Name: intratracheal instillation of stem cells in term neonatal rats
Uploaded: 2020-05-04T14:30:00
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Questo studio è stato in parte sostenuto da una sovvenzione di Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan (A-109-008).

Questa procedura è stata approvata dal comitato per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di Medicina di Taipei.
NOTA: le MSC umane sono state equamente trascate da proteine fluorescenti verdi (GFP) e geni di luciferasi delle lucciole (Fluc) ottenuti da un'azienda commerciale (Tabella dei materiali).
1. Caratterizzazione di MSC umani con luciferasi della lucciola e proteina fluorescente verde
<ol><li>Mantenere le MSC umane trascate c...

<ol>
	<li>Ramanathan, R., Bhatia, J. J., Sekar, K., Ernst, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+in+preterm+infants+with+respiratory+distress+syndrome+treated+with+poractant+alfa,+calfactant+or+beractant:+a+retrospective+study.">Mortality in preterm infants with respiratory distress syndrome treated with poractant alfa, calfactant or beractant: a retrospective study.</a> Journal of Perinatology. 33, 119-125 (2013).</li><li>Gien, J., Kinsella, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+treatment+of+bronchopulmonary+dysplasia.">Pathogenesis and treatment of bronchopulmonary dysplasia.</a> Current Opinion in Pediatrics. 23, 305-313 (2011).</li><li>Pasha, A. B., Chen, X. Q., Zhou, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchopulmonary+dysplasia:+Pathogenesis+and+treatment.">Bronchopulmonary dysplasia: Pathogenesis and treatment.</a> Experimental and Therapeutic. 16, 4315-4321 (2018).</li><li>Committee on Fetus and Newborn. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+corticosteroids+to+treat+or+prevent+chronic+lung+disease+in+preterm+infants.">Postnatal corticosteroids to treat or prevent chronic lung disease in preterm infants.</a> Pediatrics. 109, 330-338 (2002).</li><li>Watterberg, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Academy+of+Pediatrics;+Committee+on+Fetus+and+Newborn.+Policy+statement-postnatal+corticosteroids+to+prevent+or+treat+bronchopulmonary+dysplasia.">American Academy of Pediatrics; Committee on Fetus and Newborn. Policy statement-postnatal corticosteroids to prevent or treat bronchopulmonary dysplasia.</a> Pediatrics. 126, 800-808 (2010).</li><li>Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+stromal+cells+as+stem+cells+for+nonhematopoietic+tissues.">Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues.</a> Science. 276, 71-74 (1997).</li><li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E(2)-+dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+interleukin-10+production.">Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)- dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production.</a> Nature Medicine. 15 (2), 42-49 (2009).</li><li>Chou, H. C., Li, Y. T., Chen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cells+attenuate+experimental+bronchopulmonary+dysplasia+induced+by+perinatal+inflammation+and+hyperoxia.">Human mesenchymal stem cells attenuate experimental bronchopulmonary dysplasia induced by perinatal inflammation and hyperoxia.</a> American Journal of Translational Research. 8, 342-353 (2016).</li><li>Chen, C. M., Chou, H. C., Lin, W., Tseng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactant+effects+on+the+viability+and+function+of+human+mesenchymal+stem+cells:+in+vitro+and+in+vivo+assessment.">Surfactant effects on the viability and function of human mesenchymal stem cells: in vitro and in vivo assessment.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8, 180 (2017).</li><li>Kim, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratracheal+transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+simultaneously+attenuates+both+lung+and+brain+injuries+in+hyperoxic+newborn+rats.">Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats.</a> Pediatric Research. 80, 415-424 (2016).</li><li>Fleurence, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+efficacy+of+intratracheal+adeno-associated+virus+administration+to+newborn+rats.">Comparative efficacy of intratracheal adeno-associated virus administration to newborn rats.</a> Human Gene Therapy. 16, 1298-1306 (2005).</li><li>Waszak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+intratracheal+adenoviral+vector+administration+on+lung+development+in+newborn+rats.">Effect of intratracheal adenoviral vector administration on lung development in newborn rats.</a> Human Gene Therapy. 13, 1873-1885 (2002).</li><li>O'Reilly, M., Th&#233;baud, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+bronchopulmonary+dysplasia.+The+term+rat+models.">Animal models of bronchopulmonary dysplasia. The term rat models.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307, 948 (2014).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+labeling+and+hepatic+differentiation+potential+of+human+placenta-derived+mesenchymal+stem+cells.">GFP labeling and hepatic differentiation potential of human placenta-derived mesenchymal stem cells.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 35, 2299-2308 (2015).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).</li><li>Zhang, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superior+osteogenic+capacity+for+bone+tissue+engineering+of+fetal+compared+with+perinatal+and+adult+mesenchymal+stem+cells.">Superior osteogenic capacity for bone tissue engineering of fetal compared with perinatal and adult mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 27, 126-137 (2009).</li><li>Huang, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+surfactant+and+budesonide+on+pulmonary+distribution+of+fluorescent+dye+in+mice.">Effect of surfactant and budesonide on pulmonary distribution of fluorescent dye in mice.</a> Pediatric and Neonatology. 56, 19-24 (2015).</li><li>Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+looking+beyond+the+light.">Bioluminescence imaging: looking beyond the light.</a> Trends in Molecular Medicine. 18, 164-172 (2012).</li><li>Yeh, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-tracheal+administration+of+budesonide/surfactant+to+prevent+bronchopulmonary+dysplasia.">Intra-tracheal administration of budesonide/surfactant to prevent bronchopulmonary dysplasia.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193, 86-95 (2016).</li><li>Nguyen, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratracheal+inoculation+of+Fischer+344+rats+with+Francisella+tularensis.">Intratracheal inoculation of Fischer 344 rats with Francisella tularensis.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), e56123 (2017).</li><li>de Almeida, P. E., van Rappard, J. R., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+for+tracking+cell+fate+and+function.">In vivo bioluminescence for tracking cell fate and function.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 663-671 (2011).</li><li>Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+tracking+with+bioluminescence+imaging.">In vivo cell tracking with bioluminescence imaging.</a> Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49, 3-10 (2011).</li></ol>

