Name: intra-arterial delivery of neural stem cells to the rat and mouse brain: application to cerebral ischemia
Uploaded: 2020-06-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia at JoVE.com

Diese Forschung wurde unterstützt von den folgenden: AHA Award 14SDG20480186 für LC, Subject Innovation Team der Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 für BZ, und Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust Grant 14-12A für KES und LC.

Alle Verfahren zu tierischen Themen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Kentucky genehmigt, und es wurde entsprechend darauf geachtet, Stress oder Schmerzen im Zusammenhang mit einer Operation zu minimieren.
1. Herstellung von Injektionskatheter und chirurgischen Haken
<ol><li>Konstruieren Sie den Injektionskatheter (Abbildung 1). Sammeln Sie notwendige Materialien wie: MRE010, MRE025 und MRE050 Rohre, 20 G, 26 G und ...

<ol>
	<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+research+in+2017:+surgical+progress+and+stem-cell+advances.">Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances.</a> The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).</li><li>Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transplantation+therapy+for+stroke.">Cell transplantation therapy for stroke.</a> Stroke. 38, 817-826 (2007).</li><li>Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+therapy+for+subacute+and+chronic+ischemic+stroke.">Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9, 154 (2018).</li><li>Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+Brain+Cells+for+Stroke+Patients+Using+Pluripotent+Stem+Cells.">Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells.</a> Stroke. 49, 1091-1098 (2018).</li><li>Savitz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Stem+Cells+the+Next+Generation+of+Stroke+Therapeutics.">Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics.</a> Stroke. 49, 1056-1057 (2018).</li><li>Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Therapy+for+Chronic+Stroke.">Cell Therapy for Chronic Stroke.</a> Stroke. 49, 1066-1074 (2018).</li><li>Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+design+for+stem+cell+therapies+in+stroke:+What+have+we+learned.">Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned.</a> Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).</li><li>Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-Arterial+Delivery+of+Cell+Therapies+for+Stroke.">Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke.</a> Stroke. 49, 1075-1082 (2018).</li><li>Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-arterial+delivery+of+cell+therapies+for+stroke.">Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke.</a> Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).</li><li>Argibay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraarterial+route+increases+the+risk+of+cerebral+lesions+after+mesenchymal+cell+administration+in+animal+model+of+ischemia.">Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia.</a> Scientific Reports. 7, 40758 (2017).</li><li>Kelly, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+human+fetal+neural+stem+cells+survive,+migrate,+and+differentiate+in+ischemic+rat+cerebral+cortex.">Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).</li><li>Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+microport+technique+for+applications+in+cerebrovascular+research.">Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research.</a> Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).</li><li>Fischer, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+passage+is+a+major+obstacle+for+intravenous+stem+cell+delivery:+the+pulmonary+first-pass+effect.">Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect.</a> Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).</li><li>Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+in+ischemic+stroke:+role+of+IV+and+intra-arterial+therapy.">Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy.</a> Neurology. 79, 207-212 (2012).</li><li>Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+delivery+of+stem+cells.">Intracranial delivery of stem cells.</a> Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).</li><li>Boltze, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dark+Side+of+the+Force+-+Constraints+and+Complications+of+Cell+Therapies+for+Stroke.">The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke.</a> Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+noncontact+speckle+contrast+diffuse+correlation+tomography+of+cerebral+blood+flow+in+rats.">Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats.</a> Neuroimage. 198, 160-169 (2019).</li><li>Wong, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+Cerebral+Ischemic+Injury+in+Smad1+Deficient+Mice.">Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice.</a> PLoS One. 10, 0136967 (2015).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+telomerase+activity+aggravates+the+blood-brain+barrier+disruption+and+neuroinflammatory+responses+in+a+model+of+experimental+stroke.">Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke.</a> Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).</li><li>Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+doublecortin-expressing+population+in+the+developing+and+adult+brain+contains+multipotential+precursors+in+addition+to+neuronal-lineage+cells.">The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells.</a> The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3, 20130001 (2013).</li><li>Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Ischemic+Stroke+and+Ischemia-reperfusion+in+Mice+Using+the+Middle+Artery+Occlusion+Technique+and+Visualization+of+Infarct+Area.">Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Microsurgery+Infusion+Technique+for+Targeted+Substance+Delivery+into+the+CNS+via+the+Internal+Carotid+Artery.">Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chua, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-arterial+injection+of+neural+stem+cells+using+a+microneedle+technique+does+not+cause+microembolic+strokes.">Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).</li><li>Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Devices+for+cell+transplantation+into+the+central+nervous+system:+Design+considerations+and+emerging+technologies.">Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies.</a> Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).</li><li>Duma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intracerebroventricular+(ICV)+injection+of+autologous,+non-engineered,+adipose-derived+stromal+vascular+fraction+(ADSVF)+for+neurodegenerative+disorders:+results+of+a+3-year+phase+1+study+of+113+injections+in+31+patients.">Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients.</a> Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).</li></ol>

