Name: intra-arterial delivery of neural stem cells to the rat and mouse brain: application to cerebral ischemia
Uploaded: 2020-06-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door het volgende: AHA Award 14SDG20480186 voor LC, Subject innovation team van Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 for BZ, en Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust grant 14-12A for KES and LC.

Alle procedures over dierlijke onderwerpen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Kentucky, en de juiste zorg werd genomen om stress of pijn in verband met chirurgie te minimaliseren.
1. Bereiding van injectiekatheter en chirurgische haken
<ol><li>Bouw de injectiekatheter (figuur 1). Verzamel de benodigde materialen, waaronder: MRE010, MRE025 en MRE050 buizen, 20 G, 26 G en 27 G injectienaalden (<st...

<ol>
	<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+research+in+2017:+surgical+progress+and+stem-cell+advances.">Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances.</a> The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).</li><li>Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transplantation+therapy+for+stroke.">Cell transplantation therapy for stroke.</a> Stroke. 38, 817-826 (2007).</li><li>Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+therapy+for+subacute+and+chronic+ischemic+stroke.">Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9, 154 (2018).</li><li>Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+Brain+Cells+for+Stroke+Patients+Using+Pluripotent+Stem+Cells.">Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells.</a> Stroke. 49, 1091-1098 (2018).</li><li>Savitz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Stem+Cells+the+Next+Generation+of+Stroke+Therapeutics.">Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics.</a> Stroke. 49, 1056-1057 (2018).</li><li>Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Therapy+for+Chronic+Stroke.">Cell Therapy for Chronic Stroke.</a> Stroke. 49, 1066-1074 (2018).</li><li>Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+design+for+stem+cell+therapies+in+stroke:+What+have+we+learned.">Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned.</a> Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).</li><li>Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-Arterial+Delivery+of+Cell+Therapies+for+Stroke.">Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke.</a> Stroke. 49, 1075-1082 (2018).</li><li>Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-arterial+delivery+of+cell+therapies+for+stroke.">Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke.</a> Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).</li><li>Argibay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraarterial+route+increases+the+risk+of+cerebral+lesions+after+mesenchymal+cell+administration+in+animal+model+of+ischemia.">Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia.</a> Scientific Reports. 7, 40758 (2017).</li><li>Kelly, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+human+fetal+neural+stem+cells+survive,+migrate,+and+differentiate+in+ischemic+rat+cerebral+cortex.">Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).</li><li>Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+microport+technique+for+applications+in+cerebrovascular+research.">Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research.</a> Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).</li><li>Fischer, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+passage+is+a+major+obstacle+for+intravenous+stem+cell+delivery:+the+pulmonary+first-pass+effect.">Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect.</a> Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).</li><li>Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+in+ischemic+stroke:+role+of+IV+and+intra-arterial+therapy.">Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy.</a> Neurology. 79, 207-212 (2012).</li><li>Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+delivery+of+stem+cells.">Intracranial delivery of stem cells.</a> Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).</li><li>Boltze, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dark+Side+of+the+Force+-+Constraints+and+Complications+of+Cell+Therapies+for+Stroke.">The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke.</a> Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+noncontact+speckle+contrast+diffuse+correlation+tomography+of+cerebral+blood+flow+in+rats.">Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats.</a> Neuroimage. 198, 160-169 (2019).</li><li>Wong, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+Cerebral+Ischemic+Injury+in+Smad1+Deficient+Mice.">Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice.</a> PLoS One. 10, 0136967 (2015).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+telomerase+activity+aggravates+the+blood-brain+barrier+disruption+and+neuroinflammatory+responses+in+a+model+of+experimental+stroke.">Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke.</a> Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).</li><li>Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+doublecortin-expressing+population+in+the+developing+and+adult+brain+contains+multipotential+precursors+in+addition+to+neuronal-lineage+cells.">The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells.</a> The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3, 20130001 (2013).</li><li>Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Ischemic+Stroke+and+Ischemia-reperfusion+in+Mice+Using+the+Middle+Artery+Occlusion+Technique+and+Visualization+of+Infarct+Area.">Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Microsurgery+Infusion+Technique+for+Targeted+Substance+Delivery+into+the+CNS+via+the+Internal+Carotid+Artery.">Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chua, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-arterial+injection+of+neural+stem+cells+using+a+microneedle+technique+does+not+cause+microembolic+strokes.">Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).</li><li>Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Devices+for+cell+transplantation+into+the+central+nervous+system:+Design+considerations+and+emerging+technologies.">Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies.</a> Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).</li><li>Duma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intracerebroventricular+(ICV)+injection+of+autologous,+non-engineered,+adipose-derived+stromal+vascular+fraction+(ADSVF)+for+neurodegenerative+disorders:+results+of+a+3-year+phase+1+study+of+113+injections+in+31+patients.">Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients.</a> Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).</li></ol>