I neonati con difficoltà respiratorie richiedono comunemente un surfactant intratracheale e/o trattamento corticosteroide19. Gli studi clinici sulla fase i umana hanno dimostrato la sicurezza delle comunicazioni e le comunicazioni amoanzi intratracheali nei neonati pretermine8. Questi studi suggeriscono che la somministrazione intratracheale dei farmaci è un'opzione importante per i neonati con difficoltà respiratorie. Gli studi sui modelli animal...

L'ossigeno supplementare è spesso necessario per trattare i neonati con difficoltà respiratorie1. Tuttavia, la terapia iperossia nei neonati ha effetti negativi a lungo termine. L'esposizione prolungata ad alte concentrazioni di ossigeno porta a infiammazione e lesioni polmonari acute, che è simile alla displasia broncopolmonare umana (BPD)2. La BPD è una delle principali complicanze del trattamento con iperossia che può verificarsi nonostante la terapia precoce, le procedure di ventilazione ottimali e l'aumento dell'uso della ventilazione a pressione positiva non invasiva nei neonati prematuri. Mentre molte strategie di trattamento sono state segnalate per BPD3, nessuna terapia nota può ridurre questa complicazione.
L'uso di corticosteroidi è un potenziale trattamento per prevenire la BPD, perché l'infiammazione polmonare svolge un ruolo cruciale nella sua patogenesi. Tuttavia, la terapia sistemica corticosteroide non è solitamente raccomandata per i neonati pretermine a causa di effetti avversi a lungo termine4,5.
Le cellule stromali mesenchymal (MSC) hanno caratteristiche pluripotenti e possono differenziarsi in vari tipi di cellule, tra cui osso, cartilagine, tessuto adiposo, muscolo e tendini6. Le MSC hanno effetti immunomodulatori, antinfiammatori e rigenerativi7, e gli studi sugli animali mostrano i benefici terapeutici delle MSC e dei loro componenti secreti in lesioni polmonari indotte da iperossia nei roditori8,9. Il trapianto intratracheale e intravenoso di MSC ha dimostrato di proteggere contro lesioni polmonari iperossiche neoatali. Pertanto, la somministrazione intratracheale delle cellule staminali e la terapia combinata di surfactant e corticosteroidi potrebbero essere una potenziale strategia di trattamento per il trattamento dei neonati con disturbi respiratori. Studi preclinici hanno utilizzato la somministrazione intratracheale delle cellule staminali e del virus adeno-associato nei ratti neonati10,11,12. Tuttavia, non è disponibile una presentazione passo-passo della tecnica e il monitoraggio in vivo delle cellule staminali trapiantate. Il ratto appena nato è adatto per studiare gli effetti della somministrazione intratracheale sui neonati con difficoltà respiratorie perché lo stadio saccolare del polmone del ratto alla nascita è equivalente a quello del polmone umano a 26-28 settimane di gestazione13. Un metodo efficace per la somministrazione nella trachea del ratto è fondamentale per una distribuzione polmonare di successo. La tecnica qui presentata consente lo studio della somministrazione intratracheale di cellule e/o farmaci per il trattamento di malattie polmonari neomotorie utilizzando ratti come modello per gli esseri umani.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-0 silk</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1916G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep Pad</td>
			<td>CSD</td>
			<td>3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Stemflow hMSC Analysis Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562245</td>