Die Stammzelltherapie bei neurologischen Erkrankungen befindet sich noch in einem frühen explorativen Stadium. Ein großes Problem ist, dass es keine etablierte Methode für eine ausreichende Bereitstellung von SCs oder NSCs in das Gehirn gibt.
Obwohl exogene SCs/NSCs im Gehirn nach intravenöser (IV), intraperitonealer (IP) oder intraparenchymaler/intracerebraler Injektion nachgewiesen werden können, hat jeder Verabreichungsansatz Nachteile. Die nachweisbare Population im Gehirn wird mit ei...

Die Stammzelltherapie (SC) birgt ein enormes Potenzial zur Behandlung neurologischer Erkrankungen wie Schlaganfall, Kopftrauma und Demenz1,2,3,4,5,6., Eine effiziente Methode zur Lieferung exogener SCs an das erkrankte Gehirn bleibt jedoch problematisch2,6,7,8,9,10,11,12,13. SCs, die über periphere Verabreichungswege, einschließlich intravenöser (IV) oder intraperitonealer (IP) Injektionen, geliefert werden, unterliegen einer Erstpassfilterung in der Mikrozirkulation, insbesondere in der Lunge, Leber, Milz und Muskel8,9,13,14, erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Ansammlung von Zellen in Nicht-Ziel-Bereichen. Die invasive intracerebrale Injektionsmethode führt zu lokalisierten Hirngewebeschäden und einer sehr eingeschränkten Verteilung von SCs in der Nähe der Injektionsstelle2,6,8,14,15,16. Wir haben vor kurzem eine katheterbasierte intraarterielle Injektionsmethode eingeführt, um exogene neuronale SCs (NSCs) zu liefern, die hier in einem Nagetiermodell des fokalen ischämischen Schlaganfalls beschrieben wird. Wir induzieren vorübergehende (1 h) Ischämie-Reperfusionsverletzung in einer Hemisphäre mit einem Silikongummi beschichteten Filament, um die linke mittlere Hirnarterie (MCA) in der Maus oder Ratte17,18,19zu verschließen. In diesem Modell haben wir reproduzierbar etwa 75-85% Depression des zerebralen Blutflusses (CBF) in der ipsilateralen Hemisphäre mit Laser Doppler oder Laser speckle Imaging17,19beobachtet, was konsistente neurologische Defizite17,18,19ergibt.
Aus zeitsparenden Gründen wird das Video mit doppelter Normalgeschwindigkeit abgespielt und routinemäßige chirurgische Eingriffe wie Hautvorbereitung und Wundverschluss mit Naht und die Verwendung und Einrichtung der motorisierten Spritzenpumpe werden nicht dargestellt. Die Methode der intraarteriellen Abgabe von NSCs wird im Kontext des mittleren zerebralen Arterienverschlussmodells (MCAO) des experimentellen Schlaganfalls bei Nagetieren demonstriert. Daher schließen wir das transiente ischämische Schlaganfallverfahren ein, um später zu zeigen, wie die zweite Operation, die intraarterielle Injektion, mit der vorherigen chirurgischen Stelle am selben Tier durchgeführt wird. Die Durchführbarkeit der intraarteriellen NSC-Verabreichung in Nagetierschlagmodellen wird durch die Bewertung der Verteilung und des Überlebens exogener NSCs demonstriert. Die Wirksamkeit der NSC-Therapie zur Dämpfung der Hirnpathologie und neurologischen Dysfunktion wird separat berichtet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305175</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305111</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305136</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 NFS-2 suture with needle</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>56905</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 nylon suture</td>
			<td>Teleflex/Braintree Scientific</td>
			<td>104-s</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7922</td>
			<td>cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blade</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>10</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine-SR Lab</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>Buprenorphine-SR Lab&#174;</td>
			<td>analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium/magnisum free PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-0500</td>
			<td>NSC dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>180063</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>50562-1</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCAO filament for mouse</td>
			<td>Doccol</td>
			<td>702223PK5Re</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCAO filament for rat</td>
			<td>Doccol</td>
			<td>503334PK5Re</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE010 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE010</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE025 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE025</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE050 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE050</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu-Tears Ointment</td>
			<td>NuLife Pharmaceuticals</td>
			<td>Nu-Tears Ointment</td>
			<td>eye care during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00649-11</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00632-11</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Pacer Technology</td>
			<td>15187</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>GenieTouch</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAb1637</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-component 5 minute epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>20445</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vascular clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00400-03</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-arterial delivery of neural stem cells to the rat and mouse brain: application to cerebral ischemia