Stamceltherapie voor neurologische aandoeningen bevindt zich nog in een vroeg verkennend stadium. Een belangrijk probleem is dat er geen vaste methode is voor voldoende levering van SCs of NSC's in de hersenen.
Hoewel exogene SCs/NSC's in de hersenen kunnen worden gedetecteerd na intraveneuze (IV), intraperitoneale (IP) of intraparenchymale/intracerebrale injectie, heeft elke leveringsbenadering nadelen. De detecteerbare populatie in de hersenen wordt geschat op zeer laag met perifere injectie...

Stamceltherapie (SC) heeft een enorm potentieel als behandeling voor neurologische aandoeningen, waaronder beroerte, hoofdtrauma en dementie1,,2,,3,,4,,5,6. Een efficiënte methode om exogene SCs aan de zieke hersenen te leveren blijft echter problematisch2,6,7,8,9,,10,11,12,13. SC's die via perifere leveringsroutes worden geleverd, waaronder intraveneuze (IV) of intraperitoneale (IP)-injectie, zijn onderhevig aan eerste-pass-filtering in de microcirculatie, met name in de longen, lever, milt en spier8,,9,13,14, waardoor de kans op accumulatie van cellen in niet-doelgebieden toeneemt. De invasieve intracerebrale injectiemethode resulteert in gelokaliseerde schade aan hersenweefsel en een zeer beperkte verspreiding van SC's in de buurt van de injectieplaats2,6,8,14,15,16. We hebben onlangs een katheter-gebaseerde intra-arteriële injectie methode om exogene neurale SCs leveren, die hier wordt beschreven toegepast in een knaagdier model van focal ischemische beroerte. We induceren tijdelijke (1 h) ischemie-reperfusie letsel in een halfrond met behulp van een siliconen rubber gecoate gloeidraad om de linker middelste hersenslagader (MCA) in de muis of rat17,,18,19occlude . In dit model hebben we reproducibly waargenomen ongeveer 75-85% depressie van cerebrale bloedstroom (CBF) in ipsilaterale hemisfeer met Laser Doppler of Laser speckle imaging17,19, waardoor consistente neurologische tekorten17,18,19.
Voor tijdbesparende doeleinden wordt de video ingesteld om twee keer de normale snelheid en routinematige chirurgische ingrepen af te spelen, zoals huidvoorbereiding en wondsluiting met hechting en het gebruik en de installatie van de gemotoriseerde spuitpomp worden niet gepresenteerd. De methode van intra-arteriële levering van NSC's wordt aangetoond in de context van het midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) model van experimentele beroerte bij knaagdieren. Daarom nemen we de voorbijgaande ischemische beroerteprocedure op om later aan te tonen hoe de tweede operatie, de intra-arteriële injectie, wordt uitgevoerd met behulp van de vorige chirurgische plaats op hetzelfde dier. De haalbaarheid van intra-arteriële NSC levering in knaagdier slag modellen wordt aangetoond door het beoordelen van de distributie en overleving van exogene NSC's. De werkzaamheid van NSC-therapie om hersenpathologie en neurologische disfunctie te verzachten, wordt afzonderlijk gerapporteerd.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305175</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305111</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305136</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 NFS-2 suture with needle</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>56905</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 nylon suture</td>
			<td>Teleflex/Braintree Scientific</td>
			<td>104-s</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7922</td>
			<td>cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blade</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>10</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine-SR Lab</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>Buprenorphine-SR Lab&#174;</td>
			<td>analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium/magnisum free PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-0500</td>
			<td>NSC dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>180063</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>50562-1</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCAO filament for mouse</td>
			<td>Doccol</td>
			<td>702223PK5Re</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCAO filament for rat</td>
			<td>Doccol</td>
			<td>503334PK5Re</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE010 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE010</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE025 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE025</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE050 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE050</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu-Tears Ointment</td>
			<td>NuLife Pharmaceuticals</td>
			<td>Nu-Tears Ointment</td>
			<td>eye care during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00649-11</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00632-11</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Pacer Technology</td>
			<td>15187</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>GenieTouch</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAb1637</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-component 5 minute epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>20445</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vascular clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00400-03</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-arterial delivery of neural stem cells to the rat and mouse brain: application to cerebral ischemia

