Name: intra-arterial delivery of neural stem cells to the rat and mouse brain: application to cerebral ischemia
Uploaded: 2020-06-26T13:30:00
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この研究は、LCのAHA賞14SDG20480186、中国医学大学2019-QN07のBZの主題イノベーションチーム、KESとLCのためのケンタッキー脊髄および頭部外傷研究信託助成金14-12Aによって支えられた。

動物の被験者に関するすべての手順は、ケンタッキー大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認され、手術に伴うストレスや痛みを最小限に抑えるために適切な注意を払った。
1. 注射カテーテルと手術用フックの調製
<ol><li>射出カテーテルを構築する(図1)。MRE010、MRE025、MRE050チューブ、20G、26Gおよび27G注射針(図2A)、600F...

<ol>
	<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+research+in+2017:+surgical+progress+and+stem-cell+advances.">Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances.</a> The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).</li><li>Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+transplantation+therapy+for+stroke.">Cell transplantation therapy for stroke.</a> Stroke. 38, 817-826 (2007).</li><li>Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+therapy+for+subacute+and+chronic+ischemic+stroke.">Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 9, 154 (2018).</li><li>Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Customized+Brain+Cells+for+Stroke+Patients+Using+Pluripotent+Stem+Cells.">Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells.</a> Stroke. 49, 1091-1098 (2018).</li><li>Savitz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+Stem+Cells+the+Next+Generation+of+Stroke+Therapeutics.">Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics.</a> Stroke. 49, 1056-1057 (2018).</li><li>Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Therapy+for+Chronic+Stroke.">Cell Therapy for Chronic Stroke.</a> Stroke. 49, 1066-1074 (2018).</li><li>Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+design+for+stem+cell+therapies+in+stroke:+What+have+we+learned.">Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned.</a> Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).</li><li>Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-Arterial+Delivery+of+Cell+Therapies+for+Stroke.">Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke.</a> Stroke. 49, 1075-1082 (2018).</li><li>Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-arterial+delivery+of+cell+therapies+for+stroke.">Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke.</a> Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).</li><li>Argibay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraarterial+route+increases+the+risk+of+cerebral+lesions+after+mesenchymal+cell+administration+in+animal+model+of+ischemia.">Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia.</a> Scientific Reports. 7, 40758 (2017).</li><li>Kelly, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+human+fetal+neural+stem+cells+survive,+migrate,+and+differentiate+in+ischemic+rat+cerebral+cortex.">Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).</li><li>Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+microport+technique+for+applications+in+cerebrovascular+research.">Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research.</a> Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).</li><li>Fischer, U. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+passage+is+a+major+obstacle+for+intravenous+stem+cell+delivery:+the+pulmonary+first-pass+effect.">Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect.</a> Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).</li><li>Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+in+ischemic+stroke:+role+of+IV+and+intra-arterial+therapy.">Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy.</a> Neurology. 79, 207-212 (2012).</li><li>Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+delivery+of+stem+cells.">Intracranial delivery of stem cells.</a> Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).</li><li>Boltze, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dark+Side+of+the+Force+-+Constraints+and+Complications+of+Cell+Therapies+for+Stroke.">The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke.</a> Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).</li><li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+noncontact+speckle+contrast+diffuse+correlation+tomography+of+cerebral+blood+flow+in+rats.">Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats.</a> Neuroimage. 198, 160-169 (2019).</li><li>Wong, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+Cerebral+Ischemic+Injury+in+Smad1+Deficient+Mice.">Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice.</a> PLoS One. 10, 0136967 (2015).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+telomerase+activity+aggravates+the+blood-brain+barrier+disruption+and+neuroinflammatory+responses+in+a+model+of+experimental+stroke.">Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke.</a> Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).</li><li>Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+doublecortin-expressing+population+in+the+developing+and+adult+brain+contains+multipotential+precursors+in+addition+to+neuronal-lineage+cells.">The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells.</a> The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+seeing+to+believing:+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments.">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3, 20130001 (2013).</li><li>Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Ischemic+Stroke+and+Ischemia-reperfusion+in+Mice+Using+the+Middle+Artery+Occlusion+Technique+and+Visualization+of+Infarct+Area.">Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Microsurgery+Infusion+Technique+for+Targeted+Substance+Delivery+into+the+CNS+via+the+Internal+Carotid+Artery.">Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li><li>Chua, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-arterial+injection+of+neural+stem+cells+using+a+microneedle+technique+does+not+cause+microembolic+strokes.">Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).</li><li>Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Devices+for+cell+transplantation+into+the+central+nervous+system:+Design+considerations+and+emerging+technologies.">Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies.</a> Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).</li><li>Duma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intracerebroventricular+(ICV)+injection+of+autologous,+non-engineered,+adipose-derived+stromal+vascular+fraction+(ADSVF)+for+neurodegenerative+disorders:+results+of+a+3-year+phase+1+study+of+113+injections+in+31+patients.">Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients.</a> Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).</li></ol>