			<td>CD markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMV-Luciferase-EF1&#945;-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging</td>
			<td>SBI</td>
			<td>BLIV511PA-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor10</td>
			<td>BioLife Solutions</td>
			<td>640222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human MSCs</td>
			<td>Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared light</td>
			<td>JING SHANG</td>
			<td>JS300T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Halocarbon</td>
			<td>26675-46-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS-200 small animal imaging system</td>
			<td>Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferin potassium salt</td>
			<td>Promega, Madison, WI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-scissors, straight</td>
			<td>Vannas</td>
			<td>H4240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline</td>
			<td>TAIWAN BIOTECH CO., LTD.</td>
			<td>113531</td>
			<td>Isotonic Sodium Chloride Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Hub RN Needle, 30 gauge</td>
			<td>Hamilton Company, Reno, NV</td>
			<td>7799-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (100 &#181;l)</td>
			<td>Hamilton Company, Reno, NV</td>
			<td>81065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen Living Image 2.5 software</td>
			<td>Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intratracheal instillation of stem cells in term neonatal rats

L'esposizione prolungata ad alte concentrazioni di ossigeno porta a infiammazione e lesioni polmonari acute, che è simile alla displasia broncopolmonare umana (BPD). Nei neonati prematuri, la BPD è una complicazione importante nonostante l'uso precoce della terapia surfactant, le strategie di ventilazione ottimali e la ventilazione a pressione positiva non invasiva. Poiché l'infiammazione polmonare svolge un ruolo cruciale nella patogenesi della BPD, l'uso di corticosteroidi è un potenziale trattamento per prevenirlo. Tuttavia, il trattamento corticosteroide sistemico non è solitamente raccomandato per i neonati pretermine a causa di effetti avversi a lungo termine. Studi preclinici e studi clinici di fase io hanno dimostrato che l'uso di cellule stromali mesenchymale (MSC) in lesioni polmonari indotte da iperossia e nei neonati pretermine è sicuro e fattibile. Il trapianto intratracheale e intravenoso di MSC ha dimostrato di proteggere contro lesioni polmonari iperossiche neoatali. Pertanto, la somministrazione intratracheale delle cellule staminali e il trattamento combinato di surfactant e glucocorticoide è emerso come una nuova strategia per il trattamento dei neonati con disturbi respiratori. Lo stadio di sviluppo dei polmoni di ratto alla nascita è equivalente a quello dei polmoni umani a 26-28 settimane di gestazione. Quindi, i ratti appena nati sono appropriati per studiare la somministrazione intratracheale ai neonati pretermine con difficoltà respiratorie per valutarne l'efficacia. Questa tecnica di instillazione intratracheale è un'opzione clinicamente praticabile per la consegna di cellule staminali e farmaci nei polmoni.

La distribuzione polmonare dell'instillazione intratracheale delle cellule staminali nei ratti neo-neoanati è stata determinata dalle cellule staminali con etichettatura della lucciola luciferasi (Fluc). Le MSC sono state etichettate con Fluc e etichettate con proteine fluorescenti verdi attraverso la trasduzione lentivirale. La figura 1A mostra un alto livello di espressione GFP nelle MSC umane e il 93,7% della popolazione ha mostrato che l'espressione positiva di GFP rilevata dalla citome...