Die Therapie mit neuronalen Stammzellen (NSC) ist eine neue innovative Behandlung bei Schlaganfall, traumatischen Hirnverletzungen und neurodegenerativen Erkrankungen. Im Vergleich zur intrakraniellen Verabreichung ist die intraarterielle Verabreichung von NSCs weniger invasiv und erzeugt eine diffusere Verteilung von NSCs innerhalb des Gehirnparenchyms. Darüber hinaus ermöglicht die intraarterielle Abgabe den Erstpasseffekt in der Hirnzirkulation, wodurch das Potenzial für das Einfangen von Zellen in peripheren Organen, wie Leber und Milz, verringert wird, eine Komplikation, die mit peripheren Injektionen verbunden ist. Hier beschreiben wir die Methodik, sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten, für die Lieferung von NSCs durch die gemeinsame Halsschlagader (Maus) oder externe Halsschlagader (Ratte) an die ipsilaterale Hemisphäre nach einem ischämischen Schlaganfall. Anhand von GFP-markierten NSCs veranschaulichen wir die weitverbreitete Verteilung, die in der ipsilateralen Hemisphäre des Nagetiers bei 1 d, 1 Woche und 4 Wochen nach der postischen Verabreichung erreicht wird, mit einer höheren Dichte an oder in der Nähe der ischämischen Verletzungsstelle. Neben dem Langzeitüberleben zeigen wir Nachweise für eine Differenzierung von GFP-markierten Zellen nach 4 Wochen. Der hier für NSCs beschriebene intraarterielle Verabreichungsansatz kann auch für die Verabreichung therapeutischer Verbindungen verwendet werden und hat somit eine breite Anwendbarkeit auf verschiedene ZNS-Verletzungs- und Krankheitsmodelle über mehrere Arten hinweg.

GFP-markierte NSCs wurden im ischämischen Gehirn leicht nachgewiesen, vor allem in der ipsilateralen Hemisphäre, insbesondere im Penumbra und entlang des Verletzungsrands (Abbildung 6). Der Prüfer wurde während der Bildgebung und Analyse einmalig blind.
Zum Beispiel wurden bei 1 d nach der Injektion NSCs innerhalb des Maus-Hippocampus nachgewiesen. Eine Teilmenge von NSCs zeigte die Koexpression des unreifen Neuronenmarkers DCX im Dentate-Gyrus bereits zu dies...