神経疾患の幹細胞療法はまだ初期の探索段階にあります。1つの大きな問題は、脳内にSCまたはNSCを十分に送達するための確立された方法が存在しないです。
外因性SC/NSCは、静脈内(IV)、腹腔内(IP)または脳内注射に続く脳内で検出することができるが、各送達アプローチには欠点がある。脳内の検出可能な集団は、末梢注射(IVまたはIP)で非常に低いと推定され、注入または...

幹細胞(SC),療法は、脳卒中、頭部外傷および認知症,,11、2、3、4、5、62を含む神経疾患の治療として大きな可能性5を6秘めている。34しかし、病気の脳に外因性のSCを送達する効率的な方法は、問題が残る262、6、7、8、9、10、11、12、13。11,12,139,10,,7,8,,静脈内(IV)または腹腔内(IP)注射を含む末梢送達経路を介して送達されるSCは、特に肺、肝臓、脾臓および筋肉88、9、13、149,13,における微小循環におけるファーストパスフィルタリングの対象となり、非標的領域における細胞の蓄積の可能性が高まる。14侵襲的な脳内注射法は、局所的な脳組織損傷および注射,,,部位2、6、8、14、15、166,8付近のSCの非常に制限された分布をもたらす。2141516我々は最近、外因性神経SC(NSC)を送達するためのカテーテルベースの動脈内注入法を確立した。我々は、マウスまたはラット17、18、19,において左中大脳動脈(MCA)を閉塞するためにシリコーンゴム被覆フィラメントを用いて1つの半球で一過性(1時間)虚血再灌流傷害を19誘発する。このモデルでは、レーザードップラーまたはレーザー斑点イメージング17、19,19を用いた半球の脳血流(CBF)の約75-85%のうつ病を再現的に観察し、一貫した神経障害17、18、1918,19を生み出した。17
時間節約のために、ビデオは通常の速度の2倍で再生するように設定されており、縫合糸による皮膚の準備や創傷閉鎖などの日常的な外科的処置と、電動シリンジポンプの使用とセットアップは提示されません。NSCの動脈内送達法は、げっ歯類における実験脳卒中の中大脳動脈閉塞(MCAO)モデルの文脈で実証される。したがって、後で第2の手術、動脈内注射を、同じ動物上の前の外科部位を用いて行われる方法を実証するために、一過性の虚血性脳卒中手順を含む。げっ歯類の脳卒中モデルにおける動脈内NSC送達の実現可能性は、外因性NSCの分布および生存を評価することによって実証される。脳病理と神経機能障害を弱めるNSC療法の有効性は別々に報告される。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305175</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305111</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G needle</td>
			<td>Becton &#38; Dickinson</td>
			<td>BD PrecisionGlide 305136</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 NFS-2 suture with needle</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>56905</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 nylon suture</td>
			<td>Teleflex/Braintree Scientific</td>
			<td>104-s</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7922</td>
			<td>cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blade</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>10</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine-SR Lab</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>Buprenorphine-SR Lab&#174;</td>
			<td>analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium/magnisum free PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-0500</td>
			<td>NSC dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCX antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>180063</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>50562-1</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCAO filament for mouse</td>
			<td>Doccol</td>
			<td>702223PK5Re</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCAO filament for rat</td>
			<td>Doccol</td>
			<td>503334PK5Re</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE010 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE010</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE025 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE025</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRE050 catheter</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE050</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nu-Tears Ointment</td>
			<td>NuLife Pharmaceuticals</td>
			<td>Nu-Tears Ointment</td>
			<td>eye care during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00649-11</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00632-11</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Pacer Technology</td>
			<td>15187</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>GenieTouch</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuj1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAb1637</td>
			<td>immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>two-component 5 minute epoxy</td>
			<td>Devcon</td>
			<td>20445</td>
			<td>preparation of injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vascular clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00400-03</td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intra-arterial delivery of neural stem cells to the rat and mouse brain: application to cerebral ischemia