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Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats

Descritto è un protocollo per eseguire il trapianto intratracheale di cellule stromali mesenchymale (MSC) attraverso l'iniezione intratracheale in ratti neonatici. Questa tecnica è un'opzione clinicamente praticabile per la somministrazione di cellule staminali e farmaci nei polmoni di ratto neoatale per valutarne l'efficacia.

Instillazione intratracheale delle cellule staminali nei " ratti neooatali

Prolonged exposure to high concentrations of oxygen leads to inflammation and acute lung injury, which is similar to human bronchopulmonary dysplasia ...

L'instillazione intratracheale è una biotecnologia clinica per la somministrazione di cellule staminali e farmaci in un polmone neonatale per valutare l'efficacia di Chilman. Questa tecnica può essere in buona fede per l'uso con una varietà di applicazione primaria in un ratto neonatale ed è una misura relativamente facile ed economica per il trattamento delle malattie polmonari. Il quinto giorno postnatale, trattenete i cuccioli di ratto Sprague-Dawley anestetizzati, su un supporto di intubazione angolato di 60 gradi.E apporre nastro adesivo da laboratorio a tutti e quattro gli arti di ogni cucciolo per fissarli in posizione. Applicare il nastro sotto ogni naso per fissare le teste. E individuare il primo collo per la tracheotomia delle forature.Utilizzare un tampone di preparazione alcolico al 75% per disinfettare l'area di incisione. E fare un'incisione verticale della linea mediana di 3 centimetri sopra la trachea per evitare di danneggiare le arterie carotidee. Utilizzare pinzette affusolata curve senza gancio per dissociare gli strati di grasso e muscoli per localizzare la trachea.Quando la trachea può essere osservata, utilizzare le pinzette per afferrare la trachea e utilizzare una siringa da 100 microlitri dotata di un ago calibro 30 per iniettare una per dieci della quinta lucciola luciferasi GFP etichettata cellule stromali mesenchimali in 30 microlitri di saline nella trachea, durante la fase inspiratoria. Quando tutte le cellule sono state iniettate, chiudere l'incisione con 160 punti di seta legando il nodo il più strettamente possibile. E tagliare le estremità della sutura il più breve possibile.Quindi consentire al cucciolo di riprendersi dall'anestesia, in un punto caldo con monitoraggio fino a quando non è caldo, rosa e capace di movimento spontaneo prima di riportare l'animale nella sua gabbia. Per rintracciare le cellule stromali mesenchimali umane trapiantate 15 minuti dopo che i ratti si sono ripresi dall'intervento chirurgico, iniettare intraperitonealmente i cuccioli riaestetizzati con 125 milligrammi per chilogrammo di sale di potassio luciferiano in PBS. 10 minuti dopo l'iniezione, utilizzare un piccolo sistema di imaging animale per acquisire immagini sequenziali a intervalli di 5-15 secondi con un binning medio, un 1 f-stop e un campo visivo di 26 centimetri.Quindi utilizzare il software di imaging per quantificare l'attività di luminescenza dai polmoni in base alle regioni automatiche di interesse. Un alto livello di espressione della FPG è osservato nella lucciola luciferasi etichettata come cellule staminali mesenchimali umane. Le cellule staminali mesenchimali possono essere ulteriormente caratterizzate dalla loro espressione marcatore della superficie cellulare e dalla loro capacità di differenziarsi in osteociti, condrociti e adipociti.L'imaging di luminescenza delle cellule mesenchimali umane trapiantate in VIVO rivela l'assenza di segnalazione luminescente nelle regioni polmonari dei ratti trattati con soluzione salina normale. Nei ratti trattati con cellule staminali mesenchimali, la luminescenza si osserva all'interno della trachea e delle regioni polmonari centrali di tali animali. In effetti, in questa analisi rappresentativa, la quantificazione dell'intensità della luminescenza ha rivelato che i ratti trattati con cellule staminali mesenchimali presentavano un aumento di circa 13 volte dell'attività di luminescenza rispetto ai ratti trattati con soluzione salina normale.Quando si tenta questa procedura, è importante sezionare e isolare la trachea senza limitare le arterie circostanti. Questa tecnica consente lo studio degli effetti della somministrazione intratracheale di cellule e farmaci della malattia neonatale palmer usando raggi con la modalità del paziente umano.

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