Watch this Scientific Journal Video about Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia at JoVE.com

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Eine Methode zur Abgabe neuronaler Stammzellen, anpassungsfähig für Injektionslösungen oder Suspensionen, durch die gemeinsame Halsschlagader (Maus) oder externe Halsschlagader (Ratte) nach ischämischem Schlaganfall wird berichtet. Injizierte Zellen sind breit über das Gehirn Parenchym verteilt und kann bis zu 30 d nach der Geburt nachgewiesen werden.

Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Schlaganfall ist weltweit die Hauptursache für Sterblichkeit und Behinderung. Obwohl Thrombolyse und chirurgische Entfernung von zerebralen Gefäßverschlüssen bei ausgewählten Patienten durchgeführt werden können, besteht nach wie vor ein dringender Bedarf an wirksamen Therapien gegen Schlaganfall. Hier zeigen wir eine katheterbasierte, intraarterielle Versorgung der ischämischen Hemisphäre als potenzielles Therapieschema für die Schlaganfalltherapie.Zuerst stellen wir vor, wie man den Injektionskatheter und chirurgische Haken vorbereitet. Wir haben zwei Arten von Injektionskathetern für die intraarterielle Injektion entwickelt. Design eins wird für die Injektion einer Lösung oder Suspension verwendet, die keine Spülung des Rohres erfordert.Design zwei ermöglicht die Injektion von neuronalen Stammzellen, gefolgt von einer Spülung des toten Volumens, um das volle Volumen zu liefern. Um einen Satz Von Injektionskathetern zu bauen, benötigen Sie 26 Gauge- und 20-Meter-Nadeln, eine Länge von 10 bis 15 Zentimetern MRE 25 Katheter und drei Zentimeter Länge von MRE 50 und MRE 10 Katheter. Schneiden Sie beide Nadelspitzen ab und polieren Sie das Metallende auf Schleifpapier, um das Rohr wieder zu öffnen und die Kanten zu glätten und dann mit destilliertem Wasser zu spülen, um die Bohrung zu reinigen und Schmutz abzuwaschen.Die Abbildung zeigt ein geschlossenes Ende einer 20-Meter-Nadel nach dem Abschneiden der Nadelspitze, die nach dem Polieren mit einer glatten Bohrung wieder geöffnet wird. Setzen Sie unter dem Mikroskop die 20-Spur-Nadel in das Ende der MRE 50-Schläuche ein. Biegen Sie die 26-Spur-Nadel und durchdringen Sie dann die Schläuche unter dem Ende der 20-Meter-Nadelspitze.Sichern Sie die 26-Spur-Nadel mit Superkleber. Dann betten Sie die beiden Nadelnaben und die Schläuche und Epoxid, um einen festen Block zu bauen, um die Festigkeit zu erhöhen. Sie benötigen auch drei chirurgische Haken, um das Gewebe in Position zu halten, um die chirurgischen Stellen besser zu belichten.Eine eineinhalb bis zwei Zentimeter lange Nadelwelle von einer 27-Spur-Nadel schneiden und beide Enden auf Schleifpapier polieren, bis sie stumpf sind. Verwenden Sie eine kleine hämostatische Klemme, um die Welle in einen Haken an einem Ende und eine ringförmige am anderen Ende zu biegen. Legen Sie einen 10 bis 15 Zentimeter langen MRE 25 Katheter durch den Ring und sichern Sie ihn mit klarem Operationsband.Erstellen Sie zwei weitere Hooks mit der gleichen Methode. Die Haken und das Kathetersystem sollten über Nacht in 70 Prozent Ethanol zur Sterilisation eingeweicht werden. Alle Verfahren, die tiertierische Themen betreffen, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Kentucky genehmigt.Wir verwenden HNO embryonale