神経幹細胞(NSC)療法は、脳卒中、外傷性脳損傷および神経変性疾患のための新たな革新的な治療法である。頭蓋内分娩と比較して、NSCの動脈内投与は侵襲性が低く、脳の中でNSCのより拡散分布を生じる。また、動脈内送達は、脳循環における初回通過効果を可能にし、肝臓および脾臓などの末梢器官における細胞の捕捉の可能性を減少させ、末梢注射に伴う合併症である。ここでは、マウスとラットの両方において、虚血性脳卒中後の一般的な頸動脈(マウス)または外頸動脈(ラット)を介してNSCをイプシラテラ半球に送達するための方法論を詳述する。GFP標識NSCを用いて、虚血性損傷部位内または近傍の高密度で、死後1週間、1週間、4週間でげっ歯類の半球全体で達成された広範な分布を示す。長期生存に加えて、4週でGFP標識細胞の分化の証拠を示す。NSCに関してここで説明する動脈内送達アプローチは、治療化合物の投与にも使用することができ、したがって、複数の種にわたる様々なCNS傷害および疾患モデルに対する広範な適用性を有する。

GFP標識NSCは虚血性脳、主に半球、特に半影、および傷害縁に沿って容易に検出された(図6)。検査者は、イメージングおよび分析中に単盲であった。
例えば、注射後1dで、マウス海馬内でNSCが検出された。NSCのサブセットは、この初期時点においてもデンテート回における未熟なニューロンマーカーDCXの共発現を示した(図6A)。</...

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Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

神経幹細胞を送達する方法は、注射液または懸濁液に適応可能で、虚血性脳卒中後に一般的な頸動脈(マウス)または外頸動脈(ラット)を介して報告される。注入された細胞は脳のパレンチマ全体に広く分布し、送達後30dまで検出することができる。