Neurale stamcel (NSC) therapie is een opkomende innovatieve behandeling voor beroerte, traumatisch hersenletsel en neurodegeneratieve aandoeningen. In vergelijking met intracraniale levering, intra-arteriële toediening van NSC's is minder invasief en produceert een meer diffuse distributie van NSC's binnen de hersenen parenchyma. Verder, intra-arteriële levering maakt de eerste-pass effect in de hersenen circulatie, het verminderen van het potentieel voor het vangen van cellen in perifere organen, zoals lever en milt, een complicatie in verband met perifere injecties. Hier beschrijven we de methodologie, bij zowel muizen als ratten, voor de levering van NSC's via de gemeenschappelijke halsslagader (muis) of externe halsslagader (rat) aan het ipsilaterale halfrond na een ischemische beroerte. Met behulp van GFP-gelabelde NSC's illustreren we de wijdverspreide verspreiding die op het knaagdierilaterale halfrond wordt bereikt op 1 d, 1 week en 4 weken na de postischemische levering, met een hogere dichtheid in of nabij de ischemische letsellocatie. Naast de overleving op lange termijn, tonen we bewijs van differentiatie van GFP-gelabelde cellen na 4 weken. De intra-arteriële leveringsbenadering die hier voor NSC's wordt beschreven, kan ook worden gebruikt voor toediening van therapeutische verbindingen, en heeft dus een brede toepasbaarheid op uiteenlopende CNS-letsel- en ziektemodellen voor meerdere soorten.

GFP-gelabelde NSC's werden gemakkelijk gedetecteerd in de ischemische hersenen, meestal in het ipsilaterale halfrond, vooral in de penumbra en langs de letselrand(figuur 6). De examinator was blind tijdens beeldvorming en analyse.
Bijvoorbeeld, op 1 d na injectie, NSC's werden gedetecteerd in de muis hippocampus. Een subset van NSC's toonde co-expressie van de onrijpe neuron marker DCX in de dentate gyrus, zelfs op dit vroege tijdstip(figuur 6...

Watch this Scientific Journal Video about Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia at JoVE.com

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Een methode voor het leveren van neurale stamcellen, aanpasbaar voor het injecteren van oplossingen of schorsingen, via de gemeenschappelijke halsslagader (muis) of externe halsslagader (rat) na ischemische beroerte wordt gemeld. Geïnjecteerde cellen worden breed verspreid over de hersenen parenchyma en kan worden gedetecteerd tot 30 d na de bevalling.