Maus Gehirn, um GFP zu kulturieren, positive neuronale Stammzellen. GFP-positive Embryonen können im FITC-Kanal leicht auf einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert werden. Während Wildtyp-Embryonen zeigen keine Fluoreszenz mit der gleichen Exposition.Die Autofluoreszenz von Wildenembryonen ist nur sichtbar, wenn die Belichtungszeit um das 100-fache erhöht wird. Embryonale Kortex wird gesammelt und verwendet, um neuronale Stammzellkulturen nach dem Herstellerprotokoll zu etablieren. Diese neuronalen Stammzellen können Neurosphären bilden und können über 10 Generationen durchgehen und sie können sich in Glia unterscheiden sind Neuronen.Panel von embryonalen Stammzellmarkern wie Nanog, SSEA1, Oct4 und Sox3 kann verwendet werden, um die Stammzelleigenschaften in Neurosphären zu identifizieren. Neurosphären wurden in den Medien kultiviert, nach dem Herstellerprotokoll und verwendung zwischen den Passagen drei und fünf für die Neuronalstammzellabgabe. Der ischämische Schlaganfall wurde in der linken Hemisphäre sowohl für Mäuse als auch für Ratten induziert, wobei eine filamentbasierte, mittlere Zerebrale Arterienverschluss, MCAO mit einigen Modifikationen je nach Art verwendet wurde.Bei Mäusen wird das Filament durch die gemeinsame Halsschlagader, CCA, eingeführt und in die innere Halsschlagader ICA vorgeschoben. Bei Ratten wird das Filament durch die äußere Halsschlagader ECA in die ICA eingeführt, da der größere Arbeitsbereich größer ist. Hier zeigen wir die Mauschirurgie.Nach einem Mittellinienschnitt entlang des Halses, trennen Sie die darunter liegenden Gewebe mit stumpfer Sezierung. Verwenden Sie die drei mikrochirurgischen Haken aus 27-Spur-Nadelwellen, um ein besseres Gesichtsfeld zu erreichen. Das schwarze Quadrat zeigt den Operationsbereich für den nächsten Schritt an.Die Muskelschicht über dem linken CCA ist sorgfältig geöffnet, um den linken CCA und vagus Nerv zu belichten. Folgen Sie dem CCA, bis Sie die Bifurkation erreichen und identifizieren. Vorsicht sollte geboten werden, um diesen CCA- oder Vagusnerv nicht zu dehnen, zu verdrängen oder zu drücken.Öffnen Sie vorsichtig das klare Bindegewebe und decken Sie den CCA- und Vagusnerv ab. Befreien Sie den Raum unter diesem CCA mit einer Spitze der Zange und isolieren Sie den CCA-Stamm so weit wie möglich. Fädeln Sie eine doppelsträngige sechs O geflochtene Nylon chirurgische Naht unter dem CCA.Schneiden Sie den Mittelpunkt, um die Nähte zu verlassen, die dem CCA zugrunde liegen. Legen Sie eine weitere Nylon-Nähte unter die CCA. Binden Sie einen Slipknot auf die obere Naht, halten Sie es locker.Trennen Sie die beiden unteren Nähte. Binden Sie einen Schlupfknoten mit der mittleren Naht, halten Sie es für den Moment locker. Binden Sie den Knoten eines Chirurgen mit einer niedrigeren Naht und bewegen Sie ihn so weit wie möglich an das proximale Ende.Trimmen Sie die Nähtenachlten nach unten. Setzen Sie die CCA über die Bifurkation hinaus weiter aus. Drücken Sie den oberen lockeren Slipknot auf die Bifurkation und ziehen Sie ihn fest, um einen Blutrückfluss zu verhindern.Legen Sie die silikongummibeschichtete 70 Nylon MCAO Naht neben die CCA. Schneiden Sie mit einer Mikroschere einen kleinen Schnitt auf dem CCA neben dem unteren Knoten. Setzen Sie die Spitze der MCAO-Nähte durch