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

脳卒中は、世界中の死亡率と障害の主な原因です。一部の患者では、血栓溶解や脳血管閉塞の外科的除去が可能であるが、脳卒中に対する効果的な治療法が依然として急務である。ここでは、脳卒中治療の潜在的なレジメンとして、虚血性半球への幹細胞のカテーテルベースの動脈内送達を実証する。まず、注射カテーテルと手術用フックの準備方法を紹介します。動脈内注射用の2種類の注射カテーテルを設計しました。設計1は、チューブのフラッシュを必要としない溶液または懸濁液の注入に使用される。設計2は、神経幹細胞の注入を可能にし、その後、全容を提供するために死んだボリュームのフラッシュが続きます。注射カテーテルのセットを構築するには、26ゲージと20ゲージ針、MRE 25カテーテルの10〜15センチメートルの長さ、MRE 50とMRE 10カテーテルの3センチメートルの長さが必要です。針の先端の両方を切り取り、サンドペーパーの金属端を磨いてチューブを開き直し、端を滑らかにし、蒸留水で洗い流してボアをきれいにし、破片を洗い流します。図は、針先を切り取った後の20ゲージ針のクローズエンドを示しており、研磨後に滑らかなボアで再開されます。顕微鏡下で、MRE 50管の端に20ゲージ針を挿入します。26ゲージ針を曲げ、20ゲージ針先の先端の下にチューブを貫通します。スーパー接着剤で26ゲージ針を固定します。次に、2つの針ハブとチューブとエポキシを埋め込み、強さを高めるために固体ブロックを構築します。また、外科部位のより良い露出のために、組織を位置に保持するために3つの外科用フックが必要になります。27ゲージの針から長さ1.5センチから2センチメートルの長い針シャフトを切り、紙の上で両端を鈍くなるまで磨きます。小さな止血クランプを使用して、シャフトを一方の端のフックに曲げ、もう一方の端にリング状を曲げてください。長さ10~15センチのMRE 25カテーテルをリングに挿入し、透明な外科テープで固定します。同じメソッドを使用して、さらに 2 つのフックを作成します。フックおよびカテーテルシステムは殺菌のために70パーセントエタノールに一晩浸すべきである。動物の被験者に関するすべての手順は、ケンタッキー大学の制度的動物管理および使用委員会によって承認されました。ENT胚マウス脳を使用してGFP、陽性神経幹細胞を培養します。GFP陽性胚は、蛍光顕微鏡上のFITCチャネルで容易に可視化することができる。野生型胚は同じ暴露を使用して蛍光を示さないが。野生型胚の自己蛍光は、暴露時間が100倍に増加した場合にのみ可視である。胚性皮質は、製造業者のプロトコルに従って神経幹細胞培養を確立するために収集され、使用される。これらの神経幹細胞は神経球を形成することができ、10世代以上の通過であり、グリアに分化することができる神経細胞である。ナノグ、SSEA1、Oct4およびSox3などの胚性幹細胞マーカーのパネルは、神経圏にいる間に幹細胞の特性を同定するために使用することができる。神経球は、製造業者のプロトコルに従ってメディアで培養され、神経幹細胞送達のための通路3と5の間で使用した。マウスとラットの両方について左半球で虚血性脳卒中を誘導し、フィラメントベースのフィラメントを用いて、中大脳動脈閉塞、MCAOを種に応じていくつかの修飾を行った。マウスでは、フィラメントは一般的な頸動脈、CCAを介して挿入され、ICAの内部頸動脈に進入する。ラットでは、フィラメントは、より大きな作業スペースのために、外的頸動脈を介して導入され、ECAはICAに導入される。ここでは、マウスの手術を示します。首に沿って正中線切開を行った後、鈍い解剖を使用して下層組織を分離する。より良い視野を達成するために27ゲージ針シャフトから作られた3つの微小外科フックを使用してください。黒い四角は、次のステップの手術領域を示します。左CCAの上の筋肉層は、左CCAと迷走神経を露出させるために慎重に開いています。CCAに従って分岐に到達し、識別します。このCCAまたは迷走神経を伸ばしたり、置き換えたり、圧迫したりしないように注意してください。CCAと迷走神経を覆う明確な結合組織を慎重に開きます。鉗子の先端をこのCCAの下のスペースを解放し、CCAの茎をできるだけ隔離して下さい。CCAの下に二本鎖6つのO編組ナイロン外科縫合糸を通す。中央点をカットして、CCAの根底にある縫合糸に任せます。CCAの下に別のナイロン縫合糸を置きます。上縫合糸にスリップノットを結び、緩く保ちます。2つの下縫合糸を分離します。スリップノットを中央縫合糸で結び、今のところ緩く保ちます。外科医の結び目を下縫合糸で結び、可能な限り近位端に移動します。縫合端の端をトリムダウンします。さらに分岐を超えてCCAを露出する。上の緩いスリップノットを分岐に押し込み、それを締めて血液の逆流を防ぎます。CCAの隣に70ナイロンMCAO縫合をコーティングしたシリコンゴムを置きます。マイクロハサミを使用して、CCAの小さな切開を下の結び目の隣に切ります。この切開を通して、MCAO縫合の先端をCCAに挿入し、上結び目に進めます。中央ノットの位置を調整し、MCAO縫合を保持できる位置まで締めます。結び目を過度に締めないでください。上のノットを解放しますが、同じ位置で別の緩いスリップ ノットを作成します。MCAO 縫合を ICA に進めます。MCAO 縫合糸が二股をICAに渡すのを確認します。縫合糸の経路は比較的まっすぐで、進行するにつれて組織に深く入り込むべきである。縫合線端のシルバーマーカーを確認します。分岐に達していることを確認します。MCAO 縫合線の方向をもう一度確認します。上と中央の結び目を調整して、血液漏れを防ぎます。さらに MCAO 縫合糸を進め、2 つの上の結び目を締めて MCAO 縫合糸を所定の位置に固定します。虚血の1時間の記録時間を開始します。1時間の虚血の後、動物を麻酔し、皮膚の傷を再開します。手術領域を露出する。上部と中央のスリップノットを見つけます。