de l’administration intratrachéale des cellules et/ou des médicaments pour le traitement des maladies pulmonaires néonatales utilisant des rats comme modèle pour l’homme.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-0 silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1916G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep Pad</td>
			<td>CSD</td>
			<td>3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Stemflow hMSC Analysis Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562245</td>
			<td>CD markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMV-Luciferase-EF1&#945;-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging</td>
			<td>SBI</td>
			<td>BLIV511PA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor10</td>
			<td>BioLife Solutions</td>
			<td>640222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MSCs</td>
			<td>Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared light</td>
			<td>JING SHANG</td>
			<td>JS300T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Halocarbon</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS-200 small animal imaging system</td>
			<td>Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferin potassium salt</td>
			<td>Promega, Madison, WI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-scissors, straight</td>
			<td>Vannas</td>
			<td>H4240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline</td>
			<td>TAIWAN BIOTECH CO., LTD.</td>
			<td>113531</td>
			<td>Isotonic Sodium Chloride Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Hub RN Needle, 30 gauge</td>
			<td>Hamilton Company, Reno, NV</td>
			<td>7799-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (100 &#181;l)</td>
			<td>Hamilton Company, Reno, NV</td>
			<td>81065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen Living Image 2.5 software</td>
			<td>Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intratracheal instillation of stem cells in term neonatal rats

L’exposition prolongée à des concentrations élevées d’oxygène conduit à l’inflammation et aux lésions pulmonaires aiguës, qui sont semblables à la dysplasie bronchopulmonaire humaine (BPD). Chez les nourrissons prématurés, le TPL est une complication majeure malgré l’utilisation précoce de la thérapie surfactante, des stratégies de ventilation optimales et de la ventilation à pression positive non invasive. Parce que l’inflammation pulmonaire joue un rôle crucial dans la pathogénie de la BPD, l’utilisation de corticostéroïdes est un traitement potentiel pour le prévenir. Néanmoins, le traitement systémique des corticostéroïdes n’est généralement pas recommandé pour les nouveau-nés prématurés en raison d’effets indésirables à long terme. Les études précliniques et les essais cliniques de phase I chez l’homme ont démontré que l’utilisation de cellules stromales mésenchymales (MSC) dans les lésions pulmonaires induites par l’hyperoxie et chez les nouveau-nés prématurés est sûre et faisable. La transplantation intratrachéale et intraveineuse de MSC a été montrée pour protéger contre des dommages hyperoxiques néonatals de poumon. Par conséquent, l’administration intratrachéale des cellules souches et du traitement combiné surfactant et glucocorticoïde est apparue comme une nouvelle stratégie pour traiter les nouveau-nés atteints de troubles respiratoires. Le stade de développement des poumons de rat à la naissance est équivalent à celui dans les poumons humains à 26−28 semaines de gestation. Par conséquent, les rats nouveau-nés sont appropriés pour étudier l’administration intratrachéale aux nouveau-nés prématurés présentant la détresse respiratoire pour évaluer son efficacité. Cette technique d’instillation intratrachéale est une option cliniquement viable pour la livraison de cellules souches et de médicaments dans les poumons.

La distribution pulmonaire de l’instillation intratrachéale des cellules souches dans le terme rats néonatals a été déterminée par des cellules souches étiquetées luciferase de luciferase de firefly (Fluc). Les MSC ont été étiquetés avec Fluc et étiquetés avec des protéines fluorescentes vertes par transduction lentiviral. La figure 1A montre un niveau élevé d’expression GFP dans les MSC humains, et 93,7 % de la population a montré l’expression positive de GFP détect...

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Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

Décrit est un protocole pour effectuer la transplantation intratrachéale des cellules stromales mésenchymales (MSCs) par injection intratrachéale dans les rats néonatals terme. Cette technique est une option cliniquement viable pour l’administration de cellules souches et de médicaments dans les poumons néonatals de rat pour évaluer leur efficacité.

Instillation intratrachéale des cellules souches chez les rats néonatals à terme

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...

L’instillation intratrachéale est une biotechnique clinique pour la livraison de cellules souches et de médicaments dans un poumon néonatal afin d’évaluer l’efficacité de Chilman. Cette technique peut être de bonne foi pour une utilisation avec une variété d’application primaire chez un rat néonatal et est une mesure relativement facile et rentable pour le traitement des maladies pulmonaires. Le cinquième jour postnatal, retenir les chiots rat Sprague-Dawley anesthésiés, sur un support d’intubation à angle de 60 degrés.Et apposer du ruban adhésif d’étiquetage de laboratoire sur les quatre membres de chaque chiot pour les fixer en place. Appliquez du ruban adhésif sous chaque nez pour fixer les têtes. Et localiser le premier cou pour la trachéotomie de perforation.Utilisez un tampon de préparation à 75 % d’alcool pour désinfecter la zone d’incision. Et faire une incision verticale de 3 centimètres au-dessus de la trachée pour éviter d’endommager les artères carotides. Utilisez des pinces coniques incurvées sans crochet pour dissocier les couches de graisse et de muscle pour localiser la trachée.Lorsque la trachée peut être observée, utilisez la pince à épiler pour saisir la trachée et utilisez une seringue de 100 microlitres équipée d’une aiguille de calibre 30 pour injecter une fois dix de la cinquième luciferase luciferase GFP étiquetée cellules stromal mésenchymales dans 30 microlitres de solution saline dans la trachée, pendant la phase inspiratoire. Lorsque toutes les cellules ont été injectées, fermer l’incision avec 160 points de soie lissant le nœud aussi étroitement que possible. Et couper les extrémités de la suture aussi court que possible.Ensuite, laissez le chiot se remettre de l’anesthésie, dans un endroit chaud avec surveillance jusqu’à ce qu’il soit chaud, rose, et capable de mouvement spontané avant de retourner l’animal dans sa cage. Pour suivre les cellules stromales humaines transplantées 15 minutes après que les rats se sont remis de la chirurgie, injectez intraperitoneally les chiots ré-anesthésiés avec 125 milligrammes par kilogramme de sel de potassium luciferien dans PBS. 10 minutes après l’injection, utilisez un système d’imagerie pour les petits animaux pour acquérir des images séquentielles à intervalles de 5 à 15 secondes avec un binning moyen, un arrêt de 1 f et un champ de vision de 26 centimètres.Utilisez ensuite le logiciel d’imagerie pour quantifier l’activité de luminescence des poumons en fonction des régions d’intérêt automatiques. Un niveau élevé d’expression de GFP est observé dans luciferase firefly étiqueté cellules souches mésenchymales humaines. Les cellules souches mésenchymales peuvent être encore caractérisées par leur expression de marqueur de surface cellulaire et leur capacité à se différencier en ostéocytes, chondrocytes et adipocytes.La formation image de luminescence des cellules mésenchymales humaines transplantées dans VIVO, indique une absence de signalisation luminescente dans les régions pulmonaires des rats traités avec la solution saline normale. Chez les rats traités avec des cellules souches mésenchymales, la luminescence est observée dans la trachée et les régions pulmonaires centrales de ces animaux. En effet, dans cette analyse représentative, la quantification de l’intensité de luminescence a indiqué que les rats traités avec les cellules souches mésenchymales ont exhibé une augmentation approximativement 13 fois de l’activité de luminescence comparée aux rats traités avec la solution saline normale.Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de disséquer et d’isoler la trachée sans limiter les artères environnantes. Cette technique permet d’étudier les effets de l’administration intratracheal des cellules et des drogues de la maladie néonatale de Palmer utilisant des rayons avec le mode du patient humain.

Research

JoVE Journal

Medicine

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