diesen Schnitt in die CCA ein und bringen Sie sie auf den oberen Knoten vor.Passen Sie die Position des mittleren Knotens an und ziehen Sie ihn fest, bis er die MCAO-Naht in Position halten kann. Den Knoten nicht übermäßig festigen. Lösen Sie den oberen Knoten, aber machen Sie einen weiteren lockeren Schlupfknoten an der gleichen Stelle.Fördern Sie die MCAO-Nähte in die ICA. Bestätigen Sie, dass die MCAO-Naht die Bifurkation in die ICA übergibt. Der Pfad der Naht sollte relativ gerade sein und tiefer in das Gewebe eindringen, während es voranschreitet.Überprüfen Sie den silbern Marker am Nahtende. Stellen Sie sicher, dass es die Bifurkation erreicht. Überprüfen Sie die Richtung der MCAO-Nähte erneut.Passen Sie die oberen und mittleren Knoten an, um keine Blutleckszugung zu gewährleisten. Weitere Fortschritte der MCAO Naht, ziehen Sie die beiden oberen Knoten, um die MCAO Naht an Ort und Stelle zu sichern. Beginnen Sie die Aufnahmezeit für eine Stunde Ischämie.Nach einer Stunde Ischämie befeuchten wir das Tier und öffnen die Hautwunde wieder. Setzen Sie den operationschirurgischen Bereich aus. Suchen Sie obere und mittlere Slipknots.Lösen Sie den oberen Knoten vorsichtig. Ziehen Sie die MCAO-Nähte vorsichtig heraus, bis das weiße Silikonkautschukteil den mittleren Knoten erreicht. Ziehen Sie den oberen Knoten fest, um die MCAO-Naht an Ort und Stelle zu halten, um Blutungen zu vermeiden.Lassen Sie den mittleren Slipknot vorsichtig los. Ziehen Sie die MCAO-Nähte heraus, bis ihr Ende den oberen Knoten passiert. Ziehen Sie den oberen Knoten fest.Platzieren Sie den mittleren Slipknot direkt über dem Schnitt auf dem CCA. Ziehen Sie den mittleren Slipknot an. Entfernen Sie den oberen Knoten.Trim Nahtenen des mittleren Knotens. Schließen Sie die Hautwunde und lassen Sie das Tier sich erholen. Basierend auf unserer Erfahrung, neuronale Stammzellen sicher durch diese arterielle Route zwischen einem und drei Tagen nach dem Schlaganfall injiziert.Auch hier gibt es geringfügige Unterschiede zwischen Maus- und Rattenoperationen für die neuronale Stammzellinjektion. Und hier zeigen wir die Mauschirurgie. Am dritten Tag nach dem Schlaganfall, beantieren Sie das Tier, öffnen Sie die Wunde wieder und setzen Sie die CCA wieder frei.Legen Sie eine doppelsträngige chirurgische Naht unter die CCA und schneiden Sie sie in der Mitte, um zwei Nähte zu erhalten. Legen Sie die beiden Nähte richtig. Machen Sie einen Slipknot mit der oberen Naht.Platzieren Sie es direkt unter der Bifurkation. Ziehen Sie den oberen Slipknot fest. Machen Sie einen weiteren Slipknot mit der mittleren Naht.Schneiden Sie einen kleinen Schnitt direkt über dem gestutzten Knoten, der von der Schlaganfalloperation übrig geblieben ist. Schneiden Sie die Spitze des MRE 10 Katheters mit einem Winkel von ca. 45 Grad. Verwenden Sie dieses scharfe Ende, um den Schnitt auf dem CCA einzugeben.Achten Sie darauf, den Einstiegswinkel und die Kraft, die zum Einsetzen des Katheters verwendet wird, richtig einzustellen. Andernfalls kann der Katheter nicht in das CCA gelangen oder es durchstechen. Legen Sie den Katheter ein und rücken Sie vor, bis die Spitze den oberen Knoten erreicht.Ziehen Sie den mittleren Slipknot fest, um den Katheter an Ort und Stelle zu halten und keine Blutverbindung zu gewährleisten. Lösen Sie den