上の結び目を静かに解放します。白いシリコンゴム部分が中間結び目に達するまで、MCAO縫合をそっと引き抜きます。上結び目を締めて MCAO 縫合糸を所定の位置に保持し、出血を避けます。中のスリップノットをそっと解放します。MCAO縫合糸を引き出して、その端が上の結び目を通過します。上の結び目を締めます。CCAの切開のすぐ上に中央のスリップノットを置きます。中央のスリップノットを締めます。上の結び目を削除します。中央ノットの縫合端の端をトリムします。皮膚の傷を閉じ、動物が回復できるようにします。私たちの経験に基づいて、神経幹細胞は脳卒中の1〜3日後にこの動脈経路を通って安全に注入されました。繰り返しますが、神経幹細胞注射のためのマウスとラットの手術の間にわずかなバリエーションがあります。ここでは、マウスの手術を実証します。3日目の脳卒中では、動物を麻酔し、創傷を再開し、CCAを再び露出させる。CCAの下に二本鎖の外科縫合糸を置き、2つの縫合糸を得るために中点でそれを切る。2つの縫合線を適切に配置します。上縫合糸でスリップノットを作ります。分岐のすぐ下に配置します。上のスリップノットを締めます。中央縫合糸で別のスリップノットを作成します。脳卒中手術から残っているトリミングされた結び目のすぐ上に小さな切開をカットします。MRE 10カテーテルの先端を約45度の角度でトリムします。この鋭い端を使用して、CCAの切開部に入る。入り角とカテーテルの挿入に使用する力を適切に調整するように注意してください。さもなければ、カテーテルはCCAに入らないか、または穿刺するかもしれない。カテーテルを挿入し、先端が上の結び目に達するまで前進します。カテーテルを所定の位置に保持し、血液のリンケージがないことを確認するために、中のスリップノットを締めます。上の結び目を離します。上縫合糸でスリップノットを作ります。血液の速い逆流が見えるまでCCA内のカテーテルの角度と両方の結び目の位置を調整し、カテーテルとCCAの流れの間の通信が成功したことを示す。シリンジポンプを開始します。カテーテルの血液はCCAに戻されます。5分後に注射を終了します。上の結び目をリゲートします。真ん中の結び目を解放し、カテーテルを引き出します。真ん中の結び目をリゲートします。すべてのノットをトリムします。傷口を閉じ、動物が回復することを許可します。動脈内注射後、GFP標識神経幹細胞は、主に両側半球に見られる。ここでは、注射後1日に海馬歯状回の分布を示す。二側半球では、一部のGFP陽性神経幹細胞が皮質および線条体に局在し、未熟なニューロンのマーカーである二重皮質を発現する。これらは、注射後7日で神経幹細胞注射の有無にかかわらず、シャムおよび脳卒中動物からの代表的な画像である。出産後30日で、車両注射を受ける動物のFITCチャネルを介してわずかな自己蛍光のみを検出することができる。幹細胞が動物を注入している間、GFP標識された神経幹細胞は、gleoマーカーGFPまたは神経マーカートゥフアンのような様々な細胞マーカーの発現を伴う負傷した脳に見つけることができます。各画像の白い矢印は、それぞれGFPまたはトゥフアンマーカーを発現する神経幹細胞を示す。結論として、動脈内注射は脳卒中治療のための神経幹細胞の送達のための実行可能な方法である。神経幹細胞は、負傷した脳内の異なる細胞タイプに生き残り、分化することができます。そして最後に、ここで紹介した動脈内注射法は、溶液や懸濁液の送達にも使用できる。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat

ラット中大脳動脈の血管縫合閉塞による局所脳虚血モデル

Stroke is the leading cause of disability and the third leading cause of death in adults worldwide1. In human stroke, there exists a highly variable ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

非心室プラスミド注入し、エレクトロポレーションにより産後のラット脳への遺伝子デリバリー

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

大人の齧歯類の脳の従来の従来にない地域から神経幹細胞を増殖させる

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

神経幹細胞の細胞周期の進行を評価し、マウスでの前駆細胞は、遺伝毒性ストレス後の脳の開発

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

マウス梁下ゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

強膜網膜移植ひと網膜色素上皮細胞のラットの目の洗練されたプロトコルの開発

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

Simultaneous Evaluation of Cerebral Hemodynamics and Light Scattering Properties of the In Vivo Rat Brain Using Multispectral Diffuse Reflectance Imaging

脳血行動態との光散乱特性の同時評価<em&gt;インビボ</emマルチスペクトル拡散反射率イメージングの使用&gt;ラット脳

The simultaneous evaluation of cerebral hemodynamics and the light scattering properties of in vivo rat brain tissue is demonstrated using a conventional ...