Intra-arteriële levering van neurale stamcellen aan de Rat en Mouse Brain: Toepassing op cerebrale ischemie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Beroerte is de belangrijkste oorzaak van sterfte en invaliditeit wereldwijd. Hoewel trombose en chirurgische verwijdering van cerebrale vasculaire occlusie kan worden uitgevoerd bij bepaalde patiënten, zijn er nog steeds een dringende behoefte aan effectieve therapieën tegen een beroerte. Hier demonstreren we een katheter-gebaseerde, intra-arteriële levering van stamcellen aan het ischemische halfrond als een potentieel regime voor beroertetherapie.Eerst introduceren we hoe we de injectiekatheter en chirurgische haken kunnen bereiden. We ontwierpen twee soorten injectiekatheters voor intra-arteriële injectie. Ontwerp een wordt gebruikt voor injectie van een oplossing of suspensie die niet hoeft te spoelen van de buis.Ontwerp twee maakt injectie van neurale stamcellen mogelijk, gevolgd door een flush van het dode volume om het volledige volume te leveren. Voor het bouwen van een set injectiekatheters hebt u 26 meter en 20 meter naalden nodig, een lengte van 10 tot 15 centimeter van MRE 25 katheter en drie centimeter lengte van MRE 50 en MRE 10 katheters. Snijd zowel naald tips en polijsten het metalen uiteinde op schuurpapier om de buis te heropenen en glad de randen en vervolgens spoelen met gedestilleerd water schoon te maken van de boring en afwassen puin.De figuur toont een gesloten uiteinde van een 20-meter naald na het afknippen van de naaldpunt, die na het polijsten met een gladde boring wordt heropend. Plaats onder een microscoop de 20-meter naald in het uiteinde van de MRE 50-slang. Buig de 26-meter naald en vervolgens doordringen in de slang onder het einde van de 20 meter naald tip.Zet de 26-meter naald vast met superlijm. Dan insluiten de twee naald hubs en de slang en epoxy om een solide blok te bouwen om de sterkte te verbeteren. U zult ook drie chirurgische haken nodig hebben om het weefsel in positie te houden voor een betere blootstelling van de chirurgische plaatsen.Snijd een anderhalve tot twee centimeter lange naaldschacht van een 27-meter naald en polijsten beide uiteinden op schuurpapier tot dof. Gebruik een kleine hemostatische klem om de schacht te buigen in een haak aan de ene kant en een ringvormige aan de andere kant. Steek een 10 tot 15 centimeter lange MRE 25 katheter door de ring en bevestig met duidelijke chirurgische tape.Maak nog twee haken met dezelfde methode. De haken en katheter systeem moet 's nachts worden geweekt in zeventig procent ethanol voor sterilisatie. Alle procedures met betrekking tot dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Kentucky.We gebruiken ENT embryonale muizenhersenen om GFP te kweken, positieve neurale stamcellen. GFP positieve embryo's kunnen gemakkelijk worden gevisualiseerd in het FITC kanaal op een fluorescerende microscoop. Terwijl wild-type embryo's tonen geen fluorescentie met dezelfde blootstelling.De autofluorescentie van embryo's van het wildtype is alleen zichtbaar wanneer de blootstellingstijd 100 keer wordt verhoogd. Embryonale cortex wordt verzameld en gebruikt om neurale stamcelculturen vast te stellen volgens het protocol van de fabrikant. Deze neurale stamcellen kunnen vormen neurosferen en kan worden passage over 10 generaties en ze kunnen onderscheiden in glia zijn neuronen.Panel van embryonale stamcel markers zoals nanog, SSEA1, Oct4 en Sox3 kan worden gebruikt om de stamcel eigenschappen te identificeren, terwijl in neurosferen. Neurosferen werden gekweekt in de media, volgens het protocol van de fabrikant en het gebruik tussen passages drie en vijf voor neurale stamcellevering. Ischemische beroerte werd geïnduceerd in de linker hersenhelft voor zowel muizen als ratten, met behulp van een filament gebaseerd, middelste cerebrale slagader occlusie, MCAO met een aantal wijzigingen, afhankelijk van de soort.Bij muizen wordt de gloeidraad ingebracht via de gemeenschappelijke halsslagader, CCA en gevorderd in de interne halsslagader, ICA. Terwijl bij ratten, de gloeidraad wordt geïntroduceerd via de externe halsslagader, ERK in de ICA vanwege de grotere werkruimte. Hier tonen we de muizenoperatie.Na het maken van een middellijn incisie langs de nek, scheiden de onderliggende weefsels met behulp van stompe dissectie. Gebruik de drie microchirurgische haken gemaakt van naaldschachten met 27 meter om een beter gezichtsveld te bereiken. Het zwarte vierkant geeft het chirurgische gebied aan voor de volgende stap.De spierlaag boven de linker CCA is zorgvuldig open om de linker CCA en nervus vagus bloot te leggen. Volg de CCA tot je de splitsing bereikt en identificeer je. Voorzichtigheid moet worden geboden om deze CCA- of vaguszenuw niet uit te rekken, te verplaatsen of te knijpen.Open voorzichtig het heldere bindweefsel, dat de CCA- en nervus vagus bedekt. Maak de ruimte onder deze CCA vrij met een puntje van de tangen en isoleer de CCA-steel zo veel mogelijk. Rijg een dubbelstrengde zes O gevlochten nylon chirurgische hechting onder de CCA.Snijd het middelste punt te laten om hechtingen die ten grondslag liggen aan de CCA. Plaats nog een nylon hechting onder de CCA. Bind een slipknot op de bovenste hechting, houd het los.Scheid de twee onderste hechtingen. Bind een slip knoop met de middelste hechting, houden het los voor nu. Bind de knoop van een chirurg met een lagere hechting en verplaats deze zoveel mogelijk naar het proximale uiteinde.Knip de hechtingseinden af. Verder bloot de CCA buiten de splitsing. Duw de bovenste losse slipknot naar de splitsing en draai deze aan om terugstroom van bloed te voorkomen.Leg de siliconen rubber gecoate 70 nylon MCAO hechting naast de CCA. Snijd met behulp van een microschaar een kleine incisie op de CCA, naast de onderste knoop. Steek de punt van de MCAO hechting in de CCA door deze incisie en ga naar de bovenste knoop.Pas de positie van de middelste knoop aan en draai deze aan totdat deze de MCAO-hechting op zijn plaats kan houden. Draai de knoop niet te veel aan. Laat de bovenste knoop los, maar maak op dezelfde locatie nog een losse slipknoop.Advance de MCAO hechting in de ICA. Bevestig de MCAO hechting passeert de splitsing in de ICA. Het pad van de hechting moet relatief recht zijn, dieper in het weefsel terechtkomen naarmate het vordert.Controleer de zilveren markering op het hechtingseind. Zorg ervoor dat het de splitsing bereikt. Controleer de richting van de MCAO hechting nog eens.Pas de bovenste en middelste knopen aan om geen bloedlekkage te garanderen. Verdere vooruitgang de MCAO hechting, draai de twee bovenste knopen aan om de MCAO hechting op zijn plaats te beveiligen. Begin de opnametijd voor een uur ischemie.Na een uur ischemie verdoven we het dier en heropenen we de huidwond. Stel het operatiegebied bloot. Zoek bovenste en middelste slipknots.Laat voorzichtig de bovenste knoop los. Trek voorzichtig de MCAO hechting uit tot het witte siliconen rubberen deel de middelste knoop bereikt. Draai de bovenste knoop aan om de MCAO hechting op zijn plaats te houden om bloedingen te voorkomen.Laat de middelste slipknot voorzichtig los. Trek de MCAO hechting tot het einde passeert de bovenste knoop. Draai de bovenste knoop aan.Plaats de middelste slipknot recht boven de incisie op de CCA. Draai de middelste slipknot aan. Verwijder de bovenste knoop.Trim hechteinden van de middelste knoop. Sluit de huidwond en laat het dier herstellen. Gebaseerd op onze ervaring, neurale stamcellen veilig geïnjecteerd via deze arteriële route tussen een en drie dagen na een beroerte.Nogmaals, er zijn kleine variaties tussen muis en rat operaties voor neurale stamcelinjectie. En hier tonen we de muizenoperatie. Op dag drie na de beroerte verdooft u het dier, heropent u de wond en stelt u de CCA opnieuw bloot.Leg een dubbelstrengde chirurgische hechting onder de CCA en snijd het in het midden om twee hechtingen te krijgen. Plaats de twee hechtingen goed. Maak een slipknot met de bovenste hechting.Plaats het recht onder de splitsing. Draai de bovenste slipknot aan. Maak nog een slipknot met de middelste hechting.Snijd een kleine incisie recht boven de bijgesneden knoop resterende van de beroerte chirurgie. Snijd de punt van de MRE 10 katheter met een hoek van ongeveer 45 graden. Gebruik dit scherpe uiteinde om de incisie op de CCA in te voeren.Let erop dat de instaphoek en de kracht die wordt gebruikt om de katheter in te brengen, goed worden ingesteld. Anders mag de katheter de CCA niet binnenduken of doorboren. Steek de katheter in en ga door tot de punt de bovenste knoop bereikt.Draai de middelste slipknot aan om de katheter op zijn plaats te houden en zorg voor geen bloedkoppeling. Laat de bovenste knoop los. Maak een slip knoop met de bovenste hechting.Pas de hoek van de katheter in de CCA en de posities van beide knopen aan totdat een snelle terugstroom van bloed zichtbaar is, wat duidt op een succesvolle communicatie tussen de katheter en de CCA-stroom. Start de spuitpomp. Het bloed in de katheter wordt teruggespoeld in de CCA.Beëindig de injectie na vijf minuten. Ligate de bovenste knoop. Laat de middelste knoop los en trek de katheter terug.Ligate de middelste knoop. Knip alle knopen door. Sluit de wond en laat het dier herstellen.Na intra-arteriële injectie, GFP gelabeld neurale stamcellen zijn meestal te vinden in de ipsilaterale hemisfeer. Hier tonen we de verdeling in de hippocampal dentate gyrus op een dag na injectie. In het ipsilaterale halfrond, sommige van de GFP positieve neurale stamcellen gelokaliseerd in de cortex en striatum, express dubbele cort, een marker van onrijpe neuronen.Dit zijn representatieve beelden van schijn- en beroertedieren met of zonder neurale stamcelinjectie op zeven dagen na injectie. Na 30 dagen na de levering kan alleen kleine automatische fluorescentie worden gedetecteerd via het FITC-kanaal bij de dieren die een voertuiginjectie ontvangen. Terwijl in stamcellen geïnjecteerd dieren, GFP gelabeld neurale stamcellen kan worden gevonden in de gewonde hersenen met expressie van verschillende cel markers zoals de gleo marker GFP of de neuronale marker tujuan.De witte pijlen in elke afbeelding geven neurale stamcellen aan die respectievelijk GFP- of tujuanmarkeringen uitdrukken. Tot slot, intra-arteriële injectie is een haalbare methode voor de levering van neurale stamcellen voor beroerte therapie. Neurale stamcellen kunnen overleven en differentiëren in verschillende celtypen binnen de gewonde hersenen.En tenslotte kan de hier geïntroduceerde intra-arteriële injectiemethode ook worden gebruikt voor de levering van oplossingen en suspensies.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Focus cerebrale ischemie Model door Endovasculaire Suture Occlusie van de midden cerebrale slagader in de Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Gene Levering aan Postnatale Rat Brain door niet-ventriculaire Plasmide-injectie en elektroporatie

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolatie en uitbreiding van de volwassen muis neurale stamcellen Met behulp van de Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Detectie van Microregional Hypoxie in Mouse Cerebral Cortex door twee-foton Imaging van endogene NADH fluorescentie

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio&#39;s van de Adult knaagdierhersenen

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Het beoordelen van de celcyclus van neurale stamcellen en stamcellen in de Mouse ontwikkeling van de hersenen na genotoxische stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolatie en cultuur van de volwassen neurale stamcellen van de muis Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Ontwikkeling van een verfijnde Protocol voor Trans-scleral Subretinal transplantatie van menselijke retinale Pigment epitheliale cellen in de ogen van de Rat

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Gelijktijdige Evaluatie van Cerebrale hemodynamiek en Light Scattering Eigenschappen van de<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Brain behulp Multispectral Diffuse reflectie Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...