oberen Knoten. Machen Sie einen Schlupfknoten mit der oberen Naht.Passen Sie den Winkel des Katheters innerhalb des CCA und die Positionen beider Knoten an, bis ein schneller Blutrückfluss sichtbar ist, was auf eine erfolgreiche Kommunikation zwischen Katheter und CCA-Fluss hindeutet. Starten Sie die Spritzenpumpe. Das Blut im Katheter wird zurück in den CCA gespült.Beenden Sie die Injektion nach fünf Minuten. Ligate den oberen Knoten. Lösen Sie den mittleren Knoten und ziehen Sie den Katheter zurück.Ligate den mittleren Knoten. Trimmen Sie alle Knoten. Schließen Sie die Wunde und lassen Sie das Tier sich erholen.Nach intraarterieller Injektion sind GFP-markierte neuronale Stammzellen meist in der ipsilateralen Hemisphäre zu finden. Hier zeigen wir die Verteilung im Hippocampus Dentate Gyrus an einem Tag nach der Injektion. In der ipsilateralen Hemisphäre, einige der GFP positive neuronale Stammzellen in der Kortex und Striatum lokalisiert, Exprimat Doppelkort, ein Marker von unreifen Neuronen.Dies sind repräsentative Bilder von Schein- und Schlaganfalltieren mit oder ohne neuronale Stammzellinjektion nach sieben Tagen nach der Injektion. 30 Tage nach der Entbindung kann nur eine geringfügige Autofluoreszenz über den FITC-Kanal bei den Tieren, die eine Fahrzeuginjektion erhalten, nachgewiesen werden. Während in Stammzellen injizierte Tiere, GFP-markierte neuronale Stammzellen können im verletzten Gehirn mit Derexpression von verschiedenen Zellmarkern wie dem Gleo-Marker GFP oder dem neuronalen Marker Tujuan gefunden werden.Die weißen Pfeile in jedem Bild zeigen neuronale Stammzellen an, die GFP- bzw. Tujuan-Marker exzieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die intraarterielle Injektion eine praktikable Methode zur Abgabe von neuronalen Stammzellen zur Schlaganfalltherapie ist. Neuronale Stammzellen können überleben und sich in verschiedene Zelltypen innerhalb des verletzten Gehirns differenzieren.Und schließlich kann die hier eingeführte intraarterielle Injektionsmethode auch für die Lieferung von Lösungen und Suspensionen eingesetzt werden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

Fokaler zerebraler Ischämie-Modell von Endovascular Suture Verschluss der mittleren Hirnarterie im Rat

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Forschung

Neurowissenschaften

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Gene Lieferung in Postnatale Rattengehirn von Non-ventrikuläre Plasmid Injektion und Elektroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Wachsende neuronale Stammzellen aus konventionellen und Nonconventional Regionen der Volks Nagetier Gehirn

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Beurteilung der Zellzyklus-Progression of Neural Stem-und Vorläuferzellen im sich entwickelnden Gehirn Maus nach genotoxischen Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Entwicklung eines raffinierten Protokolls für Trans-skleralen subretinalen Transplantation von menschlichen retinalen Pigment Epithelzellen in Ratte Augen

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Die gleichzeitige Auswertung der zerebralen Hämodynamik und Lichtstreuungseigenschaften der<em&gt; In Vivo</em&gt; Rattenhirn Mit Multispektral Diffuse Reflectance